外源氨基酸的添加對恢復(fù)或預(yù)防絲狀真菌退化的研究

馬元偉， 王 榮， 高 強， 劉敏祥， 鮑大鵬， 汪 瀅

(1. 上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院 上海 201306; 2. 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 食用菌研究所， 上海 201403;3. 中國科學(xué)院 上海生命科學(xué)研究院 植物生理生態(tài)研究所， 上海 200032)

外源氨基酸的添加對恢復(fù)或預(yù)防絲狀真菌退化的研究

馬元偉1， 王 榮2， 高 強3， 劉敏祥2， 鮑大鵬2， 汪 瀅2

(1. 上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院 上海 201306; 2. 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 食用菌研究所， 上海 201403;3. 中國科學(xué)院 上海生命科學(xué)研究院 植物生理生態(tài)研究所， 上海 200032)

絲狀真菌退化是一種很普遍的現(xiàn)象，表現(xiàn)為產(chǎn)孢能力下降或喪失、毒力下降及次級代謝產(chǎn)物合成能力下降等。退化嚴(yán)重影響了許多絲狀真菌的經(jīng)濟性狀?，F(xiàn)有的絲狀真菌復(fù)壯方法過于費時費力，通過氨基酸的添加，實現(xiàn)簡單經(jīng)濟的恢復(fù)或防止絲狀真菌的退化。

絲狀真菌; 退化; 氨基酸; 復(fù)壯

絲狀真菌在人工培養(yǎng)基上經(jīng)多次繼代后常常會發(fā)生毒力降低和形態(tài)改變。形態(tài)上可以觀察到菌落顏色、生長形式發(fā)生變化即出現(xiàn)角變區(qū)域，更重要的是產(chǎn)孢能力的下降甚至喪失。人們經(jīng)常稱這種現(xiàn)象為表型退化(phenotypic degeneration)、表型不穩(wěn)定(phenotypic instability)、表型惡化(phenotypic deterioration)、雙重表型(dual phenomenon)、突變(saltation)和衰變(attenuation)[1-6]。頻繁發(fā)生的菌種退化很早就成為經(jīng)濟真菌生產(chǎn)應(yīng)用所面臨的重要問題，尤其是許多重要的經(jīng)濟真菌，如食用菌和蟲生真菌退化使生產(chǎn)蒙受巨大損失，也為菌種保藏工作帶來很大的困難。然而，人們至今對于真菌退化的原因還知之甚少，也有很多關(guān)于真菌退化機制的報道，比如轉(zhuǎn)座子隨機插入，真菌雙鏈RNA病毒的入侵或者染色體的缺失等等，但是這些原因都不能很好地回答一些問題，比如真菌退化的頻率遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過這些事件發(fā)生的概率，而且不同菌株退化頻率也不盡相同[7]。

子囊菌綠僵菌(Metarhiziumrobertsii，下簡稱綠僵菌)作為蟲生真菌，其寄主范圍可達(dá)50科，200余種昆蟲。綠僵菌具有典型的真菌侵染過程：分生孢子附著于昆蟲體表，孢子萌發(fā)并分化形成附著胞，借助各種降解酶的聯(lián)合作用而穿透昆蟲體壁，體內(nèi)形成蟲菌體而快速繁殖，由于營養(yǎng)剝奪及分泌毒素等作用而殺死害蟲[8]；蛹蟲草(Cordycepsmilitaris)為藥用真菌，具有多種藥用功效，主要依靠其產(chǎn)生大量的次生代謝活性物質(zhì)：蟲草素、多糖、蟲草酸等，它可以代替冬蟲夏草入藥。目前國內(nèi)外對蟲草屬真菌的開發(fā)利用研究比較多[9]，但是這兩種重要的真菌，在實驗室連續(xù)繼代培養(yǎng)的過程中，都存在菌株易退化的問題。

氨基酸是構(gòu)成生物體蛋白質(zhì)并同生命活動有關(guān)的最基本的物質(zhì)，是在生物體內(nèi)構(gòu)成蛋白質(zhì)分子的基本單位，與生物的生命活動有著密切的關(guān)系，是生物體內(nèi)不可缺少的營養(yǎng)成分之一。本研究以綠僵菌和蛹蟲草為實驗材料，擬通過外源添加氨基酸的方式，找到簡單有效防止絲狀真菌退化、或延緩其退化的方法。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

