預(yù)過濾孔徑大小顯著影響浮游細(xì)菌群落分析結(jié)果

黃 雷， 王 欣， 裘錢琳玲， 張化俊， 姚志遠(yuǎn)， 張德民

(1. 寧波大學(xué) 海洋學(xué)院； 2. 寧波大學(xué) 醫(yī)學(xué)院， 寧波 315211)

預(yù)過濾孔徑大小顯著影響浮游細(xì)菌群落分析結(jié)果

黃 雷1， 王 欣2， 裘錢琳玲1， 張化俊1， 姚志遠(yuǎn)1， 張德民1

(1. 寧波大學(xué) 海洋學(xué)院； 2. 寧波大學(xué) 醫(yī)學(xué)院， 寧波 315211)

為探究預(yù)過濾孔徑對浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響，通過高通量測序技術(shù)，比較了100 μm(PF100)、10 μm(PF10)和2 μm(PF2)3種不同孔徑的預(yù)過濾處理后對蝦養(yǎng)殖水體浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示，PF100、PF10與PF2處理下的浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性存在顯著差異(P<0.05)，且PF100的細(xì)菌群落多樣性最高，但PF10和PF2的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性差異不顯著(P>0.05)。PF100的綠彎菌門(Chloroflexi)、浮霉菌門(Planctomycetes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)和藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria)的相對豐度顯著高于PF10和PF2(P<0.05)，相反，α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)、GN02和OD1在PF10和PF2中的相對豐度較高。相似性百分比分析(SIMPER)結(jié)果表明，腐螺旋菌科(Saprospiraceae)和黃桿菌科(Flavobacteriaceae)等12個細(xì)菌科是造成3種預(yù)過濾處理細(xì)菌群落差異的主要類群。綜上所述，預(yù)過濾孔徑大小會導(dǎo)致浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異，該結(jié)果對浮游細(xì)菌過濾方法的選擇具有一定指導(dǎo)意義。

預(yù)過濾；浮游細(xì)菌；群落組成；顆粒結(jié)合態(tài)細(xì)菌；自由態(tài)細(xì)菌

浮游細(xì)菌作為微食物環(huán)的核心和樞紐，既是水生生態(tài)系統(tǒng)營養(yǎng)物質(zhì)的分解者和轉(zhuǎn)化者，又有著物質(zhì)能量的流通和儲存功能，在生物地球化學(xué)循環(huán)中扮演著重要的角色[1]。同時，浮游細(xì)菌的群落組成和功能水平極易受到復(fù)雜的水域環(huán)境和生態(tài)關(guān)系的調(diào)控，對浮游細(xì)菌群落的深入研究有助于了解微食環(huán)各營養(yǎng)級的結(jié)構(gòu)功能和相互關(guān)系。早期浮游細(xì)菌的研究主要建立在微生物純培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，然而傳統(tǒng)培養(yǎng)方法可分離的微生物種類有限，極大地限制了人類對浮游細(xì)菌群落演替和功能轉(zhuǎn)換的認(rèn)識。高通量測序技術(shù)的出現(xiàn)突破了這種局限，極大地拓寬了浮游細(xì)菌群落研究的廣度和深度。高通量測序技術(shù)又稱“下一代測序技術(shù)”，能同時對大量DNA序列進(jìn)行分析，具有靈敏度高、可重復(fù)性高和性價比高的特點(diǎn)[2]，目前已廣泛應(yīng)用于浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及其生態(tài)功能研究中[3-5]。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與處理

樣品采自寧波市鄞州瞻岐椿霖水產(chǎn)養(yǎng)殖場(29°32′N, 121°31′E)，養(yǎng)殖場有35個規(guī)格一致的對蝦大棚養(yǎng)殖池(面積約2000 m2)，每個池投苗量為1.8×105尾/hm2。2012年5月14日，即對蝦養(yǎng)殖約30 d(蝦苗約4～5 cm)，隨機(jī)選取一個塘采集水樣。采用3 L有機(jī)玻璃采水器在池中選取4個點(diǎn)采集0.5 m深處的水樣，混合后取6 L水樣在4 h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室處理。

