瓜蔞皮注射液中化學成分的UPLC/ESI-QTOF-MS分析

王輝俊+柯櫻+葉冠

摘 要 目的：UPLC/ESI-QTOF-MS法鑒定瓜蔞皮注射液中的化學成分。方法：Waters Acquity UPLC HSS T3色譜柱（2.1 mm× 100 mm， 1.8 μm），以水（A） 和乙腈 （B） 為流動相進行梯度洗脫。采用電噴霧離子源（ESI），正、負兩種模式結合MSE技術測定。所得分子量及碎片信息與文獻或已知數據庫比對，鑒定化合物的結構。結果：在正負離子模式下，共鑒別出瓜蔞皮注射液化學成分19個，包括7個氨基酸、4個核苷酸、5個黃酮、1個多肽、1個唾液酸和1個含氮化合物。結論：建立了一種基于UPLC/ESI-QTOF-MS的對瓜蔞皮注射液化學成分快速鑒別的分析方法，為闡明瓜蔞皮注射液的化學物質基礎提供依據。

關鍵詞 瓜蔞皮注射液 UPLC/ESI-QTOF-MS 化學物質基礎

中圖分類號：R286 文獻標識碼：A 文章編號：1006-1533（2017）05-0060-06

UPLC/ESI-QTOF-MS Analysis of Chemical Constituents in Gualoupi Injection*

WANG Huijun**， KE Ying， YE Guan***

（Shanghai Pharmaceuticals Holding Co. Ltd.， Shanghai 201203， China）

ABSTRACT Objective： To identify chemical compositions in Gualoupi injection. Methods： A method based on UPLC/ ESI-QTOF-MS combined with an automated MSE technique was successfully established and UPLC/ESI-QTOF-MS was performed with a column of Waters Acquity UPLC HSS T3 （2.1 mm × 100 mm， 1.8 μm） and a mobile phase consisted of water（phase A） and acetonitrile （phase B） by gradient elution. The detected peaks were identified by their elemental compositions or comparing MSE data with the literatures or public online databases. Results： A total of 19 compounds including 7 amino acids， 4 nucleic acids， 5 flavonoids， 1 peptide， 1 sialic acid and 1 nitrogen-containing compound were identified from Gualoupi injection at positive and negative ion models. Conclusion： A rapid and efficient method for studying the chemical constituents of Gualoupi injection by UPLC/ESI-QTOF-MS was established， which can lay the foundation for the substance basis study of Gualoupi injection.

KEY WORDS Gualoupi injection； UPLC/ESI-QTOF-MS； chemical substance basis

瓜蔞皮（Trichosanthis pericarpium）為葫蘆科栝樓屬植物栝樓（Trichosanthes kirilowii Maxim）或雙邊栝樓（Trichosanthes rosthorinii Harms）的干燥成熟果皮[1]。瓜蔞皮注射液為上藥集團旗下上海第一生化藥業(yè)有限公司獨家產品，是以瓜蔞皮為原料，經水提醇沉，再經過離子交換樹脂洗脫而制成的滅菌水溶液，臨床上用于冠心病、穩(wěn)定型心絞痛的治療[2-6]，具有行氣除滿，開胸除痹之功效。瓜蔞皮注射液臨床應用廣泛，但物質基礎尚不明確，目前僅測定與功能主治無關的精氨酸作為含量檢測標準[7]，現有的研究也僅僅停留在研究瓜蔞皮總提取物的藥理活性上。鑒于瓜蔞皮注射液的活性成分及作用機制研究還屬空白，本文將UPLC/ESI-QTOF-MS法與MSE技術結合，通過精確分子量、碎片離子、色譜行為和文獻數據庫信息鑒定了瓜蔞皮注射液中的一些化學成分，為闡明瓜蔞皮注射液的化學物質基礎提供依據。

1 材料和方法

1.1 材料

瓜蔞皮注射液（上海醫(yī)藥集團股份有限公司上海第一生化藥業(yè)有限公司提供，4 ml/支，批號1410408），水為超純水（實驗室自制）；HPLC級乙腈購自德國 Merck公司；其他的試劑均為分析純。

