HPLC法測(cè)定補(bǔ)元合腎酒中人參皂苷Rg1、Re、Rb1的含量

盧瀚思　辜勇軍　黃娟++龔琳慧++白俊毅

【摘 要】 目的：建立補(bǔ)元合腎酒中人參皂苷Rg1、Re、Rb1的含量測(cè)定方法。 方法：采用高效液相法對(duì)制劑中的人參皂苷Rg1、Re、Rb1進(jìn)行含量測(cè)定。 結(jié)果：人參皂苷Rg1、Re、Rb1進(jìn)樣量分別在39.16～1174.8ng、18.774～563.22ng、36.768～1103.04ng范圍內(nèi)與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（r>0.999）；平均回收率分別為99.84%，99.31%，99.76%，RSD為1.08%，1.96%，1.37%。 結(jié)論：樣品處理方法合理，方法學(xué)考察符合定量要求，結(jié)果準(zhǔn)確，可用于補(bǔ)元合腎酒中人參皂苷Rg1、Re、Rb1的含量檢測(cè)。

【關(guān)鍵詞】 補(bǔ)元合腎酒 人參皂苷Rg1 人參皂苷Re 人參皂苷Rb1 HPLC

Study on Quality Standard of Buyuanheshen Vinum

ABSTRACT Objective： To establish a method for the determination of ginsenoside Rg

1，Re，Rb1 in Buyuanheshen Vinum. Methods： The contents of ginsenoside Rg1， Re Rb1 in Buyuanheshen Vinum were determined by HPLC. Results： The content of ginsenoside Rg1， Re， Rb1 showed good liner relationships with respective peak area within the range of 39.16～1174.8ng， 18.774～563.22ng and 36.768～1103.04ng （ r>0.999） ， respectively； and the average recovery were 99.84%， 99.31% and 99.76%， RSD were 1.08%， 1.96%， 1.37%. Conclusion The quantitative method was simple， specific， accurate and reliable， which has good reproducibility and the ability of effectively controling the quality of compound Buyuanheshen Vinum.

KEY WORDS Buyuanheshen Vinum； Ginsenoside Rg1； Ginsenoside Re； Ginsenoside Rb1； TLC； HPLC； Quality standard

補(bǔ)元合腎酒傳承于成都肛腸專(zhuān)科醫(yī)院“濟(jì)川養(yǎng)生駐顏不老方”，該方始于我國(guó)已逝著名中醫(yī)肛腸病學(xué)專(zhuān)家、成都肛腸專(zhuān)科醫(yī)院創(chuàng)始人黃濟(jì)川先生的養(yǎng)生駐顏法，經(jīng)過(guò)多年臨床應(yīng)用驗(yàn)證與研究改進(jìn)。該制劑處方由紅參、巴戟天、肉蓯蓉等8味中草藥組成，具有填精補(bǔ)髓、益陰扶陽(yáng)、強(qiáng)筋壯骨、除皺消斑、增強(qiáng)免疫、增強(qiáng)活力之功效，可用于腎虛導(dǎo)致的各類(lèi)疾病的治療。

經(jīng)處方進(jìn)行分析，紅參為該方中君藥，主要活性成分為人參皂苷Rg1、Re、Rb1。為了控制本制劑的質(zhì)量，選擇人參皂苷Rg1、Re、Rb1作為含量測(cè)定的指標(biāo)成分。本文在參考了《中國(guó)藥典》及有關(guān)文獻(xiàn)[1，2]的基礎(chǔ)上，建立了補(bǔ)元合腎酒中人參皂苷Rg1、Re、Rb1的含量測(cè)定

方法。

1 儀器與試藥

補(bǔ)元合腎酒為自制（批號(hào)：151201、151202、151203）。人參皂苷Re對(duì)照品（批號(hào)：110754-201525，含量：92.3%），人參皂苷Rb1對(duì)照品（批號(hào)：110704-201424，含量：93.7%），人參皂苷Rg1對(duì)照品（批號(hào)：110703-201530，含量：91.7%），以上對(duì)照品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。Waters e2695 高效液相色譜儀；色譜柱InertSustain C18（25cm×4.6mm，5μm）；BT125D電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；AUW120電子天平（日本島津）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海申順生物科技）；純水機(jī)（密理博（上海）貿(mào)易有限公司）。乙腈、甲醇為色譜純；水為自制超純水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：InertSustain C18（25cm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相A：水；流動(dòng)相B：乙腈；檢測(cè)波長(zhǎng)203nm；流速1.0mL·min-1，進(jìn)樣量：20μL；柱溫：30℃，按下表1進(jìn)行梯度洗脫。在此條件下其他成分對(duì)人參皂苷Rg1、Re、Rb1的測(cè)定無(wú)干擾，人參皂苷Rg1與人參皂苷Re分離度為2.35，滿足色譜檢測(cè)要求。對(duì)照品、供試品及陰性對(duì)照色譜圖見(jiàn)圖1。

