基于藥效學(xué)和指標(biāo)成分優(yōu)選鼻鼽顆粒醇沉工藝

張艷軍+劉莉莉+吳云+胡軍華+常秀娟+蕭偉+晁恩祥

[摘要] 通過考察對血清組胺，IgE，IL-4，IFN及TNF-α的影響，評價(jià)鼻鼽顆粒醇沉工藝的合理性。以咖啡酸和迷迭香酸的含量為綜合指標(biāo)，采用Plackett-Burman設(shè)計(jì)篩選影響鼻鼽顆粒水提組醇沉工藝的顯著性影響因素；在此基礎(chǔ)上，通過Box-Behenken設(shè)計(jì)對顯著性因素進(jìn)一步優(yōu)化，確定最佳醇沉工藝。確定鼻鼽顆粒水提組的最佳醇沉工藝條件為：濃縮液相對密度1.15（65 ℃）、醇濃度70%、靜止時(shí)間12 h。藥效學(xué)評價(jià)結(jié)合Plackett-Burman和Box-Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化確定的醇沉工藝穩(wěn)定可行，預(yù)測性好，為鼻鼽顆粒的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供了可靠依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] 鼻鼽顆粒；藥效學(xué)；Plackett-Burman設(shè)計(jì)；Box-Behnken設(shè)計(jì)；醇沉工藝

[Abstract] To evaluate the rationality of alcohol precipitation technology of Biqiu granule by investigating its effect on serum histamine，IgE，IL-4，IFN and TNF-α. The contents of cafferic acid and rosmarinic acid were used as the evaluation indexes，and some factors affecting index were firstly evaluated by Plackett-Burman design；then alcohol precipitation technology was further optimized by Box-Behnken design to determine the optimal alcohol precipitation conditions. The best alcohol precipitation conditions were as follows： the relative density of herb liquor was 1.15 （65 ℃）；the concentration of alcohol was 70%，and standing time was 12 hours. Optimal alcohol precipitation technology of Biqiu granules determined by pharmacodynamic screening，Plackett-Burman and Box-Behnken design tests，was stable and feasible with good predictability，providing reliable basis for the industrialization production of Biqiu granules.

[Key words] Biuqiu granules；pharmacodynamics；Plackett-Burman design；Box-Behnken design；alcohol precipitation process

doi：10.4268/cjcmm20162418

鼻鼽顆粒是由國醫(yī)大師晁恩祥教授集多年臨床經(jīng)驗(yàn)精心研制的藥物，由辛夷、紫蘇葉、荊芥、蒼耳子、白芷等9味中藥材組成，具有疏散風(fēng)邪，通利鼻竅，疏導(dǎo)肺氣，舒緩鼻竅等功效，用于治療某些致敏因素引起的過敏性鼻炎（常見癥狀如鼻塞、鼻癢、噴嚏、流清涕等）。中藥醇沉處理是制劑過程中常用的純化方法，具有工藝成熟、過程明確、對設(shè)備要求不高等優(yōu)點(diǎn)，而且可以減少服用劑量、取得良好的成型性[1-2]。本文采用藥效學(xué)指標(biāo)對醇沉工藝的合理性進(jìn)行了評價(jià)，以咖啡酸和迷迭香酸含量的綜合評分為指標(biāo)，通過Placket-burman設(shè)計(jì)[3]對影響鼻鼽顆粒水提醇沉工藝的幾個因素進(jìn)行了篩選，并進(jìn)一步利用Box-Behnken[4-5]對篩選出的3個主要因素濃縮液相對密度、醇濃度、靜止時(shí)間進(jìn)行二次多項(xiàng)式擬合[6-7]，建立了相關(guān)預(yù)測模型，根據(jù)回歸模型確定最優(yōu)工藝參數(shù)，為鼻鼽顆粒的生產(chǎn)工藝規(guī)范和后續(xù)的研究奠定了基礎(chǔ)，為中藥醇沉工藝的合理性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

D2015W 型電動攪拌器（上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司）；Agilent 1100 Series 高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；Sartorious BP211電子天平（美國賽多利斯公司）；密度計(jì)（北京華科電子儀器開發(fā)中心）。

