消痰和胃方對胃癌前病變大鼠細(xì)胞凋亡的影響

張璇，徐晶鈺，孫大志，秦志豐，李勇進(jìn)，施俊，唐繼貴，張映城，魏品康

第二軍醫(yī)大學(xué)長征醫(yī)院中醫(yī)科，上海 200003

消痰和胃方對胃癌前病變大鼠細(xì)胞凋亡的影響

張璇，徐晶鈺，孫大志，秦志豐，李勇進(jìn)，施俊，唐繼貴，張映城，魏品康

第二軍醫(yī)大學(xué)長征醫(yī)院中醫(yī)科，上海 200003

目的 觀察消痰和胃方對胃癌前病變大鼠胃黏膜細(xì)胞Caspase-3表達(dá)及凋亡指數(shù)的影響，探討該方干預(yù)胃癌前病變的機(jī)制。方法采用化學(xué)干預(yù)為主的多因素造模法制作胃癌前病變大鼠模型。實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、維酶素組、消痰和胃方組，各組給予相應(yīng)藥物灌胃。干預(yù)6周后，免疫組化檢測大鼠胃黏膜細(xì)胞Caspase-3的表達(dá)，TUNEL法檢測大鼠胃黏膜細(xì)胞凋亡指數(shù)。結(jié)果與正常組比較，模型組胃黏膜細(xì)胞Caspase-3水平和凋亡指數(shù)明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，消痰和胃組和維酶素組胃黏膜細(xì)胞Caspase-3水平和凋亡指數(shù)明顯升高（P＜0.05），且消痰和胃組明顯優(yōu)于維酶素組（P＜0.05）。結(jié)論消痰和胃方可能通過上調(diào)Caspase-3的表達(dá)促進(jìn)胃癌前病變細(xì)胞凋亡，從而達(dá)到防治胃癌前病變的作用。

胃癌前病變；消痰和胃方；凋亡指數(shù)；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3；大鼠

胃癌是常見的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅人類的生存，其發(fā)病率及死亡率較高。胃癌前病變（precancerous lesions of gastric carcinoma，PLGC）的防治是胃癌二級預(yù)防的重要內(nèi)容[1]。逆轉(zhuǎn)PLGC成為了胃癌防治的有效措施之一。目前西醫(yī)治療PLGC的特殊藥物及手段并不完善，而中醫(yī)藥的優(yōu)勢則較為明顯，不僅能改善患者的臨床癥狀，還可逆轉(zhuǎn) PLGC[2]。因此，中醫(yī)藥防治PLGC已逐漸受到業(yè)界的重視，其中胃黏膜細(xì)胞凋亡紊亂在PLGC的發(fā)生發(fā)展中扮演了重要角色。消痰和胃方是我院臨床經(jīng)驗(yàn)方。本研究觀察消痰和胃方對PLGC大鼠胃黏膜細(xì)胞Caspase-3水平及凋亡指數(shù)的影響，初步探討其作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動物

清潔級Wistar雄性大鼠，6周齡，中國科學(xué)院上海試驗(yàn)動物中心，動物許可證號 SCXK（滬）2012-0002。飼養(yǎng)于第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院清潔級開放式動物房。

1.2 藥物

消痰和胃方，方中飲片均購自上海雷允上中藥飲片公司，第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院制劑室水提醇沉制成浸膏；維酶素片，新鄉(xiāng)恒久遠(yuǎn)藥業(yè)有限公司，批號20120102；N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍（MNNG），日本東京化成工業(yè)株式會社。

1.3 主要試劑與儀器

水合氯醛、伊紅染液、10%中性福爾馬林固定液、梯度乙醇及二甲苯，第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院；鼠抗人Caspase-3單克隆抗體，英國 Abcam公司；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司。電子秤，寺岡電子有限公司；石蠟切片機(jī)，德國Leica公司；光學(xué)顯微鏡，日本Olympus公司；高溫烘烤箱，德國Heraens 公司；高速冷凍離心機(jī)，德國Kendro實(shí)驗(yàn)儀器公司；低溫冰箱，海爾公司；紫外分光光度計，上海譜元儀器有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模

