出口普洱茶中大腸菌群的污染狀況和潛在致病菌分析

陳 蕓 楊玲春 陳麗萍 殷 紅 朱紅玉 范 焱 王裔耿 李云飛 王文珍

(云南出入境檢驗(yàn)檢疫局，昆明 650228)

出口普洱茶中大腸菌群的污染狀況和潛在致病菌分析

陳 蕓 楊玲春 陳麗萍 殷 紅 朱紅玉 范 焱 王裔耿 李云飛 王文珍

(云南出入境檢驗(yàn)檢疫局，昆明 650228)

本文擬分析云南口岸出口普洱茶中大腸菌群的污染狀況，對檢測過程中發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌進(jìn)行種屬分布和致病性探討，揭示導(dǎo)致出口普洱茶大腸菌群超標(biāo)的微生物污染因子和出口普洱茶腸道致病菌的污染風(fēng)險(xiǎn)，為普洱茶的出口監(jiān)管和生產(chǎn)過程控制提供一定的數(shù)據(jù)支持。根據(jù)國標(biāo)方法進(jìn)行出口普洱茶樣品的大腸菌群檢測，并使用全自動(dòng)微生物質(zhì)譜鑒定儀、生化鑒定儀和生化鑒定試劑條對分離出的革蘭氏陰性細(xì)菌進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示，2015～2016年間共檢測76份出口普洱茶樣品，大腸菌群超標(biāo)率為15.8%。出口普洱茶中大腸菌群的主要污染微生物為腸桿菌屬和克雷伯菌屬，導(dǎo)致大腸菌群指標(biāo)超標(biāo)的主要微生物為陰溝腸桿菌。檢測過程中共分離出8個(gè)種屬的細(xì)菌，其中包括綠膿桿菌等革蘭氏陰性致病菌，說明出口普洱茶有潛在腸道致病菌污染的風(fēng)險(xiǎn)。

出口；普洱茶；大腸菌群；潛在；致病菌

云南是中國茶葉大省，每年有大量茶葉經(jīng)由云南口岸出口至東南亞和歐洲。云南出口茶葉普洱茶是地理性標(biāo)志產(chǎn)品，普洱茶是以大葉種曬靑毛茶為原料，經(jīng)自燃發(fā)酵陳化或人工渥堆后發(fā)酵而制成的再加工茶類[1]?！颁锥选笔且粋€(gè)多種微生物參與的固態(tài)發(fā)酵過程，是在濕熱環(huán)境中，以曬青茶的內(nèi)含化學(xué)成分作為基質(zhì)，在微生物分泌的胞外酶作用下，發(fā)生的一系列生物轉(zhuǎn)化過程[2]。普洱茶特殊的生產(chǎn)加工方式導(dǎo)致其所攜帶的微生物本底含量非常豐富，有些微生物對普洱茶色香味的形成有關(guān)鍵作用，而有些微生物則可能是生產(chǎn)加工流通過程中的污染菌。目前普洱茶檢驗(yàn)的主要依據(jù)有 GB/T22111-2008《地理標(biāo)志產(chǎn)品 普洱茶》,其中微生物檢測指標(biāo)中要求大腸菌群≤300 MPN/100 g。但是近年來出口普洱茶檢測經(jīng)常發(fā)現(xiàn)樣品含有大腸菌群，其檢出率和超標(biāo)率都比較突出。

本文通過微生物質(zhì)譜鑒定儀(MALDI-TOF)、自動(dòng)生化鑒定儀和手工生化鑒定試劑，對出口普洱茶中大腸菌群的細(xì)菌進(jìn)行了鑒定?；诘鞍踪|(zhì)組學(xué)的微生物質(zhì)譜檢測技術(shù)具有高靈敏度、高通量和快速的特點(diǎn)[3]，結(jié)合全自動(dòng)生化鑒定儀和手工生化試驗(yàn)進(jìn)行細(xì)菌鑒定，更增加了細(xì)菌鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確度和可靠性。通過對分離鑒定情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，本文給出了導(dǎo)致出口普洱茶大腸菌群超標(biāo)的污染細(xì)菌名單，并對檢測過程中出現(xiàn)的革蘭氏陰性細(xì)菌鑒定結(jié)果進(jìn)行討論。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