鼻鼽顆粒醇沉前濃縮液（江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，批號20141003）；工藝一（江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，醇沉樣品，批號20141201）；工藝二（江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，未醇沉樣品，批號20141202）；迷迭香酸對照品，購自中國食品藥品檢定研究院（批號111871-201102，供含量測定用）；咖啡酸對照品，購自中國食品藥品檢定研究院（批號110885-200102，供含量測定用）；卵白蛋白OVA，購自sigma（貨號A5503）；氫氧化鋁Al（OH）₃，購自sigma（貨號239186）；鼻炎康片（購自佛山德眾藥業(yè)有限公司，批號12170）；IgE免疫放射分析測定盒，購自北京華英生物技術(shù)研究所（批號20141101）；IL-4，TNF-α，IFN放免試劑盒，購自北京華英生物技術(shù)研究所（批號20141120）；95%乙醇；藥用規(guī)格提取工藝用水為純化水；液相用乙腈為色譜純；水為重蒸水；其他試劑均為市售分析純。

SD大鼠，雄性，體重180～220 g，購自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司，許可證號SCXK（滬）2013-0016，SPF級。動物飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)條件下，12 h明暗交替，（22±2）℃，自由攝食飲水。動物在上述環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品制備

取鼻鼽顆粒醇沉前液100 g于潔凈燒杯中，在攪拌下向藥液中勻速加入95%乙醇，乙醇加完后將燒杯封口，室溫下靜置一定時(shí)間，取上清液，即得鼻鼽顆粒醇沉液。

2.2 咖啡酸和迷迭香酸含量測定

2.2.1 色譜條件

Agilent C₁₈色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以0.1%磷酸水溶液為流動相A，以乙腈為流動相B，梯度洗脫（0～50 min，91%～34% A），檢測波長327 nm，流速1.0 mL·min^-1，進(jìn)樣體積10 μL，柱溫為30 ℃。理論板數(shù)按迷迭香酸峰計(jì)算均應(yīng)不低于5 000。對照品與樣品色譜圖見圖1。

2.2.2 對照品溶液的制備

取咖啡酸、迷迭香酸對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并稀釋成每1 mL中含咖啡酸、迷迭香酸分別為4，15 μg的溶液，搖勻，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備

稱取適量醇沉上清液，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 線性關(guān)系考察

稱取咖啡酸、迷迭香酸對照品適量，加甲醇溶解并定容，搖勻，得濃度分別為22.12，116.92 mg·L^-1的混合對照品儲備液，分別精密吸取混合對照品儲備液適量，以甲醇倍倍稀釋，搖勻，即得。分別進(jìn)樣10 μL，按2.4.1色譜條件進(jìn)行分析，以進(jìn)樣濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)（x），峰面積為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2.5 精密度試驗(yàn)

分別精密吸取咖啡酸、迷迭香酸的對照品溶液10 μL，按2.4.1色譜條件，進(jìn)樣，測定，連續(xù)6次，測得咖啡酸和迷迭香酸的峰面積的RSD為0.60%，0.90%，結(jié)果表明，精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取2.1.3項(xiàng)供試品溶液，按2.2.1項(xiàng)色譜條件，分別于制備后0，2，6，4，8，10，12，24 h分別進(jìn)樣測定，以咖啡酸和迷迭香酸的峰面積計(jì)算，結(jié)果RSD為0.50%，1.0%，結(jié)果表明供試品溶液放置24 h穩(wěn)定。

2.3 藥效篩選

2.3.1 方法

2.3.1.1 大鼠過敏性鼻炎模型建立 采用目前國內(nèi)常用的“卵蛋白注射及其鼻粘膜刺激法”，具體方法：選清潔級SD大鼠，以卵白蛋白（OAV）10 mg，Al（OH）₃30 mg及生理鹽水l mL混合后腹腔注射，隔日1次，連續(xù)7次，進(jìn)行初次免疫；第15天進(jìn)行加強(qiáng)免疫，每側(cè)鼻孔給予4% OVA 20 μg（50 μL）滴鼻，隔日1次，連續(xù)7次。正常組給與等量生理鹽水[8]。

過敏性鼻炎動物模型成功標(biāo)準(zhǔn)：于末次滴鼻致敏后觀察30 min大鼠搔鼻、噴嚏、鼻溢等行為，以上各項(xiàng)指標(biāo)均采用疊加量化記分法，總分>5分表示造模成功，之后繼續(xù)隔天滴鼻維持直至治療實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

記分方法：①鼻癢：抓撓3 次為1 分，3～10 次2 分，抓撓不止3 分；②噴嚏：1～3個為1分，3～5 個2 分，連續(xù)噴嚏3 分；③清涕：流至鼻孔為1分，超出前鼻孔為2分，涕流滿面為3分。

2.3.1.2 分組及給藥 60只大鼠隨機(jī)分成5組，每組12只。分別空白對照組，模型對照組，鼻炎康對照組0.4 g·kg^-1，工藝一、工藝二 2.0 g·kg^-1。除空白組外，其他各組動物于致敏第15日開始給藥，每日1次，連續(xù)14 d[8]。

