斑馬魚組蛋白甲基轉移酶在巨噬細胞炎癥遷移中的作用研究*

賈小娥 朱 偉 樊 燕 謝 偉 姜樹原 石 蕊 劉曉蕾 許文強 張顏波 邵 國，3*

(1.包頭醫(yī)學院，內蒙古 包頭 014060； 2.泰山醫(yī)學院附屬醫(yī)院神經內科，山東 泰安 271000；3.首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院，北京 100053)

斑馬魚組蛋白甲基轉移酶在巨噬細胞炎癥遷移中的作用研究*

賈小娥1#朱 偉1#樊 燕1謝 偉1姜樹原1石 蕊1劉曉蕾1許文強1張顏波2，3*邵 國1，3*

(1.包頭醫(yī)學院，內蒙古 包頭 014060； 2.泰山醫(yī)學院附屬醫(yī)院神經內科，山東 泰安 271000；3.首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院，北京 100053)

目的 研究組蛋白甲基轉移酶是否參與了巨噬細胞炎癥遷移的過程。方法 利用斑馬魚尾巴創(chuàng)傷后巨噬細胞向炎癥部位遷移的模型，采用全胚胎原位雜交的方法檢測巨噬細胞遷移前后58個斑馬魚組蛋白甲基轉移酶的表達變化情況。結果 斑馬魚尾巴創(chuàng)傷后，巨噬細胞開始向炎癥部位遷移，并在尾巴切除后6 h聚集在尾部的巨噬細胞達到最多。原位雜交結果顯示在尾巴創(chuàng)傷后巨噬細胞遷移6 h后，有3個斑馬魚組蛋白甲基轉移酶的表達水平有變化。結論 斑馬魚組蛋白甲基轉移酶可能參與了巨噬細胞炎癥遷移的過程。

組蛋白甲基轉移酶；斑馬魚；巨噬細胞；炎癥遷移

組蛋白甲基化修飾是表觀遺傳修飾中重要的研究方向，參與了染色質的形成、基因組印記、基因轉錄調控等多種重要生理活動。組蛋白甲基化修飾主要由組蛋白甲基轉移酶(Histone methyltransferase, HMTs)負責，一般發(fā)生在組蛋白賴氨酸和精氨酸殘基上。眾多文獻和數據表明，組蛋白甲基化修飾和組蛋白甲基轉移酶的異常表達與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切關系，如PRMT6在結腸癌中扮演著原癌基因的作用[1]；SETD2和EZH2與慢性淋巴細胞白血病的發(fā)病有密切聯(lián)系并在慢性淋巴細胞白血病患者中有高表達[2-3]；G9a在多種癌癥中有高表達并與低預后相關[4]。而靶向組蛋白甲基轉移酶、改變異常的組蛋白甲基化狀態(tài)成為腫瘤治療的新靶點和策略[5-6]。巨噬細胞是多功能的免疫細胞，其中巨噬細胞向炎癥部位的遷移是機體執(zhí)行免疫功能的重要環(huán)節(jié)，該遷移機制的失調是許多炎性疾病、自身免疫性疾病以及腫瘤轉移等疾病的共同原因之一。已有研究揭示了巨噬細胞和炎癥的調控機制，通過影響炎性因子的生成和釋放激活炎癥復合體和巨噬細胞。而組蛋白甲基轉移酶是否參與了巨噬細胞炎癥遷移的過程，目前尚無研究報道。為此本研究使用斑馬魚作為模式生物，通過斑馬魚尾部創(chuàng)傷造成炎癥傷口，建立巨噬細胞向炎癥部位遷移的模型，研究斑馬魚組蛋白甲基轉移酶在巨噬細胞遷移前后是否有表達變化，探究組蛋白甲基轉移酶是否參與了巨噬細胞遷移調控。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 Tubigen系野生型斑馬魚和轉基因斑馬魚Tg(zlyz:EGFP)由包頭醫(yī)學院斑馬魚模式動物平臺保種并飼養(yǎng)，14 h光照/10 h黑暗交替循環(huán)，恒溫28. 5±0. 5 ℃，pH7.2 ～7.5。