先用100 μm孔徑的滅菌尼龍篩初步濾去水樣中的大顆粒物質(zhì)和大型浮游植物，將濾液充分混勻后分別采用3種預(yù)過濾孔徑處理收集微生物：1)直接經(jīng)0.2 μm膜過濾收集細(xì)菌樣品，記作PF100；2)經(jīng)10 μm濾膜預(yù)過濾后，再用0.2 μm膜截留細(xì)菌，記作PF10；3)經(jīng)2 μm膜預(yù)過濾，再經(jīng)0.2 μm膜收集細(xì)菌，記作PF2。所用濾膜均為聚碳酸酯膜(Millipore, USA)，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。

1.2 DNA提取

所得濾膜經(jīng)滅菌剪刀剪碎后，采用試劑盒Power Soil?DNA kit(MOBIO, USA)提取細(xì)菌基因組DNA。DNA提取步驟參照試劑盒說明書。用NanoDrop ND 1000分光光度計(jì)(NanoDrop Technologies, USA)測定DNA濃度和純度。抽提后的DNA置80℃保存。

1.3 細(xì)菌16S rRNA基因擴(kuò)增和高通量測序

取1.2中50 ng DNA樣品作為PCR模板，擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因的V1～V3可變區(qū)[16](27F: 5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′和519R: 5′-GWATTACCGCGGCKGCTG-3′)，其中正向引物帶有10 bp的Barcode序列。PCR反應(yīng)體系總體積為50 μL，擴(kuò)增條件：94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，30個循環(huán)；72℃再延伸10 min。每個樣品設(shè)置3個PCR重復(fù)，擴(kuò)增完成后，將3個重復(fù)混合，再用PCR產(chǎn)物純化試劑盒(TaKaRa Biotech, Japan)純化，最后將每個樣品PCR產(chǎn)物等摩爾量混合，在Roche 454 GS FLX+ 平臺上測序(Roche, USA)。

1.4 測序數(shù)據(jù)處理

通過QIIME v.1.7.0平臺(Quantitative insights into microbial ecology, http://qiime.org/)對下機(jī)測序數(shù)據(jù)進(jìn)行樣品分裝、去嵌合體和質(zhì)量篩選[17]；利用UCLUST算法[18]將相似性大于97%的序列歸為同一個分類操作單元(Operational taxonomic unit, OTU)；在Greengenes[19]數(shù)據(jù)庫中比對每個OUT中豐度最高的代表序列，確定其所屬類群；使用腳本“filter_taxa_from_otu_table.py”去除葉綠體、古菌及全部樣品中只出現(xiàn)1次的序列。每個樣品隨機(jī)選取5900條序列(樣品中的最低序列數(shù))進(jìn)行后續(xù)分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

通過SPSS 16.0單因素方差分析(One-way ANOVA)比較3種預(yù)過濾孔徑下浮游細(xì)菌群落優(yōu)勢類群的差異性。在Past(v.2.03)軟件中，采用基于Bray-Curtis距離的主坐標(biāo)分析(Principal coordinates analysis, PCoA)評估細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的整體差異；利用相似性百分比分析(Similarity percentage, SIMPER)找出造成3種預(yù)過濾孔徑下細(xì)菌群落差異的關(guān)鍵細(xì)菌科目。在細(xì)菌綱水平上，用R軟件(v.3.0.0)中“pheatmap”程序包進(jìn)行細(xì)菌群落聚類分析(http://www.r-project.org)。

2 結(jié)果

2.1 不同預(yù)過濾孔徑對浮游細(xì)菌群落多樣性的影響

PF100、PF10和PF2處理后樣品浮游細(xì)菌群落的物種多度(Observed Species)、香農(nóng)指數(shù)(Shannon-Weiner)、均勻度指數(shù)(Pielou’s Evenness)和系統(tǒng)發(fā)育多樣性指數(shù)(Phylogenetic Diversity, PD)表現(xiàn)出相同的規(guī)律(圖1)：PF100的細(xì)菌多樣性顯著高于PF10和PF2的(P<0.05)，而PF10和PF2的細(xì)菌多樣性無顯著差別(P>0.05)。

圖1 不同預(yù)過濾孔徑處理的細(xì)菌群落多樣性指數(shù)

注：PF100代表經(jīng)100 μm預(yù)過濾的細(xì)菌樣品(0.2～100 μm)，PF10代表經(jīng)10 μm預(yù)過濾的細(xì)菌樣品(0.2～10 μm)，PF2代表經(jīng)2 μm預(yù)過濾的細(xì)菌樣品(0.2～2 μm)；圖中字母a,b用于表示顯著性差異，若橫軸坐標(biāo)對應(yīng)點(diǎn)出現(xiàn)不同字母，則表示有顯著差異(下同)

