抗條銹病普通小麥-中間偃麥草7St二體異附加系的分子細胞遺傳學(xué)鑒定

于軍偉，王斯文，姚廣平，趙繼新，陳春環(huán),吉萬全，王長有

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌 712100； 2.農(nóng)業(yè)部作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)新陜西科學(xué)觀測試驗站，陜西楊凌 712100； 3.三原縣農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)中心，陜西三原 713800)

小麥野生近緣植物攜帶有大量的優(yōu)異基因，是栽培小麥遺傳改良的重要基因資源庫[1]。利用遠緣雜交技術(shù)向栽培小麥品種轉(zhuǎn)移近緣種屬的優(yōu)異基因是創(chuàng)造小麥新的變異類型、擴寬小麥遺傳基礎(chǔ)、豐富親本遺傳多樣性、創(chuàng)新小麥育種資源的重要手段[2]。

中間偃麥草(Thinopyrumintermedium,2n=6x=42,JJJSJSStSt)屬于小麥族(Triticeae)偃麥草屬(Elytrigia)，為多年生異花授粉植物，主要分布于高加索、中亞的東南部[3]。其抗旱性、耐鹽性和抗寒性都極強，許多農(nóng)藝性狀表現(xiàn)良好，且?guī)缀醪皇苄←滀P病和白粉病的侵害，對黑穗病、根腐病、莖腐病、葉枯病等病害也表現(xiàn)為高抗。中間偃麥草是偃麥草屬中最早與小麥成功雜交的遠緣材料，為小麥種質(zhì)創(chuàng)新和品種改良提供了大量的優(yōu)異基因，是小麥遺傳改良的重要資源庫[4]。

目前關(guān)于中間偃麥草的基因組組成爭議較大，普遍認為中間偃麥草的基因組組成是JJJSJSStSt[5]，為部分同源異源六倍體。Kruppa等[6]利用多色GISH(multi-color GISH, mc-GISH)技術(shù)，以百薩偃麥草(Thinopyrumbessarabicum)和擬鵝觀草(Pseudorogneriastrigosa)的基因組DNA為探針，證明中間偃麥草是由19條J染色體、9條Js染色體和14條St染色體組成。前人研究表明，中間偃麥草J染色體組可能來源于原始的二倍體長穗偃麥草或百薩偃麥草，St染色體組可能起源于擬鵝觀草[7]。關(guān)于JS基因組的來源，Wang等[8]研究認為，Js基因組供體先與J基因組經(jīng)過了一次雜交加倍，然后與原始的St基因組供體雜交加倍，形成Js基因組，最后形成了當今的中間偃麥草。崔 雨等[5]提出中間偃麥草的Js染色體組可能與簇毛麥有較近的親緣關(guān)系，并將其表示為Jvs，這為中間偃麥草的起源又帶來了新的觀點。

小麥條銹病是由條銹菌(Pucciniastriiformisf.sp.tritici(Pst))引起的影響小麥生產(chǎn)的真菌類病害，可使小麥年產(chǎn)量減少20%～30%，發(fā)病嚴重時甚至顆粒無收[9]。小麥條銹病在我國曾數(shù)次流行，最近一次于2019年發(fā)生在西北地區(qū)，并迅速蔓延至全國[10-11]。研究表明，種植抗病品種是最經(jīng)濟、最有效的控制小麥條銹病的策略[12]。前人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多個小麥條銹病抗性基因，并廣泛用于小麥的抗病育種[13]。然而，由于條銹病病原菌毒性小種的變異迅速，大多數(shù)品種的抗病性逐漸降低或最終喪失抗病性[14]。因此，培育新的抗病品種對于小麥育種研究是非常迫 切的。

