豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）的檢測(cè)技術(shù)

陳曉輝+薛梅+朱俊平

摘要：豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是一種嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的傳染病，常與其他病原混合感染，臨床診斷非常困難，要確診需要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。而及時(shí)診斷是防控PRRS的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。從抗體的檢測(cè)和病原的檢測(cè)兩個(gè)方面對(duì)PRRS的檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行了簡(jiǎn)要綜述，旨在為診斷PRRS提供指導(dǎo)。

關(guān)鍵詞：豬繁殖與呼吸綜合征；抗體檢測(cè)；病原檢測(cè)

中圖分類號(hào)：S858.28 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： 文章編號(hào)：1007-273X（2016）12-0009-02

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome， PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus，PRRSV）引起的一種嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的傳染病。以妊娠母豬流產(chǎn)、死產(chǎn)、弱胎、木乃伊胎等繁殖障礙及各年齡階段豬的呼吸道癥狀為特征[1-3]。該病毒具有抗原變異性、嗜巨噬細(xì)胞性、持續(xù)感染性及抗體依賴增強(qiáng)性作用，臨床上常與其他病原混合感染使臨床表現(xiàn)形式復(fù)雜化[4-5]。要確診需要進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法很多，每種方法在檢測(cè)的特異性、敏感性、成本等方面存在差異。因此，建立有效且適合基層使用的PRRS檢測(cè)方法是防控PRRS的重要環(huán)節(jié)，本文就PRRS檢測(cè)方法進(jìn)行了綜述，供參考。

1 抗體的檢測(cè)

免疫熒光抗體（IFA）試驗(yàn)、免疫過氧化酶單層細(xì)胞試驗(yàn)（IPMA）、血清中和（SVN）試驗(yàn)及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）等都可用于檢測(cè)PRRSV的特異性抗體，通過檢測(cè)抗體水平可以對(duì)豬個(gè)體或整個(gè)豬群的PRRSV感染狀況或疫苗免疫效果給予一定的評(píng)價(jià)。

1.1 PRRSV抗體檢出時(shí)間及維持時(shí)間

當(dāng)豬感染PRRSV 7～14 d后，機(jī)體首先產(chǎn)生IgG抗體，機(jī)體產(chǎn)生的抗體隨著時(shí)間的積累呈增加的趨勢(shì)，當(dāng)抗體達(dá)到峰值后在體內(nèi)維持一段時(shí)間，然后抗體水平逐漸下降，不同檢測(cè)方法檢測(cè)出的抗體出現(xiàn)峰值時(shí)間、峰值維持時(shí)間以及抗體在體內(nèi)存留時(shí)間均不一致。在試驗(yàn)感染條件下，通過IgG-IFA、IPMA、ELISA、SVN方法可分別在感染后5～9、9～11、9～13、9～28 d內(nèi)檢測(cè)到抗體。PRRSV特異性IgM抗體在接種后5 d可以檢測(cè)到，并可持續(xù)21～28 d。不同的方法檢測(cè)出的抗體峰值時(shí)間各不相同：IFA 30～50 d、IPMA 35～50 d、ELISA 30～50 d、SVN 60～90 d，隨后抗體滴度逐漸下降。感染PRRSV后用各種方法檢測(cè)的抗體消失時(shí)間為： IFA 4～5個(gè)月、ELISA 4～10個(gè)月以上、IPMA 11～12個(gè)月、SVN12個(gè)月[6-8]。疫苗免疫后各種方法的檢測(cè)結(jié)果與上述時(shí)間段基本一致。

1.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）

ELISA適于大規(guī)模檢測(cè)，方便、易行，操作過程及結(jié)果判斷能夠標(biāo)準(zhǔn)化，且具有高度的特異性和敏感性，以間接ELISA和阻斷ELISA常見[6-8]。利用ELISA檢測(cè)血清中PRRSV抗體出現(xiàn)的時(shí)間與用IPMA和IFA檢測(cè)抗體出現(xiàn)時(shí)間基本相同，但是血清中PRRSV抗體持續(xù)時(shí)間明顯長(zhǎng)于IPMA和IFA所檢測(cè)出的抗體維持時(shí)間，檢出時(shí)間長(zhǎng)達(dá)1年左右。

