青枯雷爾氏菌胞外多糖研究進展

陳德局，張海峰，劉　波，朱育菁，鄭雪芳，陳小強

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所　350003)

微生物多糖是細菌、真菌、藍藻等微生物在代謝過程中合成的生物高聚物，主要以3種形式存在： 粘附在細胞表面上，即胞壁多糖;分泌到培養(yǎng)基中，即胞外多糖; 構(gòu)成細胞的成分，即胞內(nèi)多糖。廣義上的胞外多糖指的是糖被，包括微莢膜、莢膜、黏液層和菌膠團[1]。病原微生物的胞外多糖被認為是一種致病因子，越來越受到科研工作者的重視[2-3]。銅綠假單胞菌是人和動物的機會致病菌，它合成的大量胞外多糖是形成生物膜的重要組分，其形成生物膜后對藥物具有更高閾值的抗藥性，給病人抗感染治療增加難度[4-5]。Baker等[6]通過抑制銅綠假單胞菌的胞外多糖形成生物膜，能顯著提高細菌對藥物的敏感性，提出針對胞外多糖形成生物膜的治療銅綠假單胞菌的感染策略。在植物病原菌中，合成胞外多糖形成外夾膜可以逃避宿主免疫系統(tǒng)識別，并防止自身水分和養(yǎng)分的丟失[7]，也可以促進微生物在寄主內(nèi)形成生物膜而獲得群體性的生存優(yōu)勢[8]。

青枯雷爾氏菌(Ralstoniasolanacearum)是植物細菌性青枯病的致病菌，具有破壞性的土傳性植物病原菌，地理分布廣泛，寄主范圍廣，可侵染50多個科的200多種植物[1，9]。青枯雷爾氏菌在營養(yǎng)豐富的環(huán)境，能合成胞外多糖(Exopolysaccharides，EPS)分泌到細胞壁外，有的胞外多糖分泌到胞外后依附于微生物細胞壁形成莢膜，稱為莢膜多糖；有的胞外多糖分泌到胞外后進入培養(yǎng)基形成粘液，稱為粘液多糖。胞外多糖，被廣泛認為是青枯雷爾氏菌重要的致病因子[10-11]。因此，研究青枯雷爾氏菌胞外多糖在植物青枯病發(fā)生過程中的生理功能對了解青枯病的發(fā)生和進行病害的生物防治具有重要的意義。本文從青枯雷爾氏菌胞外多糖合成基因、調(diào)控和生理功能等方面進行歸納綜述。

1　青枯雷爾氏菌胞外多糖合成基因

青枯雷爾氏菌是一種革蘭氏陰性細菌，能合成胞外多糖分泌到細胞外適應(yīng)生存環(huán)境。胞外多糖的合成基因形成eps操縱子，由調(diào)控基因和合成基因組成，調(diào)控基因與合成基因在基因組的位點不相鄰，為合成基因的反式調(diào)控因子。目前，在青枯雷爾氏菌中，與胞外多糖合成的結(jié)構(gòu)基因有7個，它們在基因組上成簇存在，如圖1所示。

圖1　青枯雷爾氏菌合成胞外多糖結(jié)構(gòu)基因注：epsA：EPSI多糖外排外膜蛋白；epsP：酪氨酸磷酸酶；epsB：EPSI多糖外排蛋白；epsC：UDP-N-乙酰葡萄糖胺2異構(gòu)酶；epsD：NDP-N-乙酰-D-半乳糖胺醛酸脫氫酶；epsE：EPSI多糖外排內(nèi)膜蛋白；epsF：EPSI多糖外排內(nèi)膜蛋白。

2　青枯雷爾氏菌胞外多糖合成調(diào)控

胞外多糖合成主要由全局性調(diào)控因子PhcA蛋白調(diào)控，PhcA屬于LysR家族蛋白，位于青枯雷爾氏菌毒力因子表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的核心，它調(diào)節(jié)毒力因子如胞外多糖的合成、效應(yīng)分子的表達、宿主細胞壁降解酶和細胞游動相關(guān)蛋白的表達[12]。PhcA通過群體感應(yīng)系統(tǒng)感知細胞濃度而激活，群體感應(yīng)系統(tǒng)的誘導(dǎo)物質(zhì)包括3-羥基棕櫚酸甲酯(3-OH PAME)，在病原菌感染宿主早期，PhcA不表達，當細胞宿主體內(nèi)達到一定數(shù)量時，3-OH PAME積累到一定濃度，激活了PhcA并誘導(dǎo)胞外多糖操縱子表達合成胞外多糖[13]。當細胞濃度達到1×107cfu/mL時，由PhcB合成的群體感應(yīng)分子3-OH-PAME濃度上升，PhcR通過磷酸化激活PhcA，激活eps操縱子表達合成胞外多糖[14]。圖3為EPS在青枯雷爾氏菌中合成被激活的調(diào)控過程，表1為參與EPS合成調(diào)控因子。青枯雷爾氏菌的EPS合成的調(diào)控研究主要集中在20世紀八九十年代，其中eps操縱子包含12個以上的基因，調(diào)控eps操縱子表達的調(diào)節(jié)基因至少有10個，另外至少有3種以上誘導(dǎo)信號啟動合成胞外多糖[15]。