ES-24是普通小麥品種阿勃缺體系與普通小麥-中間偃麥草部分雙二倍體遠中4雜交和連續(xù)自交產(chǎn)生的后代，田間對條銹病表現(xiàn)為高抗。本研究利用細胞學(xué)、原位雜交、分子標記等技術(shù)，結(jié)合形態(tài)學(xué)和條銹病抗性調(diào)查，對ES-24進行綜合鑒定，以期為ES-24在小麥遺傳改良中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料包括中間偃麥草(2n=6x=42, JJJSJSStSt)、中國春(2n=6x=42，AABBDD)、百薩偃麥草(2n=14，JJ 或EbEb)、擬鵝觀草(2n=14，StSt)、小麥-中間偃麥草二體異附加系ES-24、八倍體親本遠中4和阿勃缺體系，以及條銹病感病對照品種輝縣紅，均由西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院小麥遠緣雜交及染色體工程實驗室提供。供試條銹菌生理小種CYR-32和CYR-33混合小種由西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護學(xué)院提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 細胞學(xué)鑒定

分別于3月下旬和4月中旬，在適宜的溫度條件下，在田間取材料的根尖和幼穗進行細胞學(xué)鑒定。根尖和幼穗的固定參照Yang等[15]的方法完成。利用Olympus BX-43顯微鏡(日本)進行鏡檢并采集照片，觀察并統(tǒng)計其體細胞有絲分裂中期Ⅰ染色體的數(shù)目、花粉母細胞減數(shù)分裂中期Ⅰ染色體的數(shù)目及配對情況、減數(shù)分裂后期Ⅰ同源染色體的分離情況。

1.2.2 原位雜交分析

根尖處理：將種子在室溫下置于濕潤濾紙上，腹溝朝下均勻擺放，置于23℃培養(yǎng)箱萌發(fā)2～3 d，待幼根長至2～3 cm時，將根尖分生區(qū)切下，采用Wang等[16]的方法處理。選取分裂相良好的染色體采用滴片法制片。

原位雜交分析：用CTAB法提取試驗材料幼嫩葉片全基因組DNA。參照Yang等[15]的方法，以中國春的全基因組DNA為封阻，中間偃麥草的全基因組DNA為探針，對ES-24進行基因組原位雜交(genomic in situ hybridization, GISH)鑒定。參照Han等[17]的方法，用中間偃麥草的全基因組DNA以及寡核苷酸探針Oligo-pSc119.2(綠色)和Oligo-pTa535(紅色)進行熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH)鑒定。參照Kruppa等[6]的方法，用Fluorescein-12-dUTP標記百薩偃麥草全基因組DNA，用Texas red-5-dUTP標記擬鵝觀草全基因組DNA，以百薩偃麥草全基因組(J)DNA(綠)和擬鵝觀草的全基因組(St)DNA(紅)為探針，進行mc-GISH鑒定，用Olympus BX-53熒光顯微鏡觀察并用Adobe Photoshop CC2018處理圖像。

1.2.3 分子標記分析

利用分布于小麥1～7部分同源群上的90個EST標記和135個PLUG標記，鑒定ES-24所攜帶的中間偃麥草染色體片段的同源群歸屬，追蹤普通小麥背景中中間偃麥草的遺傳物質(zhì)。EST引物信息參照網(wǎng)站Http://wheat.pw.usda.gov/SNP/new/pcr_primers.shtml，PLUG引物信息參照Ishikawa等[18]發(fā)表的引物。引物均由北京奧科鼎盛生物技術(shù)有限公司合成。PCR和電泳分析按照Zhu等[19]的方法進行。

1.2.4 條銹病抗性鑒定和農(nóng)藝性狀調(diào)查

成株期條銹病抗性鑒定在小麥育種圃進行。鑒定材料于2019年10月中上旬播種，每個材料播種2行，行長1 m，行距0.25 m，株距10 cm，同時種植感病對照輝縣紅。在2020年3月中旬傍晚，用清水給感病對照輝縣紅輕噴細霧后，采用撒粉接種法接種條銹病菌生理小種CYR-32和CYR-33的混合小種，然后用薄膜覆蓋，翌日清晨去掉薄膜。待輝縣紅充分發(fā)病后，調(diào)查發(fā)病情況，按照參考文獻[20]報道的方法記載反應(yīng)型，2～3 d后再復(fù)查1次。