參照文獻(xiàn)[3]方法并加以改進(jìn)。300 μg/mL MNNG溶液灌胃，同時予無水乙醇灌胃，3 d灌胃1次，進(jìn)食2 d后禁食1 d。夾尾時間為每周三9∶00，保持大鼠爭奪激怒狀態(tài)10 min，連續(xù)32周。胃黏膜組織病理學(xué)改變判斷標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[4]。

2.2 分組和給藥

成模大鼠隨機(jī)分為模型組、維酶素組、消痰和胃組，分別為11、13、14只。另取14只大鼠作為正常組。根據(jù)人和動物體表面積折算等效劑量比值簡表進(jìn)行人口服中藥劑量與鼠灌胃中藥劑量換算，得出各組大鼠所需灌胃劑量。正常組和模型組給予生理鹽水灌胃，維酶素組給予維酶素懸濁液灌胃，消痰和胃組給予消痰和胃方浸膏灌胃。給藥體積均為1 mL/100g體質(zhì)量，每日1次，連續(xù)6周。

2.3 標(biāo)本收集

6周后，所有大鼠禁食不禁水24 h，水合氯醛腹腔注射麻醉，劍突下沿腹中線剪開，將胃部與周圍組織分離，沿胃大彎縱向切開，去除胃內(nèi)容物，取胃大彎處胃黏膜組織，福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，切片。

2.4 免疫組化檢測Caspase-3表達(dá)

將石蠟切片置于 60 ℃烤箱烘干過夜；3%H2O2室溫孵育，將內(nèi)源性過氧化物酶滅活；微波修復(fù)抗原；加入稀釋的抗Caspase-3抗體及生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育，PBS反復(fù)沖洗；加入用辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素，室溫孵育；DAB顯色；蘇木素襯染，0.1%鹽酸酒精分化，自來水反復(fù)沖洗至返回藍(lán)色；常規(guī)脫水，透明，中性樹膠封片。免疫組化積分標(biāo)準(zhǔn)：按陽性細(xì)胞所占百分比計 0分（＜5%）、1分（5%～25%）、2分（26%～50%）、3分（51%～75%）、4分（＞75%），再按染色強(qiáng)度計0分（無色）、1分（淡黃色）、2分（棕黃色）、3分（棕褐色），二者相乘為積分結(jié)果。記錄各組分值并統(tǒng)計陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)，計算積分均數(shù)。

2.5 TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡

采用 TUNEL法檢測常規(guī)處理的胃標(biāo)本石蠟切片，實(shí)驗(yàn)步驟按照試劑盒說明嚴(yán)格執(zhí)行。凋亡細(xì)胞的判斷標(biāo)準(zhǔn)為細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒，5個高倍鏡下細(xì)胞個數(shù)均＞1000，統(tǒng)計凋亡細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)。計算凋亡指數(shù)（AI）。AI（%）＝凋亡細(xì)胞數(shù)÷總細(xì)胞數(shù)×100%。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。計量資料以—x±s表示，多組間比較采用方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)，等級資料多組間比較用非參數(shù)秩和K-W檢驗(yàn)，分組比較采用WILCOXON秩和檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 消痰和胃方對模型大鼠胃黏膜細(xì)胞 Caspase-3蛋白表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組Caspase-3水平明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，消痰和胃組和維酶素組Caspase-3水平明顯升高（P＜0.05），且消痰和胃組優(yōu)于維酶素組（P＜0.05）。結(jié)果見表1、圖1。

4.2 消痰和胃方對模型大鼠胃黏膜細(xì)胞凋亡指數(shù)的影響

與正常組比較，模型組AI值明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，消痰和胃組和維酶素組AI值明顯升高（P＜0.05），且消痰和胃組優(yōu)于維酶素組（P＜0.05）。結(jié)果見表2、圖2。