圖2 不同預(yù)過濾孔徑處理的主要浮游細(xì)菌類群(門/綱)的相對豐度(A. 相對豐度>5%；B. 相對豐度>1%)

2.2 不同預(yù)過濾孔徑處理后的浮游細(xì)菌群落組成

3種預(yù)過濾孔徑處理后的主要細(xì)菌類群(平均相對豐度>5%)包括：α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、GN02、綠彎菌門(Chloroflexi)、γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)和浮霉菌門(Planctomycetes)，占總細(xì)菌豐度的67.6%～82.9%(圖2-A)，其中擬桿菌門和α-變形菌綱是最主要的兩大類群，占總細(xì)菌豐度的52.6%～62.3%。此外，δ-變形菌綱(Deltaproteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、OD1和疣微菌門(Verrucomicrobia)等占比也較高(平均相對豐度>1%，圖2-B)。PF100中綠彎菌門、γ-變形菌綱、浮霉菌門、δ-變形菌綱、疣微菌門和藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria)的相對豐度顯著高于PF10和PF2(P<0.05)，但PF10和PF2中這些類群差異并不顯著(P>0.05)。PF100中的α-變形菌綱、GN02和OD1的相對豐度顯著低于PF10和PF2(P<0.05)，其中GNO2在PF10中的相對豐度顯著低于PF2(P<0.05)。

2.3 不同預(yù)過濾孔徑對浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

基于Bray-Curtis 距離的主坐標(biāo)分析(PCoA)表明，PF10和PF2沿PCoA2軸分布，它們與PF100沿PCoA1軸區(qū)分明顯(圖3)，PCoA1軸的群落變異解釋度高達(dá)88.45%。各樣品在圖中的相對距離可反映所對應(yīng)的浮游細(xì)菌群落的差異程度，結(jié)果說明PF100與PF10、PF2的群落結(jié)構(gòu)差異明顯。17個主要細(xì)菌綱(相對豐度>1%)的聚類分析結(jié)果與主坐標(biāo)分析結(jié)果類似，PF10和PF2樣品的細(xì)菌歸為一簇，PF100樣品的細(xì)菌單獨(dú)歸為一簇(圖4)。

圖3 不同預(yù)過濾孔徑處理浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主坐標(biāo)分析圖(基于Bray-Curtis距離)

2.4 造成不同預(yù)過濾孔徑處理細(xì)菌群落差異的主要類群

基于Bray-Curtis距離對3種預(yù)過濾孔徑處理后的細(xì)菌群落作SIMPER分析，得到12個差異貢獻(xiàn)率最高的細(xì)菌科(貢獻(xiàn)率>2%)，對PF100、PF10和PF2細(xì)菌群落差異的解釋度高達(dá)63.45%(圖5)。其中，腐螺旋菌科(Saprospiraceae)和黃桿菌科(Flavobacteriaceae)的群落差異貢獻(xiàn)率最高(解釋度分別為12.44%和9.34%)。在導(dǎo)致細(xì)菌群落顯著差異的細(xì)菌類群中，腐螺旋菌科、DRC31目的未知科、黃色單胞菌目(Xanthomonadales)的未知科和疣微菌科(Verrucomicrobiaceae)在PF100中的相對豐度明顯高于PF10和PF2，而黃桿菌科和噬菌弧菌科(Bacteriovoracaceae)在PF100中的相對豐度較PF10和PF2低。

圖4 不同預(yù)過濾孔徑處理的優(yōu)勢綱水平細(xì)菌類群聚類分析熱圖(相對豐度> 1%)

注：Color key表示相對豐度[經(jīng)ln(x+1)轉(zhuǎn)化]

圖5 造成不同預(yù)過濾孔徑處理細(xì)菌群落差異的關(guān)鍵科

3 討論

本研究利用16S rRNA基因焦磷酸測序技術(shù)比較研究了3種預(yù)過濾孔徑處理下浮游細(xì)菌群落的差異，測序產(chǎn)生了105 464條序列，共檢測出4155個OTUs(相當(dāng)于種屬水平)，樣品最低序列數(shù)高達(dá)5900，為深入研究預(yù)過濾孔徑與浮游細(xì)菌群落關(guān)系提供了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。雖每個樣品只有2個重復(fù)，但二者實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異很小，得出結(jié)果較為可靠。本研究結(jié)果表明預(yù)過濾孔徑大小顯著影響浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成和多樣性。