于2020年6月收獲植株后,調(diào)查并記錄ES-24及親本的株高、穗長、分蘗數(shù)、小穗數(shù)、小穗粒數(shù)、芒性等性狀。

2 結(jié)果與分析

2.1 細胞學(xué)鑒定結(jié)果

根尖分生區(qū)體細胞染色體數(shù)目觀察結(jié)果(圖1A)顯示，ES-24體細胞在有絲分裂中期含有44條染色體?；ǚ勰讣毎R檢結(jié)果(圖1B)顯示，減數(shù)分裂中期Ⅰ染色體有22對二價體，未觀察到多價體的形成，配對情況良好，其構(gòu)型為2n=44=22Ⅱ。在減數(shù)分裂后期Ⅰ，同源染色體均等分離，未檢測到滯后染色體(圖1C)。以上結(jié)果說明，ES-24具有穩(wěn)定的細胞遺傳學(xué)機制。初步推測，ES-24攜帶了一對中間偃麥草的染色體。

A：有絲分裂中期；B：減數(shù)分裂中期I；C：減數(shù)分裂后期I。A:Mitotic metaphase; B:Meiotic metaphase I; C:Meiotic anaphase I.圖1 ES-24的細胞學(xué)觀察結(jié)果Fig.1 Cytological observation of ES-24

2.2 原位雜交鑒定結(jié)果

以中間偃麥草的全基因組DNA作為探針,以中國春的全基因組DNA作為封阻，對ES-24根尖染色體進行GISH鑒定，DAPI(藍色)復(fù)染。結(jié)果(圖2A)顯示，ES-24有兩條染色體被雜交上綠色信號，而其余42條染色體均呈現(xiàn)為藍色，表明ES-24是攜帶42條普通小麥染色體和2條中間偃麥草染色體的二體附加系。

用百薩偃麥草的全基因組DNA和擬鵝觀草的全基因組DNA為探針，中國春的全基因組DNA為封阻，進行mc-GISH分析，結(jié)果(圖2B)顯示，ES-24的一對染色體產(chǎn)生了明亮的紅色信號。說明ES-24攜帶了一對中間偃麥草的St染色體。

A:以中間偃麥草全基因組DNA(綠色)為探針與ES-24根尖染色體進行的基因組原位雜交；B:以百薩偃麥草基因組DNA(綠)與擬鵝觀草基因組DNA(紅)為探針進行的多色GISH；C:以O(shè)ligo-pTa535(紅)、Oligo-pSc119.2(綠)為探針與ES-24根尖染色體進行的熒光原位雜交。白色箭頭所指為中間偃麥草染色體。A:GISH of ES-24 root tip chromosomes using whole genome DNA (green) of Th.intermedium as probe; B:mc-GISH with genomic DNA of Th.bessarabicum(green) and Ps.strigosa(red) as probes; C:FISH of ES-24 root tip chromosomes using Oligo-pTa535 (red) and oligo-pSc119.2 (green) probes.White arrows indicate the chromosomes from Th.intermedium.圖2 ES-24的GISH、FISH和mc-GISH原位雜交鑒定Fig.2 GISH，F(xiàn)ISH and mc-GISH identifications of ES-24

通過以O(shè)ligo-pTa535(紅)、Oligo-pSc119.2(綠)為探針對ES-24進行FISH鑒定，ES-24含有42條與中國春FISH核型一致的染色體，一對染色體在其長臂和短臂末端產(chǎn)生Oligo-pTa535紅色信號，其信號不同于其他小麥的FISH核型(圖2C)。綜合來看，ES-24附加了一對中間偃麥草的St染色體。

2.3 分子標記分析結(jié)果

利用分布在小麥1～7同源群上的90個EST標記和135個PLUG標記，對ES-24及其親本(阿勃、遠中4和中間偃麥草)進行分子標記分析，最終篩選出3個EST特異標記(BE591737、BG274576和BE637663)和2個PLUG特異標記(TNAC1826和TNAC1821)(表1)。以上標記在ES-24、遠中4和中間偃麥草中均擴增出明顯的特異性條帶(圖3)，且都位于小麥的第七部分同源群染色體上。結(jié)合上述原位雜交結(jié)果，表明ES-24攜帶了一對中間偃麥草的7St染色體。