羅伯茨綠僵菌M.robertsiiARSEF 2575，蛹蟲草C.militaris01由中科院上海植物生理生態(tài)研究所王成樹實驗室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

改良的MM培養(yǎng)基：NaNO36 g/L, KCl 0.52 g/L, MgSO4·7H2O 0.52 g/L, KH2PO40.25 g/L, Glucose 10 g/L, CH3COONa·3H2O 8.2 g/L。PDA(BD Diagnostic Systems, Maryland, USA)、 Peptone購自生工，各種氨基酸：天冬氨酸(Aspartic acid)，組氨酸(Histidine)，蘇氨酸(Threonine)，絲氨酸(Serine)，谷氨酸(Glutamic)，脯氨酸(Proline)，甘氨酸(Glycine)，丙氨酸(Alanine)，半胱氨酸(Cysteine)，纈氨酸(Valine)，蛋氨酸(Methionine)，異亮氨酸(Isoleucine)，亮氨酸(Leucine)，酪氨酸(Tyrosine)，苯基丙氨酸(Phenylalanine)，賴氨酸(Lysine)，精氨酸(Arginine)及色氨酸(Tryptophan)均購自上海生工生物有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 退化菌株的獲得

MM平板上接種正常的羅伯茨綠僵菌M.robertsiiARSEF 2575，菌株接30個平板。繼代培養(yǎng)時，每個隨機選擇3塊正常的平板，每個平板轉(zhuǎn)接10個樣本，共3×10 個樣本，持續(xù)接種3代，每代生長30 d，觀察、轉(zhuǎn)接獲得的穩(wěn)定的角變菌株。正常的蛹蟲草C.militaris菌株，PDA培養(yǎng)基上連續(xù)傳代，25℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每組10個平板，每次3組，一代生長10 d，連續(xù)傳代10次。所有菌株25℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2.2 NBT染色實驗

150 r/min振蕩培養(yǎng)3 d的菌絲中加入過氧化氫(終濃度20 mmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，收集菌絲并用PBS緩沖液沖洗兩次，隨后取適量菌絲浸沒于0.3 mmol/L nitro blue tetrazolium (NBT)中室溫孵育20 min，加入30%的甘油終止反應(yīng)，置于光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲細(xì)胞內(nèi)活性氧的含量。

1.2.3 綠僵菌退化菌株復(fù)壯

將持續(xù)傳代獲得的退化綠僵菌菌株，轉(zhuǎn)接到MM添加不同氨基酸的平板上培養(yǎng)，氨基酸濃度的選擇參見文獻(xiàn)[10]觀察產(chǎn)孢恢復(fù)及色素變化。

1.2.4 蛹蟲草防止退化實驗

防止蛹蟲草退化實驗，正常的蛹蟲草菌株，轉(zhuǎn)接到添加1.5%的組氨酸(Histidine)和0.64%的賴氨酸(Lysine)培養(yǎng)基PDA上，25℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每組10個平板，每次3組，一代生長10 d，連續(xù)傳代10次。和沒有添加氨基酸的菌落做對比。

1.2.5 菌株產(chǎn)孢量統(tǒng)計

在PDA培養(yǎng)基上生長的菌株，25℃培養(yǎng)10 d后測量其菌落直徑，并用4 mL 0.05 % Tween 20洗脫菌株的分生孢子，吸取10 μL孢子液滴加在血球計數(shù)板上，在光學(xué)顯微鏡下計數(shù)。產(chǎn)孢量=孢子數(shù)/菌絲面積。每組實驗獨立重復(fù)3次。

圖1 綠僵菌的角變菌株(A和B)和角變菌落轉(zhuǎn)移到MM培養(yǎng)基上的不產(chǎn)孢菌落形態(tài)(C和D)