通過比較不同預(yù)過濾孔徑處理的細(xì)菌多樣性指數(shù)，我們發(fā)現(xiàn)PF100的細(xì)菌群落多樣性顯著高于PF10和PF2 (圖1)，表明養(yǎng)殖水體中大粒徑區(qū)間(10～100 μm)細(xì)菌類群豐富度高，對總細(xì)菌群落多樣性貢獻(xiàn)較大，這與Riemann等[20]研究的硅藻爆發(fā)微宇宙中細(xì)菌群落動態(tài)變化的結(jié)果相一致。此外，養(yǎng)殖水體懸浮的食物殘?jiān)蛣游锱判刮餅轭w粒結(jié)合態(tài)細(xì)菌提供了適宜的棲息環(huán)境，該類細(xì)菌經(jīng)預(yù)過濾時隨顆粒物被截留在濾膜上，也造成了PF100與PF10和PF2的部分細(xì)菌多樣性差異。我們還發(fā)現(xiàn)，PF10和PF2細(xì)菌群落多樣性差異不顯著，一方面可能是2～10 μm區(qū)間的細(xì)菌豐度較低，但更可能的原因是濾膜堵塞造成二者預(yù)過濾孔徑差異減小，由此增加了PF10和PF2細(xì)菌群落的相似性。

從浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成上看，PF10和PF2的細(xì)菌群落相似，但它們與PF100細(xì)菌群落差異較大。變形菌和擬桿菌占PF100、PF10和PF2的細(xì)菌組成的相對豐度最高(圖2)，很多研究者也認(rèn)為此二者是海洋浮游細(xì)菌的主要類群[21-22]。α-變形菌綱在PF10和PF2中的相對豐度較PF100高，說明α-變形菌集中在小粒徑區(qū)間的自由態(tài)細(xì)菌中，這與Mohit等[23]研究加拿大圣勞倫斯灣環(huán)礁湖的顆粒結(jié)合態(tài)細(xì)菌和自由態(tài)細(xì)菌的結(jié)論相一致。還有研究指出，浮霉菌[15,21]、γ-變形菌[24]、藍(lán)細(xì)菌[25]是大粒徑區(qū)間的顆粒結(jié)合態(tài)細(xì)菌的主要類群，我們也發(fā)現(xiàn)這些類群占PF100細(xì)菌群落相對豐度高于PF10和PF2。同時，藍(lán)細(xì)菌是一類好聚集生長的大型細(xì)菌[25]，過濾時易被預(yù)過濾膜截留。

目前，在顆粒結(jié)合態(tài)細(xì)菌和自由態(tài)細(xì)菌的粒徑尺寸界定上，沒有嚴(yán)格的界限，相關(guān)研究采用的過濾方法也無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。有研究者發(fā)現(xiàn)顆粒態(tài)和結(jié)合態(tài)細(xì)菌之間的群落組成差異較大[12,30]，也有研究認(rèn)為二者的群落組成相似[14,31]，造成研究結(jié)論差異的原因可能是：1)過濾方法或預(yù)過濾孔徑大小不同，導(dǎo)致收集的細(xì)菌處于不同的粒徑區(qū)間[21]；2)不同研究水域具有的優(yōu)勢細(xì)菌類群不同，水體懸浮顆粒量顯著影響顆粒結(jié)合態(tài)細(xì)菌相對豐度[24,30]。因此，顆粒結(jié)合態(tài)細(xì)菌和自由態(tài)細(xì)菌研究應(yīng)考慮特定研究水域和測序技術(shù)等因素，同時采用統(tǒng)一的粒徑界定尺度和過濾方法也是必要的。

綜上所述，不同預(yù)過濾孔徑處理下浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成存在顯著差異，小孔徑預(yù)過濾孔徑處理顯著降低了細(xì)菌群落的多樣性。造成3種預(yù)過濾孔徑處理細(xì)菌群落差異的主要類群有腐螺旋菌科和黃桿菌科等12個細(xì)菌科目。該結(jié)果為浮游細(xì)菌過濾方法的選擇提供參考依據(jù)，對顆粒結(jié)合態(tài)細(xì)菌和自由態(tài)細(xì)菌研究具有一定的意義。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果主要針對養(yǎng)殖水體環(huán)境，該結(jié)論對其他特定水域是否完全適用，有待進(jìn)一步研究。

[1]MADONI P, BRAGHIROLI S. Changes in the ciliate assemblage along a fluvial system related to physical, chemical and geomorphological characteristics[J]. European Journal of Protistology, 2007, 43(2): 67-75.