表1 ES-24所攜帶中間偃麥草7St連鎖的EST及PLUG多態(tài)性標記Table 1 EST and PLUG polymorphic markers linked to 7St from Th.intermedium carried by ES-24

M:DL2000；1：阿勃；2：ES-24；3：遠中4；4：中間偃麥草；a1：BE591737；a2：BG274576；a3：BE637663；b1：TNAC1826-Hae III；b2：TNAC1826-Taq I；b3：TNAC1821-Hae III；b4：TNAC1821-Taq I。箭頭所指為特異性條帶。M:DL2000; 1:Abbondanza; 2:ES-24; 3:Yuanzhong 4; 4:Th.intermedium; a1:BE591737; a2:BG274576; a3:BE637663; b1:TNAC1826-Hae III; b2:TNAC1826-Taq I; b3:TNAC1821-Hae III; b4:TNAC1821-Taq I. Arrows indicate specific bands.圖3 用5個多態(tài)性標記對ES-24及其親本的擴增結(jié)果Fig.3 Amplification results of ES-24 and its parents using five polymorphic markers

2.4 農(nóng)藝性狀調(diào)查和條銹病抗性鑒定結(jié)果

從株高、分蘗數(shù)、穗長、小穗數(shù)、小穗粒數(shù)、芒性等農(nóng)藝性狀對ES-24及親本阿勃和遠中4進行成株期綜合評價，結(jié)果(圖4)顯示，ES-24的株高、穗長和分蘗數(shù)明顯低于雙親，小穗數(shù)、小穗粒數(shù)和芒性與其母本阿勃相近，且其籽粒較為飽滿。表明ES-24具有矮稈、籽粒飽滿等優(yōu)良農(nóng)藝性狀,可以作為小麥育種的中間材料。

A：植株；B：穗子；C：小穗；D：籽粒；1：遠中4；2：ES-24；3：阿勃。A:Plant; B:Spike; C:Spikelet; D:Grain; 1:Yuanzhong 4; 2; ES-24; 3:Abbondanza.圖4 ES-24與其親本的農(nóng)藝性狀對比Fig.4 Comparison of agronomic traits among ES-24 and its parents

成株期條銹病鑒定結(jié)果(圖5)顯示，感病對照地方品種輝縣紅表現(xiàn)為高感(IT=4),親本阿勃表現(xiàn)為中感(IT=3)，遠中4號和中間偃麥草表現(xiàn)為免疫(IT=0)，ES-24表現(xiàn)為高抗(IT=1)。表明ES-24成株期對于條銹菌生理小種CYR32和CYR33混合小種表現(xiàn)為高抗，根據(jù)其親本的抗病性鑒定以及系譜分析，推測ES-24成株期對條銹病的抗性可能來源于其攜帶的中間偃麥草7St染色體，且中間偃麥草的7St染色體攜帶有抗條銹病基因。

a:中間偃麥草；b：遠中4；c：ES-24；d：阿勃；e：輝縣紅。a:Th.intermedium ; b:Yuanzhong 4; c:ES-24; d:Abbondanza; e:Huixianhong.圖5 ES-24 及其親本的成株期條銹病抗性表現(xiàn)Fig.5 Stripe rust resistance at adult stage of ES-24 and its parents

3 討 論

GISH和FISH分析是追蹤小麥近緣種屬與普通小麥遠緣雜交后代外來染色體或片段的準確而強大的工具[21-22]。本研究利用FISH、GISH和mc-GISH，準確而高效地鑒定出ES-24附加了一對中間偃麥草7St染色體。用Oligo-pTa535和Oligo-pSc119.2探針，通過比對ES-24與親本及中國春標準FISH核型,明確了中間偃麥草7St染色體的FISH核型，為今后中間偃麥草染色體FISH核型的揭示奠定了基礎(chǔ)。相比于傳統(tǒng)的細胞遺傳學(xué)技術(shù)，分子標記技術(shù)則可以更加方便而準確地鑒定出小麥中的外源染色體或片段的同源群歸屬[23]。本研究通過EST和PLUG分子標記鑒定，發(fā)現(xiàn)小麥第七同源群上的5個標記能在ES-24和中間偃麥草中擴增出明顯的條帶，進一步說明了ES-24的外源染色體為中間偃麥草的7St染色體。

