熱休克蛋白70-甲胎蛋白抗原表位肽疫苗抗小鼠H22肝癌細胞免疫機制的研究

胥 冰, 王巧俠， 王小平, 藺煥萍, 馬曉軍, 張鵬飛, 趙 倩, 張克佩

(1. 陜西中醫(yī)藥大學 免疫及檢驗學教研室， 咸陽 712046； 2. 西安市中心醫(yī)院 感染科， 西安 710003)

熱休克蛋白70-甲胎蛋白抗原表位肽疫苗抗小鼠H22肝癌細胞免疫機制的研究

胥 冰1, 王巧俠2， 王小平1, 藺煥萍1, 馬曉軍1, 張鵬飛1, 趙 倩1, 張克佩1

(1. 陜西中醫(yī)藥大學 免疫及檢驗學教研室， 咸陽 712046； 2. 西安市中心醫(yī)院 感染科， 西安 710003)

分別以AFP多肽、HSP70 和HSP70-AFP多肽復合物免疫小鼠，檢測各組CD8+T細胞培養(yǎng)上清IFN-γ、TNF-α、穿孔素、顆粒酶B水平及CD8+T細胞對H22細胞的殺傷作用，探討熱休克蛋白70(HSP70)-甲胎蛋白(AFP)抗原表位肽復合物對小鼠H22肝癌細胞的免疫效應(yīng)。

甲胎蛋白 (AFP)；熱休克蛋白70( HSP70)；多肽疫苗；抗瘤免疫

肝癌治療主要采用放、化療及手術(shù)，但均因其副作用大，術(shù)后3年存活率低而達不到理想的療效。近年來以甲胎蛋白(AFP)為靶點的腫瘤疫苗的研發(fā)備受關(guān)注。AFP是腫瘤相關(guān)抗原，胚胎肝細胞的一種糖蛋白，胚胎期高表達，出生后低表達，當肝細胞癌變后AFP表達升高[1]，70%的原發(fā)性肝癌病人可出現(xiàn)AFP高表達。研究表明甲胎蛋白存在不同的抗原表位，可為肝細胞癌的免疫治療提供解決問題的途徑[2-3]。但AFP在患者體內(nèi)不能有效地被遞呈從而激活免疫細胞，如何增強AFP的免疫原性，使免疫細胞能有效對其識別，才是解決問題的關(guān)鍵。應(yīng)用AFP核酸疫苗，基因重組AFP載體介導DC細胞免疫等[4-6]，依然不能有效增強AFP的免疫原性。另一簡便而有效的方法即應(yīng)用免疫佐劑，已證實熱休克蛋白70具有良好的“免疫佐劑”效應(yīng)，能與不同的腫瘤抗原肽結(jié)合誘發(fā)腫瘤特異性主動免疫。尤其對于抗原弱或難以誘發(fā)免疫的抗原，HSP70呈現(xiàn)了良好的內(nèi)在免疫佐劑效應(yīng)[7-9]。本實驗將AFP表位肽與佐劑HSP70結(jié)合形成重組疫苗免疫小鼠, 觀察荷瘤小鼠在重組疫苗誘導下產(chǎn)生針對AFP腫瘤，特異性細胞免疫的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

40只6～8周齡健康C57BL/6小鼠(雌性)，體質(zhì)量(20±2)g。由西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心提供，動物許可證號: SCXK(陜) 2007-001；小鼠H22肝癌細胞株購自第四軍醫(yī)大學動物實驗中心。MTT、純化熱休克蛋白70及淋巴細胞分離液(Sigma)；胎牛血清及RPMI1640培養(yǎng)液(Hyclone)；ELISA檢測試劑盒及免疫磁珠MicroBead CD8+T細胞分選抗(Miltenyi Biotec)；PHA(BD Biosciences)；Shanghai Ziyu Biotechnology 公司合成AFP表位肽-FMNKFIYEI 9個氨基酸寡肽，HSP70-AFP表位肽復合物則通過氨基酸偶聯(lián)法將熱休克蛋白70羧基端與AFP表位肽氨基端相連，高效液相色譜純化凍干粉，-20℃保存。超凈工作臺( 蘇州凈化)；RT-2100C型酶聯(lián)免疫檢測儀(深圳雷杜科技有限公司)；二氧化碳培養(yǎng)箱(BindCD -150)；倒置顯微鏡(奧特BDS-200)；全自動高壓蒸汽滅菌器(日本三洋MLS-3780)；電子精密分析天平(塞多利斯)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及擴增