1.1.2 質粒 斑馬魚58個組蛋白甲基轉移酶的探針質粒由Dr. Xu Pengfei惠贈。

1.1.3 主要試劑 Takara 限制性內切酶：EcoRI, SalI。試劑盒:質粒小提試劑盒，普通DNA產物純化試劑盒，T3 mMESSAGE mMACHINE Kit，T7 mMESSAGE mMACHINE Kit, NucAway Spin Columns(Ambion)純化試劑盒，RNA地高辛標記試劑盒(DIG RNA Labeling Kit，Roche)，顯色試劑盒BCIP/NBT Alkaline Phosphatase Substrate(Vector laboratories)。

1.2 方法

1.2.1 對斑馬魚胚胎尾巴進行切割造成損傷 斑馬魚胚胎和Tg(zlyz:EGFP)轉基因斑馬魚胚胎受精后60 h(60 hour post fertilization, 60 hpf)置于含0.1 mg/ml tricaine麻醉劑的培養(yǎng)液中，采用無菌手術刀片切割掉斑馬魚胚胎的尾巴，造成人為的急性創(chuàng)傷(不損及循環(huán))，收集切割0 h(0 hours-post-tail-transection, 6hptt)和6 h后(6 hours-post-tail-transection, 6hptt)的胚胎甲醛固定或熒光顯微鏡下觀測巨噬細胞的遷移。

1.2.2 地高辛標記的反義mRNA探針的制備 合成探針時，以限制性內切酶線性化的組蛋白甲基化轉移酶的質粒為模板，用SP6 RNA聚合酶體外轉錄得到反義探針。探針體外轉錄采用RNA地高辛標記試劑盒(DIG/ Fluorescein RNA Labeling Kit，Roche)，步驟參照試劑盒說明書。合成的探針用 NucAway Spin Columns(Ambion)進行純化，經2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，-80 ℃保存。

1.2.3 斑馬魚整體胚胎原位雜交 收集切割0 hptt和6 hptt的胚胎，4%甲醛4 ℃固定過夜，甲醇梯度脫水，置于-20 ℃100%甲醇溶液備用。甲醇梯度復水，蛋白酶K消化胚胎，用PBST洗去消化液后。68 ℃雜交爐中預雜交1 h，然后加入相應的組蛋白甲基轉移酶的反義RNA探針雜交過夜。雜交后第2 d回收探針并加入SSCT梯度清洗胚胎，加入anti-Dig-AP抗體與反義探針4 ℃結合過夜。雜交后第3 d用PBST洗去多余抗體，加入顯色試劑 BCIP/NBT Alkaline Phosphatase Substrate(Vector laboratories)溶液，避光室溫輕搖染色，觀測顯色情況。染色結束后，PBST洗凈染液，在體視顯微鏡下(Nikon SMZ18)觀察記錄結果后并拍照。

1.2.4 熒光顯微鏡拍攝巨噬細胞的遷移 將切尾巴0 hptt和6 hptt的斑馬魚胚胎放置于含0.1 mg/ml tricaine麻醉劑的胚胎培養(yǎng)液中，使用Nikon SMZ18熒光顯微鏡對胚胎巨噬細胞的遷移進行觀察和拍照。

2 實驗結果

2.1 切尾巴引起組織炎癥時巨噬細胞的遷移行為

當用刀片造成尾巴創(chuàng)傷后，引起組織炎癥反應，而巨噬細胞作為先天免疫細胞迅速地向傷口遷移。使用金屬蛋白酶mmp13特異性的標記單核巨噬細胞，如圖Fig 1A-D所示，在切尾巴0 hptt時，巨噬細胞主要集中在循環(huán)中，尾巴切口處很少有單核巨噬細胞；而在切尾巴6 hptt后，可見尾巴切口處聚集大量單核巨噬細胞。為了進一步說明巨噬細胞在炎癥發(fā)生時向傷口遷移，我們使用了轉基因斑馬魚Tg(zlyz:EGFP)，該轉基因系中巨噬細胞特異表達基因lyz的啟動子驅動綠色熒光蛋白的表達，因此綠色熒光蛋白能夠實時特異的標記巨噬細胞。如圖1所示，在切尾巴0 hptt時，綠色的巨噬細胞主要集中在循環(huán)中，尾巴切口處很少有單核巨噬細胞；而在切尾巴6 hptt后，可見尾巴切口處聚集大量綠色單核巨噬細胞。由上述實驗說明，巨噬細胞在尾巴創(chuàng)傷后后6 hptt向炎癥傷口處遷移。