2 結(jié)果與分析

2.1 綠僵菌退化菌株的獲得

許多絲狀真菌在人工培養(yǎng)基上長期生長或者經(jīng)歷多次繼帶培養(yǎng)之后會發(fā)生菌落的退化現(xiàn)象，氣生菌絲過度生長伴隨著產(chǎn)孢量的減少。退化綠僵菌在營養(yǎng)缺乏的培養(yǎng)基上經(jīng)歷3代的轉(zhuǎn)接培養(yǎng)，就會發(fā)生平均約26.7%的角變現(xiàn)象。角變區(qū)(圖1-A、B)所示，顏色發(fā)白。將菌落的角變區(qū)打孔，轉(zhuǎn)接到MM平板上繼續(xù)培養(yǎng)10 d后觀察，菌株完全失去顏色，沒有分生孢子產(chǎn)生，并出現(xiàn)類似自溶的表型(圖1-C、D)。

為了檢驗菌絲細(xì)胞內(nèi)含有活性氧的情況，我們參考Lara-Ortiz等[11]所描述的NBT法對菌絲樣品內(nèi)ROS進(jìn)行定性測定。結(jié)果顯示，角變菌絲經(jīng)NBT還原后呈現(xiàn)出深染的藍(lán)紫色，這說明菌株清除活性氧的能力大大降低(圖2)。

圖2 NBT (nitro blue tetrazolium) 還原實驗反映細(xì)胞內(nèi)源氧化脅迫程度

氨基酸Aminoacid添加濃度Concentration(mmol/L)復(fù)壯效果Rejuvenationresult添加濃度Concentration(mmol/L)復(fù)壯效果Rejuvenationresult組氨酸Histidine0.05無None0.5邊緣產(chǎn)孢子Producedsporesontheedge天冬氨酸Asparticacid0.8無None8無None絲氨酸Serine0.3無None3無None谷氨酸Glutamic0.5無None5無None脯氨酸Proline1.3無None13無None甘氨酸Glycine1.6無None16無None丙氨酸Alanine4無None40無None半胱氨酸Cysteine2無None20無None纈氨酸Valine0.03無None0.3無None蛋氨酸Methionine0.04無None0.4無None異亮氨酸Isoleucine0.2無None2無None亮氨酸Leucine0.5無None5無None酪氨酸Tyrosine0.7無None7無None苯基丙氨酸Phenylalanine0.2無None2無None賴氨酸Lysine0.5極少的孢子Fewspores5孢子數(shù)增多Sporesincreased精氨酸Arginine0.6無None6無None色氨酸Tryptophan0.03無None0.3無None

2.2 綠僵菌退化菌株的復(fù)壯

將退化菌株轉(zhuǎn)接到添加不同氨基酸MM平板上生長10～14 d，觀察退化角變菌株的復(fù)壯，以不添加氨基酸的MM平板做對照。添加成分如表1。

觀察發(fā)現(xiàn)，退化菌株在添加了1倍氨基酸時，只有賴氨酸出現(xiàn)極少的孢子，在氨基酸量擴大到10倍后，同樣是組氨酸和賴氨酸添加出現(xiàn)孢子，但孢子數(shù)量有增加(數(shù)據(jù)未顯示)。其后，結(jié)合試驗結(jié)果，我們在MM培養(yǎng)基里同時添加1.5%的組氨酸(Histidine)和0.64%的賴氨酸(Lysine)，退化菌株的產(chǎn)孢及色素明顯恢復(fù)(圖3)。

圖3 氨基酸的添加和退化菌株的恢復(fù)

1：正常菌株；2：角變子；3：恢復(fù)菌株; P：平板培養(yǎng)，L：液體培養(yǎng)

2.3 蛹蟲草菌株防止退化實驗

正常的蛹蟲草(C.militaris)菌株，PDA培養(yǎng)基上連續(xù)傳代，25℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每組10個平板，每次3組，一代生長10 d，連續(xù)傳代10次，幾乎所有的菌株第10代出現(xiàn)明顯的產(chǎn)孢減少，菌絲色素退化的現(xiàn)象；正常的蛹蟲草(C.militaris)菌株，轉(zhuǎn)接到添加1.5%的組氨酸(Histidine)和0.64%的賴氨酸(Lysine)培養(yǎng)基PDA上，25℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每組10個平板，每次3組，一代生長10天，連續(xù)傳代10 d，產(chǎn)孢減少的量明顯降低，菌絲色素退化現(xiàn)象也明顯降低(圖4)。