于含10%胎牛血清及雙抗(100 U/青霉素、100 U/鏈霉素)的RPMI1640培養(yǎng)液中接種H22肝癌細胞，并于37℃，5% CO2飽和濕度擴增培養(yǎng)，臺盼藍染色檢測細胞活力備用。

1.2.2 腫瘤模型小鼠的建立及體內(nèi)腫瘤負荷實驗

40只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后隨機分為：HSP70-AFP多肽疫苗組、HSP70組、AFP組、模型組。將擴增后的H22肝癌細胞制備成細胞懸液，密度為2×105/mL，接種于小鼠前肢右腋下，接種量為0.1 mL/只。3 d后，分別用生理鹽水將HSP70-AFP多肽疫苗、AFP、HSP70稀釋至1 μg /μL, 接種于小鼠右上肢腋下皮內(nèi)0.1 mL/只，相當于10 μg/只劑量，于模型組同側(cè)注射等量無菌生理鹽水。首次免疫后，每隔1周等量、同法重復免疫1次，共3次。觀察小鼠生存及體內(nèi)腫瘤生長情況，每周3次測量實體瘤塊大小并取均值，按照公式:4/3πr3(r表示半徑)計算瘤塊體積。

1.2.3 小鼠脾臟單個核細胞(PBMC)的分離

末次免疫后3 d處死全部小鼠，超凈工作臺取脾臟，滅菌生理鹽水沖洗2次，剪碎并用無菌勻漿器研磨，200目無菌濾網(wǎng)過濾得濾液1 mL，( Ficoll-Hypaque法)用淋巴細胞分離液分離得PBMC，備用。

1.2.4 CD8+T細胞分選純化-免疫磁珠分離法(MACS)

將各組PBMC計數(shù)，離心(1500 r/min,10 min)棄上清，每107細胞重懸于40 μL緩沖液中(PBS，含0.5%EDTA，0.5%小牛血清)，加10 μL CD8+T 細胞生物素標記抗體混勻，5 min，4℃ 孵育，再將20 μL抗生物素磁珠加入其中混勻，4℃ 孵育10 min。將分離柱置分選器上，以3 mL無菌PBS緩沖液漂洗分離柱，用已被磁珠標記的細胞懸液過柱；收集流出的未標記細胞，備用。再以3 mL PBS緩沖液洗柱，繼續(xù)收集流過液，其中即含所需CD8+T細胞[10-11]。流式細胞儀檢測細胞純化率。

1.2.5 CD8+T細胞的體外擴增培養(yǎng)

經(jīng)流式細胞技術(shù)檢測CD8+T細胞純度達90%以上，將細胞置10%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)液內(nèi)含PHA 5 μg/mL培養(yǎng)12 h, 37℃，5% CO2飽和濕度條件下繼續(xù)擴增培養(yǎng)3 d，離心留上清，得沉淀細胞計數(shù)，調(diào)整細胞密度為5×106個/mL，備用。

1.2.6 檢測小鼠CD8+T淋巴細胞培養(yǎng)上清TNF-α、穿孔素、IFN-γ、顆粒酶水平(ELISA)

參照TNF-α、穿孔素等ELISA試劑盒說明操作，檢測上述離心上清液TNF-α、穿孔素、IFN-γ及顆粒酶的水平。

1.2.7 CD8+T淋巴細胞對H22肝癌細胞的殺傷作用

將擴增72 h的H22肝癌細胞，調(diào)整密度為5×104個/mL，于96孔細胞培養(yǎng)板接種培養(yǎng)，100 μL/孔。24 h后離心培養(yǎng)板，1000 r/min ，10 min，棄上清，即靶細胞。將體外擴增培養(yǎng)的CD8+T細胞，作為效應(yīng)細胞加入相應(yīng)的靶細胞孔中(效應(yīng)細胞:靶細胞分別為10∶1、20∶1、40∶1)，每孔加入10 μL 5 mg/mL MTT 液; 每組設(shè)3個復孔，37℃孵育4 h。去除培養(yǎng)液，加DMSO 150 μL/孔，置振蕩器37℃振蕩10 min，充分溶解結(jié)晶；酶標儀測各孔光密度值(波長490 nm)。計算細胞存活百分率(實驗組D490 nm平均值/對照組D490 nm平均值×100%)。

1.2.8 統(tǒng)計學分析

SPSS 10.0軟件包進行統(tǒng)計分析。使用Student- Newm an-Keuls方法及方差分析進行數(shù)據(jù)間比較,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠體內(nèi)腫瘤負荷實驗結(jié)果

