脫敏煎治療男性免疫性不育療效分析及對(duì)外周血T細(xì)胞亞型的影響

婁江濤　郜都　吳駿　張曉霞　魏任雄

[摘要] 目的 分析脫敏煎治療男性免疫性不育患者前后AsAb、精液常規(guī)參數(shù)、外周血T細(xì)胞及Th細(xì)胞亞型分布的變化情況，探討脫敏煎對(duì)男性免疫性不育患者的精液常規(guī)參數(shù)及機(jī)體免疫狀態(tài)的影響。 方法 收集男性免疫性不育患者50例，在脫敏煎治療前后檢測(cè)患者AsAb；計(jì)算機(jī)輔助精子分析儀檢測(cè)精子濃度及前向運(yùn)動(dòng)精子（PR）；低鹽膨脹實(shí)驗(yàn)檢測(cè)精子存活率，Diff-Quick染色法檢測(cè)正常精子形態(tài)百分率；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)患者外周血T細(xì)胞亞型分布；RT-PCR檢測(cè)IFN-γ、IL-4 mRNA表達(dá)情況。 結(jié)果 經(jīng)脫敏煎治療后，患者AsAb轉(zhuǎn)陰率達(dá)76.00%，精子濃度明顯升高（P<0.05），精子活率及PR亦明顯升高（P均<0.01），而正常精子形態(tài)百分率無(wú)明顯變化（P>0.05）?；颊咄庵苎狢D3+T和CD8+T細(xì)胞數(shù)明顯降低，CD4+T細(xì)胞數(shù)明顯升高（P均<0.01）。IFN-γ mRNA表達(dá)量顯著下調(diào)（P<0.05），IL-4 mRNA的表達(dá)量顯著上調(diào)（P<0.05）。 結(jié)論 脫敏煎治療可明顯改善男性免疫性不育患者T淋巴細(xì)胞功能失調(diào)，提高精子濃度/精子存活率和活力，降低AsAb陽(yáng)性率。

[關(guān)鍵詞] 男性免疫性不育；T細(xì)胞亞型；Th細(xì)胞極化；脫敏煎

[中圖分類號(hào)] R246 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2017）03-0015-03

Efficacy of desensitization decoction in the treatment of male immunological infertility and its effect on peripheral blood T cell subtypes

LOU Jiangtao GAO Du WU Jun ZHANG Xiaoxia WEI Renxiong

Andrology laboratory， Ningbo Hospital of Traditional Chinese Medicine Affiliated to Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine， Ningbo 315012， China

[Abstract] Objective To investigate the changes of AsAb， semen routine parameters， peripheral blood T cells and Th cell subtypes in patients with male immunological infertility before and after treatment， and to explore the effects of desensitization decoction on semen routine and

the immune status in patients with male immunized infertility. Methods A total of 50 patients with male immunological infertility were collected and AsAb of them were detected before and after desensitization. The sperm concentration and the forward spermatozoa （PR） were measured by computer -assisted sperm analyzer. The survival rate of sperm was detected by low salt swelling experiment. Diff-Quick staining was used to detect the percentage of normal spermatozoa. Flow cytometry was used to detect the distribution of T cell subtypes in peripheral blood of patients. And the expressions of IFN-γ and IL-4 mRNA were detected by RT-PCR. Results After treatment with desensitization decoction， the AsAb negative rate was 76.00% and the sperm concentration increased significantly（P<0.05）. The sperm viability rate and PR also increased significantly（P<0.01）， while the percentage of normal spermatozoa had no significant change（P>0.05）. The number of CD3+T and CD8+T cells in peripheral blood significantly decreased and the number of CD4+T cells increased significantly （P<0.01）. IFN-γ mRNA expression was significantly down-regulated （P<0.05）， and the expression of IL-4 mRNA was significantly up-regulated（P<0.05）. Conclusion Desensitization decoction therapy can significantly improve the T lymphocyte dysfunction in male immunized infertility patients， and improve sperm concentration， sperm survival rate and viability， and can decrease the positive rate of AsAb.

[Key words] Male immunological infertility； T cell subtype； Th cell polarization； Desensitization decoction

免疫性因素是造成男性不育的重要原因之一，前期研究發(fā)現(xiàn)[1]，作為器官特異性自身免疫性疾病，男性免疫性不育患者免疫系統(tǒng)出現(xiàn)T淋巴細(xì)胞功能失調(diào)及Th（helper T cell）細(xì)胞分化向Th1（helper T cell 1）細(xì)胞方向極化。多項(xiàng)研究表明，Th1/Th2分化失衡與多種疾病關(guān)系密切[2-5]。我院男科在運(yùn)用脫敏煎治療免疫性不育方面效果明顯，可明顯提高抗精子抗體的轉(zhuǎn)陰率，改善男性免疫性不育患者的精液質(zhì)量，但有關(guān)脫敏煎能否改善T淋巴細(xì)胞功能失調(diào)尚不清楚。因此，本文對(duì)脫敏煎治療免疫性不育患者前后抗精子抗體（anti-sperm antibody，AsAb）、精液常規(guī)參數(shù)的變化進(jìn)行報(bào)道，并分析治療前后患者外周血T細(xì)胞分化情況及Th1和Th2細(xì)胞的效應(yīng)細(xì)胞因子IFN-γ和IL-4在基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)情況，初步探索脫敏煎對(duì)男性免疫性不育患者的治療效果以及對(duì)其免疫狀態(tài)的影響。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

收集2014年9月～2016年3月我院男科就診的免疫性不育患者50例，年齡24～46歲，平均（32.5±6.3）歲，所有患者均為初診，排除基礎(chǔ)性疾病及泌尿系統(tǒng)感染，未采取任何避孕措施且夫妻性生活正常1年以上女方未懷孕，同時(shí)排除女方不孕因素。所有患者治療前免疫珠試驗(yàn)（immunobead test，IBT）結(jié)果有不少于50%活動(dòng)精子表面被覆抗體，方法參照WHO《人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》（第五版）[6]。