圖1 尾巴創(chuàng)傷后炎癥時巨噬細胞的遷移行為

A. 尾巴創(chuàng)傷后0 hptt時金屬蛋白酶mmp13的原位雜交結果；B. 尾巴創(chuàng)傷后6 hptt時金屬蛋白酶mmp13的原位雜交結果；C. A圖的局部放大圖；D. B圖的局部放大圖；E. 尾巴創(chuàng)傷后0 hptt時轉基因系Tg(zlyz:EGFP)巨噬細胞的熒光圖片；F. 尾巴創(chuàng)傷后6 hptt時轉基因系Tg(zlyz:EGFP)巨噬細胞的熒光圖片

2.2 斑馬魚組蛋白甲基轉移酶在巨噬細胞遷移中的作用

我們使用原位雜交技術分別檢測了58個組蛋白甲基轉移酶在尾巴創(chuàng)傷后巨噬細胞遷移前(0 hptt)和巨噬細胞遷移后(6 hptt)的表達變化情況。如圖2～7所示，大部分組蛋白甲基轉移酶在巨噬細胞遷移前后(0 hptt和6 hptt)的表達水平沒有明顯變化。其中ehmt1a在中后腦邊界處有微弱的表達水平減弱；prdm8a在后腦處有表達上升；而prdm13在后腦處表達水平有減弱。