出口普洱茶樣品和出口企業(yè)委托報(bào)檢樣品，包括普洱茶生茶和熟茶，散茶與緊壓茶。

生化試劑：乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基、伊紅美蘭瓊脂培養(yǎng)基(EMB)、乳糖復(fù)發(fā)酵培養(yǎng)基、結(jié)晶紫中心紅膽鹽瓊脂(VRBA)、胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)、月桂基硫酸鹽胰蛋白胨(LST)、煌綠乳糖膽鹽肉湯(BGLB)、血瓊脂平板：廣東環(huán)凱生物科技有限公司；API20E、GN 鑒定卡、CHCA、靶板：梅里埃診斷產(chǎn)品(上海)有限公司。

1.2 設(shè)備

生物顯微鏡：奧林巴斯(中 國)有限公司(OCN)；生化培養(yǎng)箱：東京理化；自動(dòng)壓力蒸汽滅菌器：雅瑪拓，VITEK 2 compact 60 全自動(dòng)微生物鑒定儀、VITEK MS 全自動(dòng)快速微生物質(zhì)譜檢測系統(tǒng)：梅里埃診斷產(chǎn)品(上海)有限公司。

1.3 檢驗(yàn)方法

按照 GB/T4789.3-2003《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群測定》、GB4789.3-2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù)》的檢測方法進(jìn)行檢驗(yàn)。對結(jié)果超標(biāo)的樣品大腸菌群細(xì)菌使用 VRBA 進(jìn)行劃線分純培養(yǎng)，挑選形態(tài)各異、數(shù)量具有代表性的菌株使用 API20E、VITEK 2 compact 鑒定系統(tǒng)和 VITEK MS 質(zhì)譜鑒定儀進(jìn)行細(xì)菌鑒定。

1.4 判定標(biāo)準(zhǔn)

依據(jù) GB/T 22111-2008《地理標(biāo)志產(chǎn)品 普洱茶》中大腸菌群的指標(biāo)要求對樣品進(jìn)行符合性判斷，檢測結(jié)果≤300 MPN/100 g的樣品視為大腸菌群合格，結(jié)果>300 MPN/100 g的樣品視為大腸菌群不合格。

2 結(jié)果與分析

2.1 大腸菌群檢測

對2015年和2016年云南出口的76份普洱茶樣品進(jìn)行大腸菌群測定，結(jié)果有48份樣品未檢出大腸菌群，另28份樣品大腸菌群檢出，其中12份大腸菌群數(shù)量呈超標(biāo)狀態(tài)，見表1。

表1 2015-2016年云南省出口普洱茶大腸菌群檢測結(jié)果

結(jié)果顯示，2015年云南口岸出口的普洱茶大腸菌群指標(biāo)不合格率為19.0%,2016 年大腸菌群不合格率為11.8%，相比前一年大腸菌群的檢出陽性率和不合格情況有改善趨勢。

2.2 細(xì)菌的分類鑒定

從不合格的樣品大腸菌群發(fā)酵菌液中分離革蘭氏陰性細(xì)菌，在 VRBA 和 EMB 平板上進(jìn)行分離劃線和分純培養(yǎng)，共獲得190個(gè)菌株。這些菌株使用 VITEK 2 compact 全自動(dòng)微生物鑒定儀、 VITEK MS 全自動(dòng)快速微生物質(zhì)譜鑒定儀和 API20E 手工進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)分為大腸菌群和非大腸菌群兩類細(xì)菌。

檢測到的大腸菌群細(xì)菌主要包括腸桿菌屬、埃希氏菌屬、檸檬酸桿菌屬、克雷伯菌屬和沙雷菌屬。其他非大腸菌群的革蘭氏陰性桿菌，經(jīng)鑒定為勒克氏菌屬、泛菌屬和假單胞菌屬。鑒定結(jié)果見表2、表3。

由表2、表3可知，腸桿菌屬、埃希氏菌屬、檸檬酸桿菌屬、克雷伯氏菌屬和沙雷菌屬皆屬于腸桿菌科細(xì)菌，出口普洱茶中的大腸菌群以此5個(gè)屬細(xì)菌數(shù)量最為龐大，共130 株，構(gòu)成了出口普洱茶中大腸菌群細(xì)菌類群。其中大腸菌群陽性樣本中最常分離到的細(xì)菌是陰溝腸桿菌，檢出率達(dá)到64.3%。除大腸菌群以外，還檢出60株非大腸菌群的革蘭氏陰性細(xì)菌，這些細(xì)菌和大腸菌群細(xì)菌一起構(gòu)成了出口普洱茶中革蘭氏陰性細(xì)菌的主要類別。