1.2 儀器

Waters Acquity Ultra-Performance LC-Synapt G2 quadrupole time-of-flight （Q/TOF） 液質聯用儀（美國Waters公司），配備ESI離子源以及Q-TOF四級桿-飛行時間質譜檢測器，通過MassLynx 4.1數據分析軟件對儀器進行控制和信息采集；SECURA225D型電子天平（德國賽多利斯）；Reference系列超純水制備儀（美國密理博）；KQ-5200V型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.3 UPLC/ESI-QTOF-MS分析

1.3.1 供試品溶液的制備

取瓜蔞皮注射液20 μl加入980 μl超純水渦旋混勻，并用0.22 μm微孔濾膜濾過備用，作為供試品溶液。

1.3.2 儀器分析條件

1）色譜條件 色譜柱：Waters Acquity UPLC HSS T3色譜柱（2.1 mm ×100 mm，1.8 μm），配有預柱Waters Acquity HSS T3 VanGuard（2.1 mm × 5 mm，1.8 μm）；柱溫：45 ℃；流速：0.3 ml/min；進樣量：5 μl；以水（A） 和乙腈 （B） 為流動相進行梯度洗脫（表1）。

2）質譜條件 采用電噴霧離子源（ESI），正、負離子兩種模式測定，各參數分別為：毛細管電壓-2.5 kV（ESI-）， +3 kV （ESI+）；錐孔電壓-25 V（ESI-） ，+30 V（ESI+）；離子源溫度120 ℃；脫溶劑氣溫度350 ℃；錐孔氣流量50 L/h；脫溶劑氣（N2）流速600 L/h；氬氣作為碰撞氣體；質量數檢測范圍50～1500 Da，低碰撞能量通道：4 eV；高碰撞能量通道：10～30 eV能量梯度。檢測過程中通過lock spray將2 ng/ml的亮氨酸-腦啡肽溶液噴射進入離子源以校正儀器精確分子量（流速5 μl/min），負離子模式下其精確分子量為m/z 554.261 5 [M-H]-，正離子模式下的精確分子量為m/z 556.277 1 [M+H]+。

1.3.3 在線公共數據庫

化合物查閱所用的在線公共數據庫如下：ChemSpider[8]；SciFinder Scholar[9]；Riken[10]；PubChem[11]；Metlin[12]；Kegg Ligand Database[13]。

2 結果

通過準確分子量結合采用Waters Masslynx數據庫Elemental composition 軟件（含各元素精確質量數）判定潛在代謝產物的分子式；結合MSE技術產生的離子碎片與文獻報道的該藥材中化合物進行比對，或代入天然產物數據庫進行搜索[14]；通過以上方法在瓜蔞皮注射液中共鑒定了19個化學成分（表2），主要包括氨基酸類、核苷類、黃酮類、多肽類和唾液酸等。

2.1 氨基酸類

在瓜蔞皮注射液中鑒定了7個氨基酸，精氨酸（1）、蘇氨酸（2）、瓜氨酸（3）、脯氨酸（4）、酪氨酸（7）、苯丙氨酸（10）和色氨酸（14）（圖2）。氨基酸主要是丟失CO2和NH3。如3號峰一級質譜中[M-H]- 為174.087 7，為瓜氨酸，在二級質譜信息中，m/z 131.081 8為失去一個酰胺基。7號峰一級質譜中[M-H]- 為180.065 4，為酪氨酸，在二級質譜信息中，m/z 163.039 2為失去一個氨基。10號峰一級質譜中[M-H]- 為164.067 5，為苯丙氨酸，在二級質譜信息中，m/z 147.041 0為失去一個氨基，m/z 103.051 9為失去一個氨基和羧基（圖3A）。通過與數據庫比對均一致。