表1 各組大鼠胃黏膜細(xì)胞Caspase-3蛋白表達(dá)比較（—x±s）

圖1 各組大鼠胃黏膜細(xì)胞Caspase-3蛋白表達(dá)（免疫組化染色，×400）

表2 各組大鼠胃黏膜細(xì)胞凋亡指數(shù)比較（%）

表2 各組大鼠胃黏膜細(xì)胞凋亡指數(shù)比較（%）

注：與正常組比較，#P＜0.05；與模型組比較，★P＜0.05；與維酶素組比較，*P＜0.05

組別 只數(shù) AI正常組 14 23.66±5.37模型組 11 6.88±2.38#維酶素組 13 15.72±3.67★消痰和胃組 14 21.82±4.84★*

圖2 各組大鼠胃黏膜細(xì)胞凋亡形態(tài)（TUNEL染色，×400）

5 討論

PLGC是指一類胃黏膜的病理學(xué)改變，與胃癌密切相關(guān)。同時也是胃黏膜在多種致癌誘因作用下向胃癌演變過程中的一個重要階段。此階段的標(biāo)志通常是胃黏膜細(xì)胞出現(xiàn)異型增生，成為胃癌發(fā)生的重要組織病理學(xué)基礎(chǔ)[5]。

凋亡作為細(xì)胞程序性死亡的重要方式，其介導(dǎo)和執(zhí)行作用是通過Caspase家族實(shí)現(xiàn)的。目前研究顯示，Caspase-3作為家族中最重要的凋亡執(zhí)行者，是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵酶，它在眾多凋亡信號傳導(dǎo)途徑中起著重要作用[6]。Caspase-3同時也是多種凋亡信號匯集的終點(diǎn)，它的活化表明凋亡不可逆轉(zhuǎn)[7]。

我院魏品康教授提出“痰”是PLGC的核心病機(jī)思想[8]。宏觀上痰濕內(nèi)壅，困阻中焦脾胃，出現(xiàn)飽脹納差、嘔惡疼痛等癥狀，病程纏綿、反復(fù)難愈；微觀上各種致病因素導(dǎo)致的病理產(chǎn)物可歸于中醫(yī)痰濁范疇，痰濁浸淫胃黏膜細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞惡變，逐漸成為胃癌細(xì)胞[9]。因此，阻斷PLGC的進(jìn)程，可以預(yù)防胃癌的發(fā)生，這也是中醫(yī)“治未病”思想的具體體現(xiàn)。

消痰和胃方由柴胡、制半夏、茯苓、黃連、白花蛇舌草、蒲公英、桂枝、制大黃、白芍、炙甘草等組成[10]。方中柴胡、制半夏相伍，共為君藥，苦辛溫燥,痰氣并治；臣以茯苓、黃連、白花蛇舌草、蒲公英，健脾祛濕、清熱解毒；桂枝溫通經(jīng)脈，制大黃通閉逐瘀，共為佐藥；炙甘草與白芍酸柔甘守，化生胃陰為使。

本實(shí)驗(yàn)采用以化學(xué)損傷為主的多因素方法建立PLGC大鼠模型，結(jié)果表明消痰和胃方可提高PLGC大鼠胃黏膜細(xì)胞Caspase-3表達(dá)和凋亡指數(shù)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，恢復(fù)增殖與凋亡的動態(tài)平衡，起到逆轉(zhuǎn)PLGC胃黏膜病理狀態(tài)，防止向胃癌的進(jìn)一步演變的作用。

[1] GAO Q Y, WANG Z H, CHOOI E Y, et al. A novel model might predict the risk of chronic atrophic gastritis：Amulticenter prospective study in China[J]. Scand J Gastroenterol,2012,47(5)：509-517.

[2] 黃銘涵,黃健,李思漢.復(fù)方胃炎合劑逆轉(zhuǎn)胃癌前病變的臨床研究[J].中國中醫(yī)藥信息雜志,2016,23(4)：20-23.