圖4 傳代的蛹蟲草添加氨基酸預(yù)防退化

1-0，2-0正常菌株；1-10轉(zhuǎn)接10次沒有添加氨基酸；2-10轉(zhuǎn)接10次添加氨基酸

3 討論

絲狀真菌退化的原因多種多樣，外界環(huán)境的改變、菌株基因的突變等等，其退化的分子機理也有研究。李琳等[9]通過比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)發(fā)現(xiàn)綠僵菌中一些參與脅迫響應(yīng)和衰老相關(guān)的基因在退化菌株中顯著上調(diào)，推測退化菌株表現(xiàn)為老化現(xiàn)象。發(fā)現(xiàn)活性氧(ROS)引起的線粒體損傷是導(dǎo)致菌株退化的機制之一。其后Li等[3]以模式真菌——構(gòu)巢曲霉為對象，開展了正常菌株與退化菌株的線粒體蛋白質(zhì)組比較分析，結(jié)合不同生化試驗證明真菌退化表現(xiàn)為細(xì)胞凋亡的特征，包括線粒體呼吸能力提高、細(xì)胞色素c釋放、鈣離子濃度升高及凋亡誘導(dǎo)因子的高表達(dá)等，但退化菌株同時上調(diào)表達(dá)抗逆蛋白、抗凋亡因子及提高DNA修復(fù)能力等，因而短期內(nèi)沒有表現(xiàn)出細(xì)胞死亡現(xiàn)象。

氨基酸在生物體抗衰老方面發(fā)揮重要作用。早在2002年，Memmott的研究就發(fā)現(xiàn)，在炭疽菌(Colletotrichumtrifolii)生長的過程中添加脯氨酸，就能持續(xù)的激活菌體內(nèi)的小G蛋白Ras的表達(dá)，進(jìn)而完全逆轉(zhuǎn)菌株反常的菌絲形態(tài)以及產(chǎn)孢[12]。其后，該實驗室的Chen[13]在PNAS上發(fā)文，發(fā)現(xiàn)脯氨酸可以抑制ROS的產(chǎn)生，并且脯氨酸可以保護Ras突變細(xì)胞免受各種外界的脅迫。Eisler等[10]在酵母中的研究發(fā)現(xiàn)，基礎(chǔ)氨基酸(賴氨酸或者組氨酸)的饑餓會誘導(dǎo)酵母產(chǎn)生細(xì)胞凋亡和細(xì)胞內(nèi)的氧化壓力。

目前關(guān)于絲狀真菌復(fù)壯的方法有很多。組織分離：將退化的絲狀真菌出菇(如蘑菇類或蛹蟲草)，選擇子實體外觀健壯的，在無菌條件下重新進(jìn)行組織分離；菌絲純化與尖端菌絲分離：挑取健壯的菌絲尖端部分，進(jìn)行培養(yǎng)，以期獲得復(fù)壯的菌株；有性孢子分離篩選：選擇形態(tài)好，生長好的子實體，采用孢子收集器收集有性孢子，進(jìn)行多孢或單孢分離培養(yǎng)；獲得的單核菌絲還要與可親和的單核菌絲雜交后形成雙核菌絲，再進(jìn)行出菇實驗，才能確定獲得復(fù)壯的菌株；添加抗生素，對菌株進(jìn)行復(fù)壯[14-15]。

從以上方法中，我們可以看出都是在菌株退化后，再利用不同的方法，重新選擇。前3種方法都費時耗力，而且不能保證得到復(fù)壯的菌株；最后一種方法，雖然簡單，但要添加各種不同的抗生素，而現(xiàn)在抗生素的使用已經(jīng)得到嚴(yán)格的控制，因此也不能很好地推廣和應(yīng)用。本研究旨在尋找簡單、經(jīng)濟的延緩或預(yù)防絲狀真菌退化的方法，在絲狀真菌持續(xù)傳代或菌種保藏過程中添加一定濃度的組氨酸和賴氨酸，能很好地延緩或恢復(fù)菌株退化。本研究已經(jīng)申請發(fā)明專利(201510979555.X)。

[1]BUTT T M, GOETTEL M. Bioassays of entomopathogenic fungi.[A]//In: NAVON A and ASCHER K R S, Eds., Bioassays of Entomopathogenic Microbes and Nematodes[M]. CAB International, Wallingford, UK, 2000:141-195.