2.2 核苷類

在瓜蔞皮注射液中鑒定了4個核苷酸類成分：黃嘌呤（6）、鳥苷（8）、腺嘌呤（9）和腺苷（12）（圖2）。9號峰一級質譜中[M+H]+ 為136.061 9，為腺嘌呤，在二級質譜信息中，m/z 119.034 6為失去一個氨基。12號峰一級質譜中[M+H]+ 為268.104 2，為腺苷，在二級質譜信息中，m/z 136.061 3為失去一個核糖基團（圖3B）。

2.3 黃酮類

黃酮類化合物是一類具有2-苯基色原酮結構的化合物。在自然界主要存在于水果、蔬菜、堅果、種子、花和果皮中[15]。在植物的生長發(fā)育過程以及抗菌防病等方面起著重要的作用。本研究中共鑒定了5個黃酮類化合物，分別為木犀草素（13）、蘆?。?6）、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷（17）、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷（18）和香葉木素-7-O-β-葡萄糖苷（19）（圖2），大多數是以糖苷的形式存在，且都是氧苷類化合物。此類化合物糖苷鍵易斷裂[16-17]。如18號峰一級質譜中[M+H]+為433.112 3，為芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷，二級碎片離子有m/z 271.059 2（奇電子離子）和m/z 272.062 9（偶電子離子），推測為丟失1分子葡萄糖后的基團；19號峰一級質譜中[M+H]+為463.123 9，為香葉木素-7-o-β-葡萄糖苷，二級碎片離子有m/z 301.071 0（奇電子離子）和m/z 302.073 2（偶電子離子），推測為丟失1分子葡萄糖后的基團（圖3C）。

2.4 多肽類

在瓜蔞皮注射液中鑒定了1個多肽類化合物S-乳酰谷胱甘肽（15）（圖2）。多肽質譜規(guī)律主要為酰胺鍵的斷裂和氨基酸氨基和羧基的丟失為主。15號峰一級質譜中[M-H]- 為378.097 1，為S-乳酰谷胱甘肽，在二級質譜信息中，化合物硫健斷裂失去硫代基團得到m/z 306.076 4，再失去兩分子羧基得到碎片離子m/z 215.079 5。

2.5 其它

在瓜蔞皮注射液中鑒定了1個唾液酸N-乙酰神經氨酸（11）和1個含氮化合物V-PYRRO/NO（5）（圖2）。11號峰一級質譜中[M+H]+為310.112 3，為N-乙酰神經氨酸，在二級質譜信息中，m/z 292.117 2為母離子失去一分子水得到的碎片。5號峰一級質譜中[M-H]-為158.092 1，為V-PYRRO/NO，在二級質譜信息中，m/z 112.086 5與數據庫中碎片相吻合。

3 討論

被鑒定出的化合物主要包括氨基酸類、核苷類、黃酮類、多肽類和唾液酸等，其中氨基酸和核苷類出峰時間主要集中在0～3 min，黃酮類則主要在7～10 min之間。這主要是由于氨基酸類成分極性較強，色譜柱上保留時間短，出峰早；而黃酮類成分極性相對較小，在C18色譜柱上保留時間較長，出峰也較晚。在沒有對照品的情況下，我們結合MSE技術（MSE技術是由高、低碰撞能兩種掃描交替構成，能夠在一次液質分析中同時獲得高精確的母離子及碎片離子信息的串聯質譜方法），同時記錄母離子和碎片離子信息，并通過母離子與碎片離子具有相同色譜行為的特性進行母離子和子離子的關聯歸屬，同時結合文獻和數據庫對化合物進行結構解析，能夠全面、精確、簡單、靈活地鑒定出天然產物中化合物的結構[18-19]。本研究共鑒定出19個化合物，其中色氨酸（14）、鳥嘌呤核苷（8）、多肽S-乳酰谷胱甘肽（15）、唾液酸N-乙酰神經氨酸（11）和含氮化合物V-PYRRO/ NO（5）為首次發(fā)現，這為闡明該注射液的化學物質基礎提供了依據。

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