ELISA診斷抗原有2種，一種是從細(xì)胞培養(yǎng)物中純化的全病毒抗原，另一種是重組的PRRSV核衣殼蛋白。無論是用全病毒還是用基因表達(dá)產(chǎn)物作為診斷抗原建立的ELISA，均具有較強(qiáng)的背景反應(yīng)。IDEXX公司生產(chǎn)的PRRSV抗體ELISA檢測(cè)試劑盒在全球范圍內(nèi)推廣使用，曾被認(rèn)為是PRRSV抗體檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)。但不久通過對(duì)照試驗(yàn)對(duì)該試劑盒檢測(cè)效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)IDEXX試劑盒存在假陽性結(jié)果，PRRSV全病毒抗原間接ELISA與IDEXX HerdChek ELISA試劑盒相比，前者特異性僅為26.6%，敏感性也僅為48.8%。如果該方法應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)中，將會(huì)對(duì)PRRS的凈化以及后備種豬的篩選帶來嚴(yán)重后果。因此，在ELISA試劑盒研制上還需要廣大從事ELISA試劑盒研制的人員做出更大的努力來彌補(bǔ)現(xiàn)有試劑盒的不足之處，進(jìn)一步完善中國(guó)ELISA診斷試劑盒標(biāo)準(zhǔn)[8-10]。

1.3 免疫過氧化酶單層細(xì)胞試驗(yàn)（IPMA）

IPMA是廣泛用于該病診斷的一種方法，其敏感性和特異性都較好，可用于PRRSV的血清抗體檢測(cè)、病毒鑒定及抗原檢測(cè)。自1991年建立至今，仍是歐洲和美洲國(guó)家廣泛使用的血清學(xué)診斷方法。利用IPMA和商品化的PRRSV ELISA試劑盒檢測(cè)抗體，并進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)利用同源性抗原檢測(cè)抗體，IPMA比ELISA試劑盒檢測(cè)出抗體的時(shí)間提前2～3 d，特別是對(duì)母源抗體的靈敏度更高，然而ELISA卻能在不損失特異性的基礎(chǔ)上提高敏感性，所以相比之下，ELISA更適合用來診斷PRRSV。由于IPMA結(jié)果判定具有一定主觀性，不能自動(dòng)顯示，同時(shí)費(fèi)時(shí)，檢測(cè)費(fèi)用高，不適合大規(guī)模檢測(cè)，因此在實(shí)際生產(chǎn)中未得到廣泛應(yīng)用[9，10]。

1.4 免疫熒光抗體（IFA）試驗(yàn)

IFA法在美國(guó)被廣泛利用，該法需進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)、熒光鏡檢，結(jié)果借助肉眼來觀察，因?qū)嶒?yàn)室操作方法的不同、技術(shù)人員的不同和非特異性熒光等原因產(chǎn)生較大的主觀性。對(duì)IFA和ELISA方法進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者具有很高的符合率，不符合的原因可能是血清抗體的水平太低。ELISA可以檢測(cè)抗體滴度比較低的血清，而用IFA則檢測(cè)不到，由此造成假陰性結(jié)果。

利用間接熒光抗體試驗(yàn)對(duì)試驗(yàn)感染PRRSV的豬的抗體進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，在感染病毒后9～14 d，首先檢測(cè)出IgG抗體，高滴度的IgG抗體可以維持7周；感染病毒后35 d再次接種PRRSV，體內(nèi)IgG抗體滴度不發(fā)生變化，病毒血癥仍可檢測(cè)到。在接種5～28 d可以檢測(cè)到IgM抗體，35 d后再次接種病毒其抗體在短時(shí)間內(nèi)增加。利用熒光抗體試驗(yàn)在不同時(shí)間對(duì)IgM抗體水平進(jìn)行檢測(cè)，在短時(shí)間內(nèi)有助于鑒別是否感染PRRSV。因此，在實(shí)際生產(chǎn)過程中要盡可能避免假陰性結(jié)果的出現(xiàn)，在條件允許情況下結(jié)合其他檢測(cè)結(jié)果得出結(jié)論[9-11]。

血清中和試驗(yàn)與IFA和ELISA相比，其敏感性低，原因可能是由于PRRSV特異的中和抗體出現(xiàn)比較晚，要在感染后30～60 d才能檢測(cè)到。對(duì)于急性感染的敏感性更差，與其他檢測(cè)方法的結(jié)果符合率低，達(dá)不到早期診斷的目的。因此，該方法不適合應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)中，僅限于實(shí)驗(yàn)室診斷[10-12]。

血清學(xué)呈陽性的結(jié)果并不能確定PRRSV是否能引起臨床發(fā)病，也不能區(qū)別是感染野毒還是疫苗毒，也不能說明動(dòng)物機(jī)體是否為病毒的攜帶者，僅能說明曾經(jīng)感染過PRRSV。對(duì)于血清學(xué)陰性可能是未感染PRRSV或感染但還未產(chǎn)生抗體，或以前感染過但現(xiàn)在血清轉(zhuǎn)陰，或是檢測(cè)方法的敏感性不夠或操作誤差。因此，現(xiàn)有的血清學(xué)方法不適合監(jiān)測(cè)整個(gè)豬群的群體情況，其僅能對(duì)單個(gè)個(gè)體作出初步診斷，要作出更準(zhǔn)確的診斷，還應(yīng)與免疫狀況或病毒分離或抗原的檢測(cè)相結(jié)合，才能達(dá)到對(duì)PRRS診斷、疫情凈化的目的[10-12]。