于各組小鼠接種H22肝癌細胞后，觀察小鼠生存及體內(nèi)腫瘤生長情況。發(fā)現(xiàn)HSP70-AFP多肽疫苗組較其他組動物食量好、活動自如、毛色光澤度好。30 d后空白組全部死亡；AFP組死亡6只；HSP70組死亡8只；HSP70-AFP組死亡3只，其余存活。證明HSP70-AFP多肽疫苗組保護效應(yīng)較其他組明顯(P<0.01)，且該組瘤塊體積明顯偏小(P<0.01)，具體結(jié)果見表1。

表1 各組小鼠接種H22細胞后瘤塊體積比較

a:P<0.01,vs empty group； b:P<0.01, vs AFP group； c:P>0.05,vs empty group； the same below

2.2 流式細胞技術(shù)檢測CD8+T細胞純度

磁珠分離所得CD8+T淋巴細胞經(jīng)流式細胞儀檢測其純度高達90%，見圖1。

圖1 流式細胞儀檢測各免疫組小鼠CD8+T淋巴細胞的純化

A:HSP70-AFP組純化的CD8+T 淋巴細胞; B: HSP70組純化的CD8+T 淋巴細胞; C: AFP組純化的CD8+T 淋巴細胞; D:空白組純化的CD8+T 淋巴細胞

2.3 小鼠CD8+T淋巴細胞培養(yǎng)上清IFN-γ、TNF-α、穿孔素及顆粒酶B水平

HSP70-AFP多肽疫苗組小鼠CD8+T淋巴細胞培養(yǎng)上清中IFN-γ、TNF-α、穿孔素、顆粒酶B水平較其他組明顯升高, 具體結(jié)果見表2。

2.4 CD8+T淋巴細胞對靶細胞(H22)的殺傷作用

HSP70-AFP多肽疫苗組小鼠CD8+T細胞對小鼠H22肝癌細胞殺傷效應(yīng)均高于其他各組(P<0.01), 見圖2。

表2 CD8+T淋巴細胞培養(yǎng)上清TNF-α、穿孔素、IFN-γ、顆粒酶B

GroupsHSP70-AFPHSP70AFPEmptyTNF-α470.35±14.25a,b178.35±8.15c177.56±7.98c164.31±9.46穿孔素235.47±17.38a,b121.62±7.53c124.25±6.27c115.65±9.75IFN-γ436.37±11.24a,b179.57±7.69c186.48±8.62c168.42±10.52顆粒酶B105.34±12.26a,b60.57±7.69c62.48±8.62c56.42±10.52

圖2 各免疫組小鼠CD8+T淋巴細胞對小鼠H22肝癌細胞的毒性作用

Fig 2 Cytotoxicity effect of various mice splenic lymphocyte cells against mice hepatocellular carcinoma cell H22

效應(yīng)細胞∶靶細胞分別為10∶1、20∶1、40∶1

3 討論

腫瘤免疫治療具有高效性及毒副作用小等特點，并能啟動或重啟獨立腫瘤免疫反應(yīng)，同時自身組織細胞不受損傷。AFP作為肝癌的相關(guān)性抗原能促進肝癌細胞增殖，因此成為肝癌免疫治療的新靶點。因AFP在胚胎期生成，機體對其產(chǎn)生了一定的免疫耐受，無法啟動強免疫應(yīng)答[12]。因此，本課題組前期熱休克蛋白(HSP)作為佐劑，應(yīng)用戊二醛交聯(lián)法構(gòu)建的HSP72-AFP復合物蛋白免疫小鼠，已證實不僅可增強AFP免疫原性，且針對AFP表達的腫瘤產(chǎn)生了較好的免疫效應(yīng)[13]。