[2]秦 楠, 栗東芳, 楊瑞馥. 高通量測序技術(shù)及其在微生物學(xué)研究中的應(yīng)用[J]. 微生物學(xué)報(bào), 2011, 51(4): 445-457.

[3]GANESH S, PARRIS D J, DELONG E F, et al. Metagenomic analysis of size-fractionated picoplankton in a marine oxygen minimum zone[J]. The ISME Journal, 2014, 8(1): 187-211.

[4]CAPORASO J G, LAUBER C L, WALTERS W A, et al. Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2011, 108(Suppl 1): 4516-4522.

[5]WANG K, YE X, CHEN H, et al. Bacterial biogeography in the coastal waters of northern Zhejiang, East China Sea is highly controlled by spatially structured environmental gradients[J]. Environmental Microbiology, 2015, 17(10): 3898-3913.

[6]CRUMP B C, ARMBRUST E V, BAROSS J A. Phylogenetic analysis of particle-attached and free-living bacterial communities in the Columbia River, its estuary, and the adjacent coastal ocean[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1999, 65(7): 3192-3204.

[7]WANG K, ZHANG D, XIONG J, et al. Response of bacterioplankton communities to cadmium exposure in coastal water microcosms with high temporal variability[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2015, 81(1): 231-240.

[8]ARNOSTI C, FUCHS B M, AMANN R, et al. Contrasting extracellular enzyme activities of particle-associated bacteria from distinct provinces of the North Atlantic Ocean[J]. Front in Microbiol, 2012, 3:425.

[9]SATINSKY B M, FORTUNATO C S, DOHERTY M, et al. Metagenomic and metatranscriptomic inventories of the lower Amazon River, May 2011[J]. Microbiome, 2015, 3: 39.

[10]NAGATA T. Carbon and nitrogen content of natural planktonic bacteria[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1986, 52(1): 28-32.

[11]KNEFELKAMP B, CARSTENS K, WILTSHIRE K H. Comparison of different filter types on chlorophyll-a retention and nutrient measurements[J]. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology, 2007, 345(1): 61-70.

[12]PADILLA C C, GANESH S, GANTT S, et al. Standard filtration practices may significantly distort planktonic microbial diversity estimates[J]. Frontiers in Microbiology, 2015, 6:547.

[13]GHIGLIONE J F, MEVEL G, PUJO-PAY M, et al. Diel and seasonal variations in abundance, activity, and community structure of particle-attached and free-living bacteria in NW Mediterranean Sea[J]. Microbial Ecology, 2007, 54(2): 217-231.

[14]RIEMANN L, WINDING A. Community dynamics of free-living and particle-associated bacterial assemblages during a freshwater phytoplankton bloom[J]. Microbial Ecology, 2001, 42(3): 274-285.

[16]KIM M, MORRISON M, YU Z. Evaluation of different partial 16S rRNA gene sequence regions for phylogenetic analysis of microbiomes[J]. Journal of Microbiological Methods, 2011, 84(1): 81-87.

[17]CAPORASO J G, KUCZYNSKI J, STOMBAUGH J, et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data[J]. Nature Methods, 2010, 7(5): 335-336.

[18]EDGAR R C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST[J]. Bioinformatics, 2010, 26(19): 2460-2461.

[19]DESANTIS T Z, HUGENHOLTZ P, LARSEN N, et al. Greengenes, a chimera-checked 16S rRNA gene database and workbench compatible with ARB[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2006, 72(7): 5069-5072.

[20]RIEMANN L, STEWARD G F, AZAM F. Dynamics of bacterial community composition and activity during a mesocosm diatom bloom[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2000, 66(2): 578-587.