圖2 尾巴創(chuàng)傷后巨噬細胞0 hptt和6 hptt組蛋白甲基轉移酶家族I的表達變化

圖3 尾巴創(chuàng)傷后巨噬細胞0 hptt和6 hptt組蛋白甲基轉移酶家族II、III、IV的表達變化

圖4 尾巴創(chuàng)傷后巨噬細胞遷移前和遷移后組蛋白甲基轉移酶家族V的表達變化

圖5 尾巴創(chuàng)傷后巨噬細胞0 hptt和6 hptt組蛋白甲基轉移酶家族VI、VII、VIII的表達變化

圖6 尾巴創(chuàng)傷后巨噬細胞0 hptt和6 hptt組蛋白甲基轉移酶家族IX的表達變化

圖7 尾巴創(chuàng)傷后巨噬細胞0 hptt和6 hptt組蛋白甲基轉移酶家族X的表達變化

SubfamilyGenenameDescriptionGenBankAccessionNumberClosestHumanHomologIehmt2euchromatichistonelysineN-methyltransferase2DQ840136EHMT2Iehmt1beuchromatichistonemethyltransferase1bDQ355788,DQ840137EHMT1Iehmt1aeuchromatichistonemethyltransferase1aDQ840138EHMT1Isuv39h1bsuppressorofvariegation3-9homolog1b(Drosophila)DQ840139SUV39H1Isuv39h1asuppressorofvariegation3-9homolog1a(Drosophila)DQ840140SUV39H1Isetdb2SETdomain,bifurcated2DQ358104SETDB2Isetdb1bSETdomain,bifurcated1bDQ358103,DQ840141SETDB1Isetdb1aSETdomain,bifurcated1aDQ840142SETDB1IIsetmarSETdomainandmarinertransposasefusiongeneDQ840143SETMARIIIash1lash1(absent,small,orhomeotic)-like(Drosophila)DQ840144ASH1LIIIsetd2SETdomaincontaining2DQ343298,DQ840145SETD2IIInsd1bnuclearreceptorbindingSETdomainprotein1bDQ840146NSD1IIInsd1anuclearreceptorbindingSETdomainprotein1aDQ840147NSD1IIIwhsc1Wolf-Hirschhornsyndromecandidate1DQ358102,DQ840148WHSC1IIIwhsc1l1Wolf-Hirschhornsyndromecandidate1-like1DQ840149WHSC1L1IVezh2enhancerofzestehomolog2(Drosophila)DQ840150EZH2IVezh1enhancerofzestehomolog1(Drosophila)DQ840151EZH1Vmll2myeloid/lymphoidormixed-lineageleukemia2DQ840152MLL2Vmll3amyeloid/lymphoidormixed-lineageleukemia3aDQ840153MLL3Vmll3bmyeloid/lymphoidormixed-lineageleukemia3bDQ840154MLL3Vmll4bmyeloid/lymphoidormixed-lineageleukemia4bDQ840155MLL4Vmll4amyeloid/lymphoidormixed-lineageleukemia4aDQ840156MLL4Vmllmyeloid/lymphoidormixed-lineageleukemia(trithoraxhomolog,Drosophila)DQ355790,DQ355791,DQ840157MLLVsetd1aSETdomaincontaining1ADQ355789,DQ851808SETD1AVsetd1baSETdomaincontaining1BaDQ851809SETD1BVsetd1bbSETdomaincontaining1BbDQ851810SETD1BVIsetd8bSETdomaincontaining8bDQ851825SETD8VIsetd8aSETdomaincontaining8aDQ343297,DQ851826SETD8VIIsetd7SETdomaincontaining7DQ851811SETD7VIIIsetd5SETdomaincontaining5DQ851812SETD5VIIImll5myeloid/lymphoidormixed-lineageleukemia5(trithoraxhomolog,Drosophila)DQ851813MLL5IXsuv420h1suppressorofvariegation4-20homolog1(Drosophila)DQ851814SUV420H1IXsuv420h2suppressorofvariegation4-20homolog2(Drosophila)DQ851815SUV420H2IXsetd6SETdomaincontaining6DQ851816SETD6IXsmyd5SETandMYNDdomaincontaining5DQ851817SMYD5IXsmyd4SETandMYNDdomaincontaining4DQ851818SMYD4IXsmyd1bSETandMYNDdomaincontaining1bDQ851819SMYD1IXsmyd1aSETandMYNDdomaincontaining1aDQ851820SMYD1IXsmyd3SETandMYNDdomaincontaining3DQ851821SMYD3IXsmyd2bSETandMYNDdomaincontaining2bDQ851822SMYD2IXsmyd2aSETandMYNDdomaincontaining2aDQ851823SMYD2Xprdm16PRdomaincontaining16DQ851827PRDM16Xprdm3PRdomaincontaining3DQ851828PRDM3Xprdm5PRdomaincontaining5DQ851829,EU258933PRDM5Xprdm2PRdomaincontaining2DQ851830PRDM2Xprdm8bPRdomaincontaining8bDQ851833PRDM8Xprdm8aPRdomaincontaining8aDQ851834PRDM8Xprdm13PRdomaincontaining13DQ851835PRDM13Xprdm9PRdomaincontaining9DQ851831PRDM7,PRDM9Xprdm11PRdomaincontaining11DQ851832PRDM11Xprdm12PRdomaincontaining12DQ851836PRDM12Xprdm6PRdomaincontaining6DQ851837,EU258934PRDM6Xprdm14PRdomaincontaining14DQ851838PRDM14Xprdm1aPRdomaincontaining1aDQ851839PRDM1Xprdm1bPRdomaincontaining1bDQ851840PRDM1Xprdm1cPRdomaincontaining1cDQ851841,EU258932PRDM1Xprdm15PRdomaincontaining15DQ851842PRDM15Xprdm4PRdomaincontaining4DQ851843PRDM4

2.3 斑馬魚組蛋白甲基轉移酶

斑馬魚共有58個組蛋白甲基轉移酶(見表1)。斑馬魚組蛋白甲基轉移酶可分為10個亞家族，由于在脊椎動物中存在基因組的復制拷貝過程，在斑馬魚中有些組蛋白甲基轉移酶有兩個拷貝，如人類組蛋白甲基轉移酶EHMT1在斑馬魚中有兩個相應的同源基因ehmt1a和ehmt1b;人類組蛋白甲基轉移酶SUV39H1在斑馬魚中有兩個相應的同源基因suv39h1a和suv39h1b。