2.3.2 指標(biāo)檢測

2.3.2.1 過敏性鼻炎SD大鼠行為學(xué)觀察 在OVA 滴鼻30 min 內(nèi)觀察鼻炎癥狀，記錄撓鼻、噴嚏次數(shù)及清涕出現(xiàn)的輕重程度，每日觀察1次。用積分迭加法評分（撓鼻：抓撓3次為1分，3～10次2分，抓撓不止3分；噴嚏：1～3個為1分，3～5個2分，連續(xù)噴嚏3分；清涕：流到鼻前孔1分，超過鼻前孔2分，涕流滿面3分）。

2.3.2.2 血清組胺，IgE，IL-4，IFN及TNF-α檢測 末次給藥30 min后，水合氯醛麻醉，腹主動脈采血，分離血清，-70 ℃保存，根據(jù)試劑盒說明方法進(jìn)行IgE，IL-4及TNF-α測定。

2.3.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0。

2.3.3 結(jié)果

2.3.3.1 SD大鼠行為學(xué)改變情況 模型大鼠出現(xiàn)典型的過敏性鼻炎的癥狀（頻繁的抓鼻、打噴嚏和流鼻涕等），經(jīng)過陽性對照組、工藝一及工藝二連續(xù)給藥后的評分結(jié)果見表1。與模型組比較，陽性對照組、工藝一及工藝二均可以降低抓鼻、打噴嚏和流鼻涕的頻率，其中工藝一差異具有非常顯著的意義（P<0.001）。與陽性對照組及工藝二比較，工藝一的評分差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.3.3.2 對血清組胺，IgE，IL-4，IFN及TNF-α的影響 與空白組比較，模型組血清IgE，組胺，IFN及TNF-α處于較高水平，差異具有顯著意義（P<0.01），見表2。與模型組比較，鼻鼽顆粒不同工藝血清細(xì)胞因子水平均有下降趨勢，工藝一可降低IgE和IFN，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01），工藝二可降低TNF-α，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。綜合評價(jià)，鼻鼽顆粒治療過敏性鼻炎降低免疫因子水平方面療效明確，相對于醇沉前樣品（工藝二），醇沉樣品（工藝一） 可顯著降低血清組胺，IgE，IFN及TNF-α水平，效果較好。

2.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.4.1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)

Plackett-Burman 試驗(yàn)對每個因素取3個水平（-1，1），在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取影響較大的6個因素：攪拌速度（A，400，600 r·min^-1）、加醇速度（B，3.0，5.0 mL·s^-1）、靜置溫度（C，20，40 ℃）、靜置時(shí)間（D，10，14 h）、濃縮液相對密度（E，1.05，

1.20）、醇濃度（F，60%，80%），進(jìn)行試驗(yàn)。Plackett-Burman 設(shè)計(jì)自動生成12次試驗(yàn)，每組試驗(yàn)重復(fù)3次以上，以3次試驗(yàn)咖啡酸和迷迭香酸含量的綜合評分（綜合評分=咖啡酸/最大含量×50+迷迭香酸/最大含量×50）為考察指標(biāo)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3，各因素對考察指標(biāo)影響的次序見圖2。

由帕拉圖 2 可知，因素靜置時(shí)間、濃縮液相對密度、醇濃度影響比較顯著，可作為下一步試驗(yàn)優(yōu)化的因素。因素A，B，C效應(yīng)不顯著，對試驗(yàn)結(jié)果影響較弱，在下一步研究中分別設(shè)定攪拌速度500 r·min^-1、加醇速度4.0 mL·s^-1、靜置溫度30 ℃。

2.4.2 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)Plackett-Burman篩序結(jié)果，以咖啡酸和迷迭香酸含量的綜合評分為考察指標(biāo)，選取濃縮液相對密度（A）、醇濃度（B）、靜置時(shí)間（C）3個因素為自變量，每個自變量的低、中、高實(shí)驗(yàn)水平分別以-1，0，1進(jìn)行編碼。每個實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值，Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表4。

2.4.3 Box-Behnken 試驗(yàn)結(jié)果分析

利用Design-Expert8.0軟件對表4中數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸擬合，得出回歸擬合方程：R綜合評分=94.46+4.05A-2.05B+1.66C-1.85AB-5.87AC-1.14BC-13.24A²-6.62B²-2.05C²，標(biāo)準(zhǔn)差1.49，R²=0.990 1。對模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表5。表明模型P<0.001，響應(yīng)面模型達(dá)到顯著水平，影響醇沉工藝因素的主次順序?yàn)锳>B>C，其中因素A（濃縮液相對密度）影響比較顯著（P<0.001），交互作用中AC的影響比較顯著（P<0.001），失擬項(xiàng)（P>0.05）不顯著，表明二次方程預(yù)測值與實(shí)際值吻合度較高。各方程對應(yīng)的三維響應(yīng)面圖、等高線見圖3。