[21]TANG X, LI L, SHAO K, et al. Pyrosequencing analysis of free-living and attached bacterial communities in Meiliang Bay, Lake Taihu, a large eutrophic shallow lake in China[J]. Canadian Journal of Microbiology, 2015, 61(1): 22-31.

[22]SMITH M W, ALLEN L Z, ALLEN A E, et al. Contrasting genomic properties of free-living and particle-attached microbial assemblages within a coastal ecosystem[J]. Front Microbiol, 2013, 4:120.

[23]MOHIT V, ARCHAMBAULT P, TOUPOINT N, et al. Phylogenetic differences in attached and free-living bacterial communities in a temperate coastal lagoon during summer, revealed via high-throughput 16S rRNA gene sequencing[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2014, 80(7): 2071-2083.

[25]R SEL S, ALLGAIER M, GROSSART H P. Long-term characterization of free-living and particle-associated bacterial communities in Lake Tiefwaren reveals distinct seasonal patterns[J]. Microbial Ecology, 2012, 64(3): 571-583.

[26]秦 偉, 周 鑫, 徐增洪, 等. 不同放養(yǎng)密度和水草覆蓋率下克氏原螯蝦池塘底泥中微生物群落特征[J]. 水產(chǎn)科學(xué), 2015, 34(10): 621-628.

[27]CHON K, KIM Y, CHANG N I, et al. Evaluating wastewater stabilizing constructed wetland, through diversity and abundance of the nitrite reductase gene nirS, with regard to nitrogen control[J]. Desalination, 2010, 264(3): 201-205.

[28]胡錢東, 林 強(qiáng), 石存斌, 等. 約氏黃桿菌研究進(jìn)展[J]. 生命科學(xué)研究, 2014, 18(1): 60-65.

[29]STAPLES D G, FRY J C. Factors which influence the enumeration ofBdellovibriobacteriovorusin sewage and river water[J]. Journal of Applied Bacteriology, 1973, 36(1): 1-11.

[30]ZHANG R, LIU B, LAU S C K, et al. Particle-attached and free-living bacterial communities in a contrasting marine environment: Victoria Harbor, Hong Kong[J]. FEMS Microbiology Ecology, 2007, 61(3): 496-508.

[31]HOLLIBAUGH J T, WONG P S, MURRELL M C. Similarity of particle-associated and free-living bacterial communities in northern San Francisco Bay, California[J]. Aquatic Microbial Ecology, 2000, 21(2): 103-114.

Effect of pre-filtering pore-size significantly on the results of the analysis of planktonic bacterial communities

HUANG Lei1, WANG Xin2, QIU Qian-linglin1, ZHANG Hua-jun1,YAO Zhi-yuan1, ZHANG De-min1

(1. School of Marine Sciences; 2. Medical School, Ningbo University, Ningbo 315211, China)

To study the effect of different pre-filtering pore-size on planktonic bacterial community compositions (BCCs), BCCs collected by three filtering methods (10 μm pre-filtering, 2 μm pre-filtering, and without pre-filtering) were compared through high-throughput sequencing. The result showed that BCCs were similar between 10 μm pre-filtering (PF10) and 2 μm pre-filtering (PF2), while they were significantly different with those without filtering (PF100). The alpha diversity of PF100 samples was the highest among all the treatments. Compared with PF10 and PF2, the relative abundances of Chloroflexi, Planctomycetes, Verrucomicrobia and Cyanobacteria were significantly higher in PF100 samples (P< 0.05), while those of Alphaproteobacteria, GN02 and OD1 were lower. Similarity percentage (SIMPER) analysis indicated that 12 families cumulatively contributed to 63.45% dissimilarity of the BCCs. In conclusion, the different pre-filtering pore-size could induce the bias of planktonic bacterial community structure. The results have an important guiding significance in selecting the planktonic bacteria filtration method.

pre-filtering; bacterioplankton; community composition; particle-attached bacteria; free-living bacteria

2016-04-15；

2016-05-03

國家“863”高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃 (2012AA092001)

黃 雷，碩士研究生，主要從事養(yǎng)殖環(huán)境生態(tài)學(xué)研究，E-mail: huanglein@sina.com

王 欣，實(shí)驗(yàn)師，主要從事環(huán)境微生物學(xué)研究，E-mail: wangxin@nbu.edu.cn

Q938.8

A

2095-1736(2017)02-0050-05

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2017.02.050