3 討 論

斑馬魚尾巴創(chuàng)傷后形成炎癥反應，巨噬細胞作為先天性免疫重要的免疫細胞，向炎癥部位大量遷移。如圖1所示，使用金屬蛋白酶mmp13標記巨噬細胞，在尾巴創(chuàng)傷后6 hptt時明顯可見巨噬細胞向炎癥傷口處遷移聚集；轉基因系Tg(zlyz:EGFP)標記巨噬細胞，在尾巴創(chuàng)傷后6 hptt時明顯可見綠色的巨噬細胞向炎癥傷口處遷移聚集，說明本研究中斑馬魚尾巴創(chuàng)傷后巨噬細胞遷移模型是可行的、可操作的。隨后我們利用斑馬魚尾巴創(chuàng)傷引起巨噬細胞遷移的模型，檢測了58個斑馬魚組蛋白甲基轉移酶基因在巨噬細胞遷移前后的表達變化。結果顯示有3個組蛋白甲基轉移酶基因(ehmt1a、prdm8a、prdm13)在巨噬細胞遷移前后有變化(見圖2～7所示)。這一結果也印證了近年來組蛋白甲基化修飾可能和炎癥免疫反應有關[7-10]，如組蛋白甲基轉移酶SMYD2通過抑制免疫因子的生成和釋放負向調節(jié)巨噬細胞的功能和活化[9]；EZH2通過組蛋白甲基轉移酶調節(jié)NK細胞的分化和功能[10]。然而我們僅找到3個表達水平有變化的組蛋白甲基轉移酶。目前研究顯示調節(jié)巨噬細胞遷移的機制多是快速的免疫因子釋放和JNK、AKT和ERK等磷酸化變化[11-12]。因此僅有3個表達水平變化的組蛋白甲基轉移酶，這一結果可能是由于巨噬細胞的遷移過程迅速，而組蛋白甲基轉移酶所調控的表觀遺傳學變化相對速度較慢、需要更長的時間，因而在我們的研究中沒有明顯的變化。而有微弱變化的三個組蛋白甲基轉移酶ehmt1a、prdm8a、prdm13，其如何變化以及調控網絡還需要后續(xù)實驗的進一步驗證和探討。

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The study of zebrafish histone methyltransferase functions in macrophages inflammatory migration

JIA Xiao-e1#ZHU Wei1#FAN-Yan1XIE Wei1JIANG Shu-yuan1SHI Rui1LIU Xiao-lei1XU Wen-qiang1ZHANG Yan-bo2，3*SHAO Guo1，3*

(1. Baotou Medical College, Baotou, Inner Mongolia Autonomous Region, 014060, China; 2. Department of Neurology，Affiliated Hospital of Taishan Medical College. Taian 271000,China; 3. Xuanwu Hospital, Capital Medical University, Beijing, 100053，China)

Objective:The aim of this study was to explore whether histone methyltransferases (HMTs) involve in the inflammatory process of macrophages migration.Methods: We detected the expression levels of the zebrafish 58 histone methyltransferases before or post macrophages migration by whole-mount in situ hybridization (WISH), using the model of macrophages migration in response to the tail wound.Results: We show that macrophages migrate rapidly to the site of acute injury induced by tail transection, and at 6 hours-post-tail-transection (6 hptt) the number of macrophages that aggregate in the wound reaches a maximum.The expression level of three histone methyltransferases had changed slightly at 6 hours-post-tail-transection.Conclusion: Some histone methyltransferases may play an essential role in macrophages migration in response to inflammation injury in zebrafish.

histone methyltransferases (HMTs); zebrafish; macrophages; migration

國家自然科學基金項目(81060212,81160244,81360316,81460283,81550038，81660307，81660204)；內蒙古自然科學基金(2014MS0810，2015BS0801，2015BS0807，2016MS (LH)0307)；包頭醫(yī)學院博士科研啟動基金(BSJJ201632，BSJJ201623，BSJJ201617)；內蒙古自治區(qū)高等學?？茖W技術研究項目(NJZY16207)；泰山醫(yī)學院高層次培育課題(2016GCC02)

賈小娥(1984—)，女，內蒙古包頭市人，講師，博士，主要研究方向發(fā)育生物學。

朱偉(1984—)，男，山東萊蕪人，碩士，包頭醫(yī)學院藥學院，主要研究方向神經生物學。

R392

A

1004-7115(2017)02-126-05

10.3969/j.issn.1004-7115.2017.02.002

2016-11-12)

# 并列第一作者；*通訊作者