表2 出口普洱茶中大腸菌群細(xì)菌的鑒定結(jié)果

表3 出口普洱茶大腸菌群檢測中發(fā)現(xiàn)的非大腸菌群類細(xì)菌的鑒定結(jié)果

3 討 論

云南茶產(chǎn)業(yè)在全國茶產(chǎn)業(yè)中位列種植面積第二、產(chǎn)量第二、綜合產(chǎn)值第四的位置。云南省共有出口茶葉備案基地133塊，占全省茶葉種植面積的 8%。2013至2015年云南省出口茶葉貿(mào)易量為1900多批次，貿(mào)易金額達(dá)到2億多美元，其中普洱茶出口量占全省成品茶出口量的三分之一，為特色優(yōu)勢出口農(nóng)產(chǎn)品之一，在國外久負(fù)盛譽(yù)。普洱茶的出口目的地主要是中國臺(tái)灣、歐盟、日本、馬來西亞、新加坡和韓國。隨著國際貿(mào)易技術(shù)壁壘的升級(jí)，普洱茶主要進(jìn)口地區(qū)和國家對普洱茶的農(nóng)藥殘留、微生物含量高的問題愈來愈關(guān)注，因此對普洱茶出口檢驗(yàn)檢疫的要求也水漲船高。大腸菌群污染是食品衛(wèi)生與安全的重要影響因素，食品中大腸菌群值的高低，代表了食品被糞便污染的程度，也反映對人體健康危害性的大小，是評價(jià)食品衛(wèi)生質(zhì)量的重要衛(wèi)生指標(biāo)菌[4-6]，因此檢測出口普洱茶中大腸菌群的污染狀況對了解出口普洱茶生產(chǎn)過程微生物控制及普洱茶腸道致病菌風(fēng)險(xiǎn)有著代表性的意義。

經(jīng)檢驗(yàn)鑒定發(fā)現(xiàn)腸桿菌科腸桿菌屬細(xì)菌是出口普洱茶大腸菌群中的優(yōu)勢菌，共分離出85株，占大腸菌群細(xì)菌總數(shù)的65.4%，為出口普洱茶大腸菌群的主要菌屬。該屬中陰溝腸桿菌共有78株，在大腸菌群陽性樣本中檢出率達(dá)到64.3%，可見陰溝腸桿菌是出口普洱茶大腸菌群污染的主要微生物，也是出口普洱茶微生物指標(biāo)合格判定中不合格率高的主要微生物風(fēng)險(xiǎn)因子。陰溝腸桿菌是人和動(dòng)物的腸道正常棲息菌，在自然環(huán)境中也有大量的存在，其致病性目前所知尚不全面，報(bào)告多為醫(yī)院住院感染，產(chǎn)生腸毒素LT或 ST 的菌株可以引起急性腹瀉[7]。普洱茶參與發(fā)酵過程的主要細(xì)菌為乳桿菌、芽孢桿菌和放線菌[8]，說明出口普洱茶中檢出的陰溝腸桿菌為外界污染所致。鑒于普洱茶生產(chǎn)包裝所使用的食品接觸材料是符合國家安全標(biāo)準(zhǔn)的合格產(chǎn)品，因此推測陰溝腸桿菌的主要污染來源是生產(chǎn)加工和流通過程中環(huán)境、設(shè)備和人員等因素。

