組蛋白去乙酰化酶在楊樹根再生和生長中的功能

張冰+夏德安+馬旭俊

摘要：組蛋白去乙?；福℉DAC）在植物生長和發(fā)育過程中具有十分重要的調(diào)控作用。目前，關(guān)于HDAC的研究主要集中在草本植物，而關(guān)于木本植物的HDAC功能研究鮮有報道。以84 K楊（銀白楊×腺毛楊）和小黑楊2種楊樹組培苗為供試材料，在培養(yǎng)基中添加0、1、5 μmol/L濃度的組蛋白去乙酰化酶抑制劑曲古抑菌素（TSA），研究TSA對楊樹根再生和生長的影響。結(jié)果表明，TSA處理明顯抑制2種楊樹根的再生和生長，TSA濃度越高，對組培苗根的再生和生長的抑制作用越大。研究結(jié)果對于通過根系改良提高楊樹對水分和營養(yǎng)物質(zhì)的利用率、增強楊樹抗逆性具有十分重要的意義。

關(guān)鍵詞：組蛋白去乙?；福℉DAC）；曲古抑菌素（TSA）；根再生；生長

中圖分類號： S792.110.5文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）05-0040-04

表觀遺傳調(diào)控是基因表達調(diào)控的一種重要方式，是在不改變DNA序列的情況下，通過DNA或組蛋白修飾來影響基因的轉(zhuǎn)錄。組蛋白修飾包括組蛋白乙?；?、磷酸化、甲基化、泛素化、糖基化等[1]，其中組蛋白乙?；茄芯康米钤?、最清楚的一種組蛋白翻譯后修飾[2]。組蛋白乙酰化修飾主要發(fā)生在組蛋白N末端的賴氨酸殘基上，包括組蛋白乙?；?、組蛋白去乙酰化2個動態(tài)的、可逆的過程。組蛋白乙?；軌驕p弱組蛋白與帶負電荷的DNA之間的相互作用，使染色質(zhì)處于伸展狀態(tài)[3]；又可以改變核小體的表面結(jié)構(gòu)，形成有利于轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子結(jié)合的位點[3-4]，進而對基因的轉(zhuǎn)錄具有促進作用。相關(guān)研究表明，在轉(zhuǎn)錄活化區(qū)域內(nèi)，組蛋白多表現(xiàn)出高度的乙?；癄顟B(tài)。組蛋白去乙?；３Ｒ鹑旧|(zhì)的凝縮，與基因轉(zhuǎn)錄抑制或基因沉默有關(guān)。組蛋白乙?；?、去乙酰化過程分別由組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶（histone acetyltransferase，簡稱HAT）、組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase，簡稱HDAC）催化完成，二者共同作用保證細胞內(nèi)組蛋白乙?；教幱趧討B(tài)平衡。HDAC是1個基因超家族，在真核生物包括真菌、植物和動物中廣泛分布。1996年第1個HDAC基因從哺乳動物細胞中得到克隆[5]，1988年在豌豆中首次發(fā)現(xiàn)植物組蛋白去乙?；傅拇嬖赱6]。近十幾年來，植物HDAC越來[CM（25]越受到重視，HDAC基因從玉米、擬南芥、水稻、大麥、馬鈴[CM）][LM]薯、葡萄、煙草等多種植物中得以鑒定和分析。根據(jù)與酵母HDAC序列同源性比較，這些植物HDAC可分為3個亞家族：RPD3/HDA1、HD2、SIR2，其中HD2是植物所特有的一類組蛋白去乙?；浮DAC在植物生長、發(fā)育、脅迫反應和基因沉默過程中具有十分重要的調(diào)控作用。