[3] 袁紅霞,劉彩梅,劉清君,等.胃癌前病變大鼠模型構(gòu)建方法的探討[J].中國當(dāng)代醫(yī)藥,2009,16(19）：6-9.

[4] 蕭樹東,房靜遠(yuǎn).解讀和評述：中國慢性胃炎共識意見[J].胃腸病學(xué), 2007,12(9)：513-515.

[5] VANNELLA L, LAHNER E, ANNIBALE B. Risk for gastric neoplasia in patients with chronic atrophic gastritis： a critical reappraisal[J]. World J Gastroenterol,2012,18(12)：1279-1285.

[6] 董雅潔,高維娟.bcl-2、bax、caspase-3在細(xì)胞凋亡中的作用及其關(guān)系[J].中國老年學(xué)雜志,2012,32(21)：4828-4830.

[7] 楊莉暉,單春光,許秋榮,等.Smac、XIAP、Caspase-3與腫瘤發(fā)生的關(guān)系及研究進(jìn)展[J].河北醫(yī)藥,2014,36(4)：583-586.

[8] 裴蓓,徐晶鈺,張璇.“治未病”與“從痰論治”胃癌前病變[J].實(shí)用中醫(yī)內(nèi)科雜志,2013,27(8)：4-5.

[9] 修麗娟,魏品康,秦志豐,等.胃癌復(fù)發(fā)從痰論治理論探析[J].中國中西醫(yī)結(jié)合消化雜志,2012,20(11)：512-514.

[10] 張璇,徐晶鈺,秦志豐,等.從痰論治胃癌前病變臨證思路[J].中國中醫(yī)藥信息雜志,2014,21(3)：99-100.

Effects of Xiaotan Hewei Formula on Cell Apoptosis of Precancerous Lesions of Gastric Carcinoma Rats

ZHANG Xuan, XU Jing-yu, SUN Da-zhi, QIN Zhi-feng, LI Yong-jin, SHI Jun, TANG Ji-gui, ZHANG Ying-cheng, WEI Pin-kang (Department of Traditional Chinese Medicine, Changzheng Hospital Affiliated to Second Military Medical University, Shanghai 200003, China)

ObjectiveTo investigate the effects of Xiaotan Hewei Formula on the Caspase-3 expression and apoptosis index of precancerous lesions of gastric (PLGC) rats; To explore potential mechanism of intervention on PLGC.MethodsThe rat model of gastric precancerous lesion was made by multi-factor modeling with chemical intervention primarily. The rats were randomly divided into normal group, model group, Vimentin group, Xiaotan Hewei Formula group. Each administration group was given the corresponding medicine for gavage. After 6 weeks of intervention, the expression of Caspase-3 in gastric mucosa was detected by immunohistochemistry. The apoptosis index of gastric mucosa was detected by TUNEL method.ResultsCompared with the normal group, the level of Caspase-3 and the apoptosis index of gastric mucosa cells in the model group were significantly lower (P＜0.05); Compared with the model group, the level of Caspase-3 and the apoptosis index of gastric mucosa cells in the Xiaotan Hewei Formula group and Vimentin group increased significantly (P＜0.05), and the Xiaotan Hewei Formula group was better than Vimentin group (P＜0.05).ConclusionXiaotan Hewei Formula can promote the apoptosis of PLGC by upregulating the expression of Caspase-3, which can prevent gastric precancerous lesion.

precancerous lesions of gastric carcinoma; Xiaotan Hewei Formula; apoptosis index; Caspase-3; rats

R285.5

A

1005-5304(2017)04-0054-03

2016-06-17）

（

2016-07-12；編輯：華強(qiáng)）

國家自然科學(xué)基金（81202678）；第二軍醫(yī)大學(xué)青年啟動基金（2012QN17）

徐晶鈺，E-mail：jyxu1983@163.com

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.04.014