出口普洱茶大腸菌群檢測中發(fā)現(xiàn)的革蘭陰性細(xì)菌中除大量的陰溝腸桿菌外還不乏對人體存在致病力的潛在致病菌，其中部分細(xì)菌可以攜帶強(qiáng)的致病能力。銅綠假單胞菌是常見的致病菌，為院內(nèi)感染的主要病原菌之一，能夠感染導(dǎo)致膿腫和敗血癥等[9]。傷口埃希氏菌、弗氏檸檬酸桿菌、肺炎克雷伯菌、臭味沙雷(氏)菌、泛菌屬、非脫羧勒克氏菌、淺黃假單胞菌(又名淺黃金黃單胞菌)和惡臭假單胞菌均為條件致病菌，食用被其污染的食品能夠?qū)е赂篂a和嘔吐等食物中毒癥狀，近年來都曾有對人類致病的報(bào)道[10-16]。沸水作用 1-2 分鐘后，茶水中大腸菌群和可疑致病菌會(huì)被殺死[17]，普洱茶在飲用過程中注意泡茶水的溫度及沖泡的程序，舍棄第一泡茶湯，飲用第二泡和其后的茶湯[18],才是普洱茶安全的飲用方式。同時(shí)普洱茶在生產(chǎn)加工和流通過程中都應(yīng)該建立良好的衛(wèi)生控制和質(zhì)量管理體系，才能降低潛在致病菌的污染風(fēng)險(xiǎn)，從而提高普洱茶的質(zhì)量安全性，增強(qiáng)普洱茶的食品安全認(rèn)可度，也是提高普洱茶出口貿(mào)易和普洱茶生產(chǎn)企業(yè)國際市場競爭力的重要手段。

1 龔加順,周紅杰.云南普洱茶化學(xué).云南科技出版社,2011.

2 路偉堯.普洱茶發(fā)酵中微生物及酶系研究進(jìn)展.云南植物研究,2008,30(6):718-724.

3 康琳.質(zhì)譜技術(shù)在微生物檢測和鑒定中的應(yīng)用.中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志, 2010(10):2613-2615.

4 劉秀梅,盧行安.AOAC 991.14 PetrifilmTM大腸菌群測試片法與GB4789.3大腸菌群計(jì)數(shù)法的比較研究.中國食品學(xué)報(bào),2010,10(6):167-172.

5 Samuel Choi，Weiping Chu，Sunny C Jiang. Application of enterococci antibiotic resistance patterns for contamination source identification at Huntington Beach. California. Marine Pollution Bulletin，2003，46 (1)： 748-755.

6 白鳳翎.國家食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)大腸菌群檢驗(yàn)方法探究.食品工業(yè)科技, 2005, 26(11):179-181.

8 許波.普洱茶發(fā)酵過程中微生物及其應(yīng)用研究進(jìn)展.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010, 38(1):334-336.

9 楊君洋.銅綠假單胞菌的致病性及耐藥性研究近況.內(nèi)科理論與實(shí)踐,2016,2:125-128.

10 薛巧.弗氏檸檬酸桿菌桿菌對動(dòng)物和人致病性研究進(jìn)展.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2015，36(7):81-85.

11 王麗鳳.高毒力肺炎克雷伯菌屬的致病機(jī)制研究進(jìn)展.中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志,2016,36(6):468-471.

12 丁紅輝.從一起食物中毒中檢出傷口埃希氏菌.現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生,2006,22(14):2245-2246.

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17 王文光.普洱茶中微生物安全性的評價(jià).普洱,2012,05:86:89.

18 趙振軍.普洱茶沖泡過程中細(xì)菌的安全性分析.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2014(5):1032-1035.

Analysis on pollution status and potential pathogens of coliform bacteria in exporting Pu′er tea

CHEN yun, YANG Lingchun, CHEN Liping, YIN Hong, ZHU Hongyu, FAN Yan, WANG Yigeng, Li Yunfei, WANG Wenzhen

(Yunnan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Kunming，650228，China)

The present paper aimsing at Analyzing the pollution status of coliform bacteria in exporting Pu′er teas and revealing the major factors leading to coliform contamination and discussing the risk of intestinal pathogens in exporting Pu′er teas. Enumeration of coliforms in Pu′er tea samples was detected by method recommended by the national standard GB4789.3-2010. The results showed that coliform enumeration in 12 of the 76 tested samples in 2015-2016 were above the maximum limit level. 8 species of bacteria were isolated from the tested samples andEnterobacterandKlebsiellawere major contaminated microorganism.

Export；Pu′er tea；Coliform bacteria；Potential；Pathogens

2016-12-29

國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局科技計(jì)劃項(xiàng)目“出口普洱茶中微生物風(fēng)險(xiǎn)因子分析”(2015IK289)。

陳蕓，女，云南昆明人，理學(xué)學(xué)士，工程師，主要從事食品中微生物的檢驗(yàn)工作。

TS272.5+4；Q939

A

0577-8921(2017)01-024-04

陳恩臨.一株陰溝腸桿菌致病性的調(diào)查研究.

10.13344/j.microbiol.china.1983.03.010.