雖然相關(guān)報道不多，但在擬南芥等草本植物中的研究表明，HDAC在根系發(fā)育（包括根毛發(fā)育、側(cè)根形成和主根生長）過程中發(fā)揮著十分重要的調(diào)節(jié)作用。HDAC與根毛發(fā)育有密切關(guān)系。早在2000年，Murphy等研究發(fā)現(xiàn)，HDAC特異性抑制劑如組蛋白去乙?；敢种苿┣乓志兀╰richostatin A，簡稱TSA）、丁酸鈉（sodium butyrate）能夠抑制豌豆（Pisum sativum）根分生組織細胞的有絲分裂[7]。2005年，Xu等研究發(fā)現(xiàn)，TSA處理能夠改變根模式形成相關(guān)基因[WTBX][STBX]CPC、GL2、WER[WTBZ][STBZ]的表達，并引起根毛細胞在非根毛形成部位的出現(xiàn)和發(fā)育[8]。2011年，Zhu等研究發(fā)現(xiàn)擬南芥RPD3/HDA1亞家族另一個成員HDA6能夠抑制根發(fā)育調(diào)節(jié)因子EIN3（ethylene insensitive 3）所調(diào)節(jié)基因的表達，并抑制茉莉酸（JA）信號反應；TSA處理會誘導擬南芥幼苗產(chǎn)生大量根毛[9]。擬南芥HDA19也與根毛發(fā)育有關(guān)，HDA19促進低磷（Pi）條件下根毛的產(chǎn)生[10]。除了調(diào)節(jié)根毛發(fā)育，HDAC對側(cè)根發(fā)育也有十分重要的作用。側(cè)根的發(fā)育受到生長素以及生長素應答因子（auxin response factor，簡稱ARF）的調(diào)節(jié)。HDAC對生長素介導的擬南芥?zhèn)雀陌l(fā)育具有負調(diào)控作用[11]。在根發(fā)育過程中，生長素到達主根根尖需要生長素轉(zhuǎn)運蛋白如PIN（pin-formed）家族、ABC（ATP-binding cassette）超家族的運輸[12]。2013年，Nguyen等研究發(fā)現(xiàn)，在HDAC抑制劑如TSA、NaB存在下，PIN1蛋白被26S蛋白酶降解，導致PIN蛋白不能在根尖部位積累，進而顯著抑制了擬南芥主根的生長[13]。在水稻中，OsHDAC1與根生長有關(guān)，[WTBX][STBX]OsHDAC1[WTBZ][STBZ]基因過量表達能夠促進水稻根的生長[14]。近期的關(guān)于玉米的研究表明，HDAC抑制劑NaB處理引起玉米根分生組織細胞有絲分裂停滯在早前期，根的生長受到嚴重抑制[15]。雖然HDAC在根生長發(fā)育中的功能研究較少，但已有研究充分說明，HDAC對植物根系形成和發(fā)育十分重要。

目前，關(guān)于木本植物HDAC基因在根生長發(fā)育中的功能研究鮮有報道。楊樹在世界范圍內(nèi)廣泛分布，不僅是重要的造林和工業(yè)用材樹種，也是木本植物研究的模式植物。本研究分析了HDAC在楊樹根再生和生長過程中的功能，這一研究不僅在理論上有利于人們了解楊樹根系生長發(fā)育的表觀遺傳調(diào)控機制，而且對于通過根系改良提高楊樹對水分、營養(yǎng)物質(zhì)的利用率以及提高楊樹抗逆性具有一定的意義。

1材料與方法

1.1供試材料

本研究所用的植物材料84K楊、小黑楊無菌苗，由東北林業(yè)大學林木遺傳育種國家重點實驗室提供。

1.2試驗方法

1.2.1楊樹無菌苗的繼代培養(yǎng)84K楊、小黑楊無菌苗在WPM培養(yǎng)基上培養(yǎng)4～5周，切莖段，將含有腋芽的莖段插入WPM培養(yǎng)基上培養(yǎng)3周，至腋芽萌發(fā)、長出幼苗。然后將幼苗從莖段上切下，并放到含有0.1 mg/L IBA的WPM培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)。WPM培養(yǎng)基含有2%蔗糖、0.1 mg/L IBA、0.6%瓊脂，用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值至5.8。組培苗在溫度為（23±2）℃、光—暗周期16 h—8 h的條件下培養(yǎng)。