2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱(chēng)取人參皂苷Rg1對(duì)照品置10mL量瓶中，加甲醇制成每毫升約含1.5mg人參皂苷Rg1的對(duì)照品儲(chǔ)備液；精密稱(chēng)取人參皂苷Re對(duì)照品置10mL量瓶中，加甲醇制成每毫升約含0.5mg人參皂苷Re的對(duì)照品儲(chǔ)備液；精密稱(chēng)取人參皂苷Rb1對(duì)照品置10mL量瓶中，加甲醇制成每毫升約含1.5mg人參皂苷Rb1的對(duì)照品儲(chǔ)備液；分別精密移取上述儲(chǔ)備液各1mL置同一10mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，得到每毫升約含0.15mg人參皂苷Rg1、0.05mg人參皂苷Re、0.15mg人參皂苷Rb1的混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 精密吸取藥酒25mL至圓底燒瓶中，45℃旋蒸至無(wú)醇味后轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，圓底燒瓶用5mL純化水洗滌2次，洗滌液合并至分液漏斗中。用乙醚萃取3次，每次10mL，棄去乙醚層；水層用水飽和的正丁醇萃取3次，每次10mL，合并正丁醇層；用氨試液洗滌正丁醇層5次，每次5mL，棄去水層；取正丁醇層，60℃旋蒸至干，殘?jiān)眉状既芙庥?mL量瓶中，定容，搖勻，經(jīng)孔徑0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 分別精密吸取人參皂苷對(duì)照品Rg1、Re、Rb1儲(chǔ)備液各0.1mL，0.2mL，0.5mL，1mL，1.5mL，2.0mL，3.0mL，置10mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，吸取上述溶液及人參皂苷Rg1、Re、Rb1對(duì)照品儲(chǔ)備液，各進(jìn)樣20μL。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)繪制工作曲線，建立回歸方程，見(jiàn)表2。

2.5 儀器精密度 吸取“2.3.2”項(xiàng)下中配制的混合對(duì)照品溶液20μL，以HPLC含量測(cè)定方法重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，結(jié)果人參皂苷Rg1、Re、Rb1的峰面積RSD值分別為0.82%、1.58%、0.97%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批次（批號(hào)：151201）樣品6份，室溫下放置，分別于0、2、4、8、12、24h按HPLC含量測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果人參皂苷Rg1、Re、Rb1峰面積的RSD分別為0.78%、1.63%、1.12%，表明供試品溶液各組分在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批藥酒樣品6份，分別按供試品溶液制備方法操作制備樣品，以HPLC含量測(cè)定方法測(cè)定峰面積積分值，計(jì)算人參皂苷Rg1的RSD為1.52%；人參皂苷Re 的RSD為1.71%；人參皂苷Rb1的RSD為1.65%。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取已知含量的同一批樣品9份，每份12.5mL，分別加入一定量的對(duì)照品，按供試品溶液制備項(xiàng)下操作，每一個(gè)濃度制備3份樣品，按色譜條件測(cè)定各樣品含量，計(jì)算回收率。人參皂苷Rg1、Re、Rb1平均回收率分別為99.84%，99.31%，99.76%，RSD為1.08%，1.96%，1.37%。

2.9 樣品含量測(cè)定 取3批樣品（批號(hào)：151201、151202、151203），分別按含量測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。

3 討論

補(bǔ)元合腎酒為復(fù)方制劑，含有的成分復(fù)雜，嚴(yán)重干擾供試品的含量檢測(cè)。我們對(duì)人參皂苷成分常用的萃取、大孔吸附樹(shù)脂、C18小柱層析等提純方法[3]進(jìn)行了考察，其中以萃取處理方法提純效果較好且操作簡(jiǎn)便。我們進(jìn)一步對(duì)萃取溶劑量和萃取次數(shù)進(jìn)行了篩選，優(yōu)選出了最佳的樣品處理方法。

在流動(dòng)相梯度條件篩選過(guò)程中，分別嘗試了多種液相色譜條件[4，5，6]，其中《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版一部紅參含量檢測(cè)色譜方法的主峰分離度與峰型最佳，符合要求，適用于同時(shí)測(cè)定補(bǔ)元合腎酒中人參皂苷Rg1、Re、Rb1的含量。

綜上所述，本方法操作簡(jiǎn)單，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，靈敏度高，重現(xiàn)性好，方法學(xué)研究系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)符合規(guī)定，可用于補(bǔ)元合腎酒的定量分析方法。

參考文獻(xiàn)

[1]高楊， 陳林偉， 陳丹妮，等. HPLC法測(cè)定氣血雙補(bǔ)酒中人參皂苷Rg_1、Re和Rb_1的含量[J]. 中華中醫(yī)藥學(xué)刊， 2015（09）：2095-2097.

[2] 侯桂蘭， 林能明， 方羅，等. 紅參組方的注射劑中人參皂甙Rg1、Re、Rb1的含量測(cè)定[J]. 中國(guó)中醫(yī)藥科技， 2007， 14（6）：433-434.

[3] 孫彩華， 付迎， 蔣毅超. 高效液相色譜法對(duì)生脈膠囊中人參皂苷Rg1和Re的含量測(cè)定[J]. 中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)， 2016， 13（01）：9-12.

[4]國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典2015年版（一部）[M]. 中國(guó)醫(yī)藥科技出版社， 2015：153-154.

[5]苑雅萍， 李云濤， 郭佳超. HPLC測(cè)定參芪顆粒中人參皂苷Rg1，Re，Rb1的含量[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志， 2010， 16（16）：74-75.

[6]任睿， 賈宜軍， 金紅宇. HPLC測(cè)定益氣復(fù)脈口服液中紅參的含量[J]. 現(xiàn)代食品與藥品雜志， 2006， 16（4）：8-11.

第一作者

盧瀚思（1988-），男，碩士在讀，研究方向：藥劑學(xué)；

通訊作者

白俊毅（1984-），男，博士在讀，中藥師，研究方向：中藥新制劑開(kāi)發(fā)與應(yīng)用