2.4.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

應(yīng)用Design-Expert 8.0.6軟件對影響鼻鼽顆粒水提組醇沉工藝的顯著性影響因素綜合分析，得到醇沉的最佳工藝：濃縮液相對密度1.13、醇濃度68.04%、靜置時(shí)間12.65 h、綜合評分為95.50。考慮到生產(chǎn)實(shí)際情況，故將工藝參數(shù)設(shè)定為：濃縮液相對密度1.15、醇濃度70%、靜置時(shí)間12 h，以該工藝參數(shù)進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，取其平均值，綜合評分為93.85，基本與模型預(yù)測值一致，說明模型優(yōu)化結(jié)果可信，確定的最優(yōu)工藝適合生產(chǎn)要求。

3 討論

紫蘇葉、荊芥分別為方中的君藥和臣藥，在臨床上應(yīng)用比較廣泛，可用于治療呼吸道疾病如變應(yīng)性喉炎、鼻炎、呼吸道過敏等[9-12]，其中都含有酚酸類成分咖啡酸、迷迭香酸[13]。迷迭香酸具有抗過敏、抗氧化和免疫抑制等多種活性[12，14]，ToshiakiMakino等證明迷迭香酸具有抗過敏作用，并且在體內(nèi)有一定的治療作用[15]。李林等研究發(fā)現(xiàn)迷迭香酸對大鼠抗Thyl.1系膜增生性腎小球腎炎（MsPGN）具有治療作用及能下調(diào)腎組織中轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）的表達(dá)，從而起到治療炎癥的作用[15-16]。咖啡酸亦具有抗炎、抗菌、抗病毒、升高白細(xì)胞及血小板等多種藥理作用，楊九凌等[17]、王琦等[18]通過檢索國內(nèi)外文獻(xiàn)，對咖啡酸的抗氧化、抗炎、鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用進(jìn)行了報(bào)道。故本文選擇咖啡酸和迷迭香酸作為工藝優(yōu)選的評價(jià)指標(biāo)。此外，蒼耳子中的綠原酸在抗氧化、抑菌、抗炎、抗病毒等有一定的療效[19-20]。

Plackett-Burman設(shè)計(jì)是一種2水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，它試圖用最少試驗(yàn)次數(shù)篩選并確定對結(jié)果影響比較顯著的因素，避免在后期的優(yōu)化試驗(yàn)中由于部分因子不顯著而浪費(fèi)試驗(yàn)資源，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于化學(xué)、質(zhì)量控制和食品科學(xué)等領(lǐng)域[5]。Box-Behnken響應(yīng)面分析法克服了目前正交實(shí)驗(yàn)只能給出最佳因素水平組合的缺點(diǎn)，不僅僅可以通過相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，篩選出整體因素中的最佳工藝組合和響應(yīng)值，而且能夠在因素和響應(yīng)值之間建立模型，對實(shí)驗(yàn)的預(yù)測性較好，信息量大，精度度高，在未來中藥領(lǐng)域的研究中會越來越廣泛[6-7]。

由于中藥復(fù)方成分復(fù)雜，在中間體精制過程中，采用切實(shí)可行的綜合評價(jià)方法，可以更好的發(fā)揮醇沉工藝的實(shí)用性和科學(xué)性[21]。本文先通過藥效評價(jià)法確定醇沉工藝的合理性，在不影響藥效的前提下，利用Placket-Burman設(shè)計(jì)和Box-Behnken設(shè)計(jì)相結(jié)合，以咖啡酸和迷迭香酸含量的綜合評分為指標(biāo)，對鼻鼽顆粒醇沉工藝進(jìn)行了優(yōu)化，并建立了相關(guān)數(shù)學(xué)模型，具有較好的預(yù)測性。驗(yàn)證試驗(yàn)表明，該工藝穩(wěn)定可行，醇沉精制后，除去了藥材中的雜質(zhì)，減少了給藥劑量，提高了藥物的穩(wěn)定性，為后續(xù)的鼻鼽顆粒制劑研究奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)為中藥浸膏的醇沉工藝研究提供了一定的理論指導(dǎo)。

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[責(zé)任編輯 孔晶晶]