1.2.2楊樹幼苗的TSA處理將4～5周齡84K楊、小黑楊組培幼苗切莖段，莖段在WPM培養(yǎng)基上培養(yǎng)3周，然后將楊樹莖段上由腋芽萌發(fā)長出的幼苗用剪刀剪下，分別放在含有0、1、5 μmol/L TSA的WPM培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為（23±2）℃，光—暗周期為16 h—8 h。

1.2.3植株根長、高度的測定將84K楊、小黑楊組培幼苗在含有0、1、5 μmol/L TSA的WPM培養(yǎng)基上生根1、2周時，分別測量并記錄84K楊、小黑楊再生幼苗的主根長度、植株高度，利用Prism 6軟件對數(shù)據(jù)進行處理，并通過多重比較法分析差異顯著性。當P<0.05時，表示存在顯著性差異。

2結(jié)果與分析

2.1TSA抑制楊樹根的再生

2.1.1TSA抑制84K楊根的再生84K楊含腋芽的莖段在WPM培養(yǎng)基上培養(yǎng)3周后，腋芽長出高1.5 cm左右的幼苗；將幼苗用剪刀剪下，分別放在含有0、1、5 μmol/L TSA的WPM培養(yǎng)基上生根培養(yǎng)。生根培養(yǎng)1周時，在含有不同濃度TSA的培養(yǎng)基上再生出的不定根長度存在明顯差別（圖1）。在含有0 μmol/L TSA的培養(yǎng)基上，84K楊幼苗基部能夠再生出不定根，不定根平均長度為6.3 mm；在含有1 μmol/L TSA的培養(yǎng)基上，84K楊組培幼苗再生出的不定根平均長度為 2 mm；在含有5 μmol/L TSA的培養(yǎng)基上，84K楊組培幼苗不能再生出不定根。結(jié)果表明，TSA處理抑制不定根的再生，TSA濃度越高，對根再生的抑制作用越強。

2.1.2TSA抑制小黑楊根的再生與84K楊相似，小黑楊幼苗不定根的再生受TSA的明顯抑制。小黑楊在含有0 μmol/L TSA的WPM培養(yǎng)基上生長1周時，在幼苗

2.2TSA抑制楊樹根的生長

2.2.1TSA抑制84K楊根的生長84K楊含腋芽的莖段在WPM培養(yǎng)基上培養(yǎng)3周后，腋芽長出高1.5 cm左右的幼苗，將幼苗用剪刀剪下，分別放在含有0、1、5 μmol/L TSA的WPM培養(yǎng)基上生根培養(yǎng)。TSA處理抑制了再生根的生長，而且隨著TSA濃度的增加，其根生長受到的抑制作用越大。84K楊幼苗在含有0

2.2.2TSA抑制小黑楊根的生長小黑楊含腋芽的莖段在WPM培養(yǎng)基上培養(yǎng)3周后，腋芽萌發(fā)長出高1.5 cm左右的幼苗，將幼苗用剪刀剪下，分別放在含有0、1、5 μmol/L TSA的WPM培養(yǎng)基上生根培養(yǎng)。在含有不同濃度TSA的培養(yǎng)基上生長2周時，小黑楊再生根的根長度存在明顯差異，TSA濃度越高，根的長度越短，呈負相關(guān)趨勢。當TSA濃度為0 μmol/L時，植株根的長度平均為5.3 cm；當TSA濃度為1 μmol/L時，植株根的長度明顯比0 μmol/L處理時短小，根長平均為1.3 3結(jié)論與討論