[2]KAWAKAMI K. On the change of characteristics of the silkworm muscardines through successive cultures[J]. Bulletin Sericultural Experiment Station, 1960, 16(1): 83-99.

[3]LI L, HU X, XIA Y L, et al. Linkage of oxidative stress and mitochondrial dysfunctions to spontaneous culture degeneration inAsperaillusnidulans[J]. Molecular & Cellular Proteomics, 2014, 13(2): 449-461.

[4]NAGAICH B B.Verticilliumspecies pathogenic on aphids[J]. Indian Pathol, 1973, 26(1): 163-165.

[5]IBRAHIM L, BUTT T M, JENKINSON P. Effect of artificial culture media on germination, growth, virulence and surface properties of the entomopathogenic hyphomyceteMetarhiziumanisopliae[J]. Mycological Research, 2002, 106(6): 705-715.

[6]RYAN M J, BRIDGE P D, SMITH D, et al. Phenotypic degeneration occurs during sector formation inMetarhiziumanisopliae[J]. Journal of General and Applied Microbiology, 2002, 93(1): 163-168.

[7]李 琳. 絲狀真菌退化機制的研究[D]. 上海: 中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院, 2012: 70-74.

[8]CLARKSON J M, CHARNLEY A K. New insights into the mechanisms of fungal pathogenesis in insects[J]. Trends Microbiol, 1996, 4(5): 197-203.

[9]XIONG C H, XIA Y L, ZHENG P, et al. Increasing oxidative stress tolerance and subculturing stability ofCordycepsmilitarisby overexpressing of a glutathione peroxidase gene[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2013, 97(5): 2009-2015.

[10]EISLER H, FR?HLICH K U. HEIDENREICH E. Starvation for an essential amino acid induces apoptosis and oxidative stress in yeast[J]. Experimental Cell Research, 2004, 300(2): 345-353.

[12]MEMMOTT S D, HA Y S, DICKMAN M B. Proline reverse the abnormal phenotypes ofColletotrichumtrifoliiassociated with expression of endogenous constitutively active Ras[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2002, 68(4): 1647-1651.

[13]CHEN C, DICHMAN M B. Proline suppresses apoptosis in the fungal pathogenColletotrichumtrifolii[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2005, 102(9): 3459-3464.

[14]毛 寧，柯 軼. 蛹蟲草菌株的復(fù)壯方法:中國, CN201110005899.2 [P]. 2011-6-15.

[15]陶 軍，胡亞鵬. 一種解決液體菌種營養(yǎng)液體菌性變異退化的方法：中國，CN201210593981.6 [P]. 2013-4-3.

Rejuvenation and preventing degradation of filamentous fungi by adding exogenous amino acids

MA Yuan-wei1, WANG Rong2, GAO Qiang3, LIU Min-xiang2, BAO Da-peng2, WANG Ying2

(1. College of Food Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306； 2. Institute of Edible Fungi,Shanghai Academy of Agricultural Sciences, Shanghai 201403； 3. National Key Laboratory of Plant Molecular Genetics, Institute of Plant Physiology and Ecology, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Shanghai 200032, China)

Culture degeneration of filamentous fungi frequently occurs, i.e. the reduction or complete loss of the abilities of sporulation, virulence and pigments and secondary metabolite biosynthesis, leading to great losses of fungal economic values. Existing rejuvenation method is for filamentous fungi too time-consuming, so in this study through the added amino acids, we implement a simple economic recovery or prevent the degradation of filamentous fungi.

filamentous fungi; degeneration; amino acid; rejuvenation

2016-05-18；

2016-06-03

上海市農(nóng)委青年成長計劃(2015，1-10)

馬元偉，碩士,主要從事食用菌分子育種研究，E-mail:mayuanwei2010@163.com

汪 瀅,助理研究員,從事食用菌遺傳工程研究，E-mail: wyhrx@126.com

Q935; TQ920.6

B

2095-1736(2017)02-0108-04

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2017.02.108