2 病原的檢測(cè)

病原的檢測(cè)主要包括免疫學(xué)檢測(cè)以及生物學(xué)檢測(cè)，其中免疫學(xué)檢測(cè)包括免疫熒光染色法、免疫過氧化物酶染色法以及免疫膠體金技術(shù)等，而生物學(xué)檢測(cè)主要進(jìn)行病毒的分離；核酸的檢測(cè)主要利用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)病毒特定的基因組進(jìn)行檢測(cè)。由于免疫學(xué)檢測(cè)存在較大的弊端，下面僅對(duì)生物學(xué)檢測(cè)以及核酸檢測(cè)技術(shù)作一簡(jiǎn)單的概述。

2.1 生物學(xué)檢測(cè)—病毒的分離

用于PRRSV分離的細(xì)胞有原代豬肺巨噬細(xì)胞（PAM）、傳代細(xì)胞系CL2621和Marc145。其中PAM最常用，因?yàn)閭鞔?xì)胞系對(duì)該病毒易感性差，故不能完全代替PAM，而且由于不是每批巨噬細(xì)胞對(duì)病毒的易感性都相同，所以在用PAM進(jìn)行分離病毒前，還要進(jìn)行批次試驗(yàn)，只有當(dāng)特定滴度的標(biāo)準(zhǔn)病毒在新的巨噬細(xì)胞中生長(zhǎng)良好時(shí)，方可使用，該方法是診斷PRRSV感染的經(jīng)典方法，多用于急性病例的確診和新疫區(qū)的確定，但是也存在不足之處，如費(fèi)用較高、勞動(dòng)強(qiáng)度較大，耗時(shí)多，且有可能污染其他病毒等，因此該方法不利于大規(guī)模豬場(chǎng)疫病的檢測(cè)[10-12]。

2.2 核酸檢測(cè)（反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）

核酸檢測(cè)（反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Reverse transcription polymer-ase chain reaction， RT-PCR）廣泛應(yīng)用于PRRSV的鑒定及臨床診斷，并在方法上不斷改進(jìn)和提高，擴(kuò)增的目的片段也主要是針對(duì)PRRSV的核衣殼蛋白基因，主要的原因是PRRSV基因組中ORF7編碼的核衣殼蛋白（N蛋白）中包括所有毒株都保守的共同表位和區(qū)別于歐洲型的特異性決定簇。RT-PCR比病毒分離更省時(shí)、省力，敏感性和特異性更強(qiáng)。用于RT-PCR檢測(cè)的樣品包括血清、精液及肺臟、脾臟等組織[13-15]。

利用RT-PCR對(duì)試驗(yàn)感染豬進(jìn)行抗原和抗體檢測(cè)，并與病毒分離和ELISA抗體檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該方法可以在感染24 h后檢測(cè)到病毒的核酸，但不能分離到病毒，而抗體只能在感染后第9d檢測(cè)到，由此可見RT-PCR的靈敏度明顯高于病毒分離和ELISA，有利于早期診斷[13-15]。

PCR方法可以區(qū)分歐洲株與美洲株，但其臨床應(yīng)用意義并不大。國(guó)外應(yīng)用PCR診斷PRRSV已取得很大進(jìn)展，許多學(xué)者根據(jù)PRRSV不同的ORF序列，設(shè)計(jì)了不同引物，建立了檢測(cè)PRRSV核酸的RT-PCR方法。隨著RT-PCR技術(shù)的發(fā)展，也陸續(xù)出現(xiàn)了熒光標(biāo)記的RT-PCR方法，如采用TaqManTMRT-PCR或分子信標(biāo)RT-PCR方法檢測(cè)臨床樣品，這些方法比常規(guī)RT-PCR方法的特異性更強(qiáng)，敏感性更高，但需要更高的成本。應(yīng)特別注意的是，因其敏感性特別高，易引起假陽性，因此在檢測(cè)時(shí)應(yīng)盡可能避免RNA的污染。RT-PCR方法在PRRS的診斷及監(jiān)測(cè)中發(fā)揮很大作用，在ELISA檢測(cè)為陽性的基礎(chǔ)上，再用高敏感性的RT-PCR進(jìn)行確診，這不僅可以降低費(fèi)用，而且可拓寬RT-PCR的應(yīng)用前景，如后備種豬的篩選，持續(xù)性感染豬的診斷及豬群的凈化等[13-15]。

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