組織培養(yǎng)是木本植物快速繁殖的一種有效方式，一些樹種在組織培養(yǎng)過程中不定芽或根的再生十分困難。通過改變培養(yǎng)基成分（如營養(yǎng)物質(zhì)或激素含量和比例）或培養(yǎng)條件（如溫度、光照度）仍不能有效獲得再生植株。因此，亟需一種方法來實現(xiàn)和提高植物的再生率。表觀遺傳學是基因表達調(diào)控的一種重要方式，對植物生是目前關(guān)于表觀遺傳調(diào)控在木本植物不定芽或根再生中的功能鮮有報道。

本研究分析了組蛋白去乙?；敢种苿㏕SA對84K楊、小黑楊2種楊樹根再生和生長的影響，結(jié)果顯示，TSA處理能夠顯著抑制這2種楊樹根的再生和生長，TSA濃度越大，根再

生和生長受到的抑制作用越大。結(jié)果表明，HDAC的存在對于楊樹根的再生、生長發(fā)育具有十分重要的調(diào)節(jié)作用，也說明楊樹根的再生、生長受表觀遺傳調(diào)控。

參考文獻：

[1]Hildmann C，Riester D，Schwienhorst A. Histone deacetylases—an important class of cellular regulators with a variety of functions[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2007，75（3）：487-497.

[2]Allfrey V，F(xiàn)aulkner R，Mirsky A. Acetylation and methylation of histones and their possible role in the regulation of RNA synthesis[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1964，51：786-794.

[3]Shahbazian M，Grunstein M. Functions of site-specific histone acetylation and deacetylation[J]. Annual Review of Biochemistry，2007，76：75-100.

[4]Berger S L. The complex language of chromatin regulation during transcription[J]. Nature，2007，447（7143）：407-412.

[5]Taunton J，Hassig C A，Schreiber S L. A mammalian histone deacetylase related to the yeast transcriptional regulator Rpd3p[J]. Science，1996，272（5260）：408-411.

[6]Sendra R，Rodrigo I，Salvador M，et al. Characterization of pea histone deacetylases[J]. Plant Molecular Biology，1988，11（6）：857-866.

[7]Murphy J，Mcaleer J，Uglialoro A，et al. Histone deacetylase inhibitors and cell proliferation in pea root meristems[J]. Phytochemistry，2000，55（1）：11-18.

[8]Xu C，Liu C，Wang Y，et al. Histone acetylation affects expression of cellular patterning genes in the Arabidopsis root epidermis[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2005，102（40）：14469-14474.

[9]Zhu Z，An F，F(xiàn)eng Y，et al. Derepression of ethylene-stabilized transcription factors （EIN3/EIL1） mediates jasmonate and ethylene signaling synergy in Arabidopsis[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2011，108（30）：12539-12544.[ZK）]

[10]Chen C，Wu K，Schmidt W. The histone deacetylase HDA19 controls root cell elongation and modulates a subset of phosphate starvation responses in Arabidopsis[J]. Scientific Reports，2015，5：15708.

[11]Fukaki H，Taniguchi N，Tasaka M. PICKLE is required for SOLITARY-ROOT/IAA14-mediated repression of ARF7 and ARF19 activity during Arabidopsis lateral root initiation[J]. The Plant Journal，2006，48（3）：380-389.

[12]Zazímalová E，Murphy A，Yang H，et al. Auxin transporters—why so many？[J]. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology，2010，2（3）：a001552.

[13]Nguyen H，Kim J，Jeong C，et al. Inhibition of histone deacetylation alters Arabidopsis root growth in response to auxin via PIN1 degradation[J]. Plant Cell Reports，2013，32（10）：1625-1636.

[14]Jang I，Pahk Y，Song S，et al. Structure and expression of the rice class-I type histone deacetylase genes [WTBX][STBX]OsHDAC1-3：OsHDAC1[WTBZ][STBZ] overexpression in transgenic plants leads to increased growth rate and altered architecture[J]. The Plant Journal，2003，33（3）：531-541.

[15]Zhang Q，Wang P，Hou H L，et al. Histone acetylation and reactive oxygen species are involved in the preprophase arrest induced by sodium butyrate in maize roots[J]. Protoplasma，2017，254（1）：167-179.