據(jù)報道，染色體組之間的交換重組可能與遠緣雜交后代染色體組的穩(wěn)定性和適應(yīng)性有關(guān)[24]。小麥屬的亞端粒區(qū)域為染色體末端附近的可變區(qū)，它們可能通過基因組的不斷變化和不同染色體末端之間的均質(zhì)化來穩(wěn)定基因組結(jié)構(gòu)。但有關(guān)插入外源染色體以及對染色體組的進化機制尚未被證明[22-25]。本研究通過mc-GISH驗證，發(fā)現(xiàn)ES-24攜帶一對St染色體，但在St染色體末端的亞端粒區(qū)，我們也檢測到來自J染色體明亮的綠色信號，表明在進化過程中這對外源染色體與J染色體發(fā)生了小片段的易位。此易位可能發(fā)生在創(chuàng)制其父本遠中4的遠緣雜交過程中，也有可能發(fā)生在遠中4與阿勃雜交的過程中，這需要對其父本的染色體進行全面檢測。

條銹病是對小麥最具毀滅性的病害之一。本研究發(fā)現(xiàn)，ES-24成株期對于條銹菌生理小種CYR32和CYR33混合小種表現(xiàn)為高抗，推測中間偃麥草的7St染色體攜帶有抗條銹病基因，但需要進一步的研究驗證。

普通小麥與其野生近緣種屬遠緣雜交所得的二體異附加系，不僅可將所需有益基因轉(zhuǎn)移到普通栽培小麥，而且還可用于研究基因的表達、物種的進化、染色體同源關(guān)系、基因定位等，同時也是創(chuàng)制外源染色體代換系和小片段易位系的重要中間材料[26-27]。中間偃麥草作為小麥抗病育種的理想中間資源，前人對其進行了大量研究。Friebe等[28-30]發(fā)現(xiàn)，普通小麥-中間偃麥草7Ai#2(7D)和7Ai#2(7A)代換系7Ai#2染色體長臂的末端攜帶有葉銹病抗性基因Lr38，7Ai#1染色體攜帶有大麥黃矮病毒抗性基因Bdv2；另外還發(fā)現(xiàn)，在7E(J或Js)·7D代換系和7E附加系中攜帶有大麥黃矮病毒抗性基因Bdv3。Liu等[31]在T7BS·7S#3L易位系(KS12WGGRC59)中發(fā)現(xiàn)了一個新的基因wsm3，對小麥條紋花葉病毒具有抗性。本研究發(fā)現(xiàn)，ES-24成株期對條銹菌生理小種CYR32和CYR33混合小種表現(xiàn)為高抗，推測中間偃麥草的7St染色體攜帶有抗條銹病基因。本研究還發(fā)現(xiàn)，ES-24具有矮稈、籽粒飽滿等優(yōu)良性狀，且其小穗數(shù)、穗粒數(shù)和芒性都與其親本阿勃相似。所以ES-24可作為育種中間材料，將中間偃麥草7St染色體上的優(yōu)良基因?qū)氲狡胀ㄐ←湵尘爸?，?St染色體上是否具有矮稈基因還需要進一步的驗證。由于異附加系的局限性，通過60Coγ輻射，能快速、有效地引起染色體之間的變異[32]，進而創(chuàng)制染色體的代換系或易位系。因此，利用以上方法對ES-24進行處理,可以創(chuàng)制高抗條銹病的代換系或小片段易位系材料,并通過連續(xù)的回交和自交,可獲得高抗條銹病等優(yōu)良性狀的新種質(zhì)。