此次用氨基酸偶聯(lián)法構(gòu)建HSP70-AFP多肽重組疫苗免疫小鼠, 證實了此法重組疫苗的免疫效果更好。與戊二醛偶聯(lián)法相比較，氨基酸偶聯(lián)法減少了因戊二醛偶聯(lián)對蛋白分子抗原表位的遮蓋和破壞，利于保持蛋白多肽的功能結(jié)構(gòu)，最大程度地保持表位肽的活性[14]，直接將抗原表位肽偶聯(lián)于HSP70，可促進抗原的提呈，從而活化效應(yīng)細胞發(fā)揮殺瘤效應(yīng)[15]，研究結(jié)果也證實了氨基酸偶聯(lián)法構(gòu)建的HSP70-AFP表位肽疫苗相較戊二醛偶聯(lián)法，誘導了較強的免疫攻擊效應(yīng)，并活化CD8+T細胞而釋放了較高水平的細胞因子，體外淋巴細胞毒實驗進一步證實重組蛋白疫苗對小鼠肝癌細胞殺傷率達60%。Lan等[16]將AFP與HSP70在基因水平重組構(gòu)建真核表達載體，進行在體小鼠的實驗證實可誘導針對AFP表達腫瘤一定的免疫效應(yīng)，相較于氨基酸偶聯(lián)法，基因水平構(gòu)建的DNA疫苗表達量較少，產(chǎn)生的免疫效應(yīng)相對有限，結(jié)合基因疫苗的安全性，產(chǎn)物的穩(wěn)定性以及復雜的載體操作技術(shù)限制了基因疫苗的進一步實驗研究。在本研究中應(yīng)用了簡便的氨基酸偶聯(lián)法構(gòu)建了蛋白多肽疫苗，此方法簡單，合成量多，產(chǎn)物穩(wěn)定，直接將HSP70和AFP抗原表位肽偶聯(lián)利于抗原的提呈和活化效應(yīng)細胞，體內(nèi)外細胞毒性實驗研究進一步證實了氨基酸偶聯(lián)法重構(gòu)HSP70-AFP表位肽疫苗能更有效地誘導特異性的CTL效應(yīng)攻擊肝癌細胞。

此外，體內(nèi)腫瘤負荷實驗進一步證實重組疫苗組小鼠荷瘤發(fā)生率低，生存時間較其他組顯著延長，瘤塊體積偏小。通過對CD8+T淋巴細胞培養(yǎng)上清中TNF-α及穿孔素等細胞因子水平的檢測，發(fā)現(xiàn)重組疫苗組各指標均明顯升高，研究報道經(jīng)DC活化的AFP特異性T淋巴細胞能上調(diào)多種細胞因子含量，如：IL-2、IFN-γ、TNF-α、顆粒酶和穿孔素等，而具有顯著的體內(nèi)外抗腫瘤免疫活性[17]，與本研究相佐證。本研究結(jié)果提示HSP70能有效地增強AFP的免疫原性,且經(jīng)多肽疫苗連續(xù)免疫小鼠后，其體內(nèi)產(chǎn)生了針對AFP抗原的有效殺傷瘤細胞的保護性細胞免疫反應(yīng),，延長了荷瘤小鼠的生存時間，為腫瘤疫苗的前期臨床研究提供了重要的理論依據(jù)。

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Study of anti-tumor immunity elicited by peptides complex- heat shock protein 70 and alpha-fetoprotein epitope peptide

XU Bing1, WANG Qiao-xia2, WANG Xiao-ping1, LIN Huan-ping1,MA Xiao-jun1, ZHANG Peng-fei1, ZHAO Qian1, ZHANG Ke-pei1

(1. Immunology and the Science of Inspection Teaching and Research Section, Shaanxi University of Chinese Medicine,Xianyang 712046； 2. Department of Infectious Disease, Xi′an Central Hospital, Xi′an 710003, China)

To study anti-tumor immunity mechanism induced by a reconstructed peptide complex-heat shock protein 70 (HSP70) and alpha-fetoprotein (AFP), mice were immunized with recombinant peptide vaccine HSP70-AFP-P, whereas AFP peptide or HSP70 vaccination as controls. IFN-γ, TNF-α and granzyme-B, perforin-produced by separated CD8+T cells from vaccinated mice were detected with ELISA, respectively. In vivo tumor loaded test was exerted to evaluate the immune effect of the peptide vaccine. The study suggested that sequential immunization with HSP70-AFP peptide vaccine could bring about effective AFP-specific CD8+T cell responses and elicit specific antitumor immunity on AFP-producing tumors.

alpha-fetoprotein(AFP); heat shock protein 70 (HSP70); peptide vaccine; tumor immunity

2016-04-14；

2016-05-25

國家自然科學基金(No.81172135)；陜西省自然科學基礎(chǔ)研究項目(No.2016JM8023，2016JM8150)；陜西省教育廳自然科學基礎(chǔ)研究項目( No.07JK233，14JS025)

胥冰，碩士，副教授，主要從事分子免疫學研究工作,E-mail：xubing-95@163.com

王巧俠，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事消化系統(tǒng)疾病臨床與基礎(chǔ)研究，E-mail: 894449620@qq.com； 王小平，博士，教授，碩士生導師, 主要從事腫瘤分子免疫病理學研究,E-mail:120145557@qq.com

R730.51

A

2095-1736(2017)02-0046-04

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2017.02.046