圖3　青枯雷爾氏菌中EPS合成調(diào)控示意圖注：資料來源于文獻[16]。

表1　青枯雷爾氏菌中調(diào)控EPS合成的Phc和Eps系統(tǒng)

注：資料來源于文獻[16]。

隨著對EPS合成代謝研究的深入，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)越來越多的遺傳因子在青枯雷爾氏菌EPS合成調(diào)控中發(fā)揮作用。目前，在其他微生物中發(fā)現(xiàn)越來越多的遺傳因子與EPS合成相關(guān)[17-20]，這將為研究青枯雷爾氏菌的EPS代謝調(diào)控具有啟發(fā)作用。

3　青枯雷爾氏菌胞外多糖的生理功能

胞外多糖被認為是植物病原菌致病發(fā)生過程中的一個關(guān)鍵的致病因子之一[21]，其積累能力與青枯雷爾氏菌的致病力相關(guān)。Denny等[21]通過Tn5插入突變獲得兩類胞外多糖產(chǎn)量不同的青枯雷爾氏菌，第一類菌在豐富培養(yǎng)基上胞外多糖產(chǎn)量低于野生菌株產(chǎn)量的5%，宿主青枯病發(fā)病時間延緩，發(fā)病植株數(shù)為野生菌的1/3；另一類菌在豐富培養(yǎng)基上胞外多糖產(chǎn)量接近野生菌株的產(chǎn)量，其致病力與野生菌沒有顯著差異，表明胞外多糖是青枯雷爾氏菌致病的關(guān)鍵毒力因子。在其他植物病原菌中也發(fā)現(xiàn)胞外多糖合成能力與致病力相關(guān)，通過基因敲除玉米枯萎病菌(Pantoeastewartii)的群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控基因lrhA和rcsA，胞外多糖的產(chǎn)量顯著下降，從而降低玉米枯萎病菌的致病力[22]；將胞外多糖降解酶在薔薇科果樹中表達，能降低蘋果和梨樹對火疫歐文氏菌的敏感性[23- 24]。青枯雷爾氏菌侵染宿主后，將宿主的莖制成橫切面切片后，利用胞外多糖抗體對切片染色后在免疫熒光顯微鏡下觀察，可以觀察到青枯雷爾氏菌在導(dǎo)管中形成致密的堵塞[25]；在葡萄病原菌Xylellafastidiosa侵染宿主后顯微鏡中也觀察到堵塞導(dǎo)管的現(xiàn)象[26]。因此，學(xué)者認為，青枯雷爾氏菌在宿主導(dǎo)管中定殖后，積累大量的胞外多糖阻塞宿主營養(yǎng)和水分運輸，導(dǎo)致宿主萎蔫[27]。

研究表明，在青枯雷爾氏菌侵染宿主后合成的EPS，能幫助其逃避宿主免疫系統(tǒng)的識別而對自身具有保護作用[28-30]。青枯雷爾氏菌在宿主導(dǎo)管中合成大量的EPS，形成了一個類似的生物膜，可以逃避宿主識別或者提高對宿主分泌殺菌物質(zhì)的抗性[31]。

病原微生物侵染宿主的能力與其運動能力相關(guān)[32]，青枯雷爾氏菌侵染番茄需要其具有運動能力[33]，而胞外多糖與細菌的運動能力相關(guān)[34-35]。因此，青枯雷爾氏菌的胞外多糖與其運動能力相關(guān)，合成胞外多糖有助于提升其侵染宿主能力?？茖W(xué)家們在研究其他微生物胞外多糖生理功能時，發(fā)現(xiàn)其具有吸附營養(yǎng)物質(zhì)[36]、耐受低溫[37]等功能，但在青枯雷爾氏菌中還未見相關(guān)報道。

4　展望

胞外多糖的合成和積累對病原菌的致病力至關(guān)重要，闡明其在青枯雷爾氏菌致病過程中的生理功能，有助于研究人員以胞外多糖為靶標，設(shè)計新型農(nóng)藥，為素有植物“癌癥”之稱的青枯病的防治提供一種新的策略。但是近10年來，植物青枯病研究領(lǐng)域的科學(xué)家主要關(guān)注于病原菌分泌的效應(yīng)分子在致病性與致病力方面，而忽視了胞外多糖在病害發(fā)生進程中的重要性。因此，在研究青枯病防治策略上，可以以胞外多糖為靶標，開發(fā)出新型農(nóng)藥。

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腫瘤是一類細胞周期疾病，經(jīng)歷多基因、多步驟突變，細胞呈失控性生長，其中細胞凋亡失衡是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要機制[6-7]。凋亡抑制蛋白家族是一類抑制凋亡的調(diào)節(jié)因子，Survivin是上世紀九十年代末發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制蛋白家族新成員，定位于人類染色體17q25，由142個氨基酸組成，只表達于腫瘤與胚胎組織，與其他凋亡抑制蛋白家族成員比較，Survivin結(jié)構(gòu)簡單，具有其他成員無可比擬的抗凋亡能力。近年來研究顯示，在肺癌、喉癌、胃癌、結(jié)直腸癌、鼻咽癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤均可發(fā)現(xiàn)Survivin過表達，Survivin已成為腫瘤診斷與治療的新靶點[8-10]。

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