1.2 治療方法

入選病例治療以補(bǔ)腎益氣、活血化瘀、清熱利濕為治法，方用我院脫敏煎經(jīng)驗(yàn)方，藥用：百合10 g、炒黃芩10 g、丹參20 g、女貞子20 g、丹皮15 g、防風(fēng)10 g、徐長(zhǎng)卿15 g。日1劑，水煎服，早晚各1次，3個(gè)月為1個(gè)療程，療程結(jié)束后復(fù)查精液常規(guī)和AsAb，IgA或IgG抗體黏附的精子數(shù)≥10%為AsAb陽(yáng)性，轉(zhuǎn)陰者停藥，未轉(zhuǎn)陰者繼續(xù)服藥1個(gè)療程并復(fù)查精液常規(guī)和抗精子抗體，所有對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。

1.3 主要試劑與儀器

WLJY-9000偉力彩色精子檢測(cè)系統(tǒng)（北京偉力公司），Diff-Quick染液購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)有限公司，普通PCR儀（德國(guó)Roche公司），熒光定量PCR儀Mx3000P型（美國(guó)Stratagene公司），總RNA提取試劑盒和cDNA合成試劑盒均購(gòu)自日本TaKaRa公司，RT-PCR試劑盒購(gòu)自上海Fermentas公司，熒光抗體CD3-PE-CY5、CD4-FITC、CD8-PE均購(gòu)自Beckman公司，IBT試劑由深圳華康生物醫(yī)學(xué)工程有限公司提供。

1.4 標(biāo)本采集

所有受試者在脫敏煎治療前后均采用EDTA抗凝管空腹采集外周靜脈血4 mL，其中0.5 mL用于FCM檢測(cè)，余采用Ficoll密度梯度離心法收集外周血單個(gè)核細(xì)胞并提取總RNA。禁欲3～7 d后，手淫法采集精液，并置37℃恒溫箱，待其充分液化后行精液常規(guī)檢查及IBT實(shí)驗(yàn)。

1.5 AsAb檢測(cè)

檢測(cè)方法采用IBT法，實(shí)驗(yàn)步驟參照試劑說(shuō)明書(shū)，IgA或IgG抗體粘附的精子數(shù)≥10%為有臨床意義。

1.6 精液分析

精液分析依照WHO《人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》（第5版）要求進(jìn)行。

1.7 T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)

將5 μL三色熒光抗體CD3-PE-CY5/CD4-FITC/CD8-PE加入0.5 mL EDTA抗凝外周靜脈血中，混勻后室溫避光孵育15 min，溶血儀中破壞紅細(xì)胞后PBS緩沖液洗滌離心后棄上清，再用500 μL PBS重懸后采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析。

1.8 RT-PCR檢測(cè)IFN-γ和IL-4 mRNA

（1）采用Trozol法提取外周血單個(gè)核細(xì)胞RNA，操作步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，提取RNA經(jīng)DU800紫外分光光度計(jì)測(cè)定A260/A280比值在1.8～2.0之間用于后續(xù)試驗(yàn)。（2）cDNA合成：總反應(yīng)體系20 μL，含11 μL RNA模板樣品和 1 μL 0.5 μg/μL的Oligo（dT）18，具體操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。（3）mRNA擴(kuò)增：操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，PCR反應(yīng)體系20 μL（引物1 μL，cDNA 2 μL，Universal Master Mix 10 μL，H2O 7 μL）。反應(yīng)條件為94℃ 2 min，95℃ 10 s，600C 30 s，40個(gè)循環(huán)。根據(jù)Genebank所收錄的mRNA序列利用軟件Premier 5.0設(shè)計(jì)特異性引物，IFN-γ mRNA上游引物5-TTTTGGGTTCTCTTGGCTGTT-3，下游引物5-CTCCTTTTTCGCTTCCCTGT-3。IL-4 mRNA上游引物5-AATTGCCTCACATTGTCACT-3，下游引物5-CTCTCATGATCGTCTTTAGCC-3。內(nèi)參基因β-actin：上游引物5-GGCACCCAGCACAATGAAG-3，下游引物5-CGTCATACTCCTGCTTGCTG-3。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用（x±s）表示，組間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 治療前后免疫性不育患者精液質(zhì)量和抗精子抗體檢測(cè)結(jié)果比較

脫敏煎治療后免疫性不育患者精子濃度、精子存活率和PR明顯升高，而正常精子形態(tài)百分率無(wú)明顯變化，AsAb轉(zhuǎn)陰率為76.00%，見(jiàn)表1。

2.2治療前后免疫性不育患者T細(xì)胞亞群分析比較

見(jiàn)表2，脫敏煎治療后患者CD3+T與CD8+T細(xì)胞數(shù)顯著降低（P<0.05），CD4+T細(xì)胞數(shù)顯著升高（P<0.05），CD4+/CD8+比值上升。

2.3 治療前后免疫性不育患者IFN-γ mRNA和IL-4 mRNA表達(dá)情況比較

檢測(cè)結(jié)果顯示，與治療前相比脫敏煎治療后患者IFN-γ mRNA表達(dá)量顯著下調(diào)（P<0.05），相反，IL-4 mRNA的表達(dá)量顯著上調(diào)（P<0.05），見(jiàn)表3。

3討論

免疫因素是造成男性不育癥的重要原因之一，其原因?yàn)檠G屏障因某些因素被破壞后使得自身的免疫系統(tǒng)對(duì)精液中的抗原產(chǎn)生免疫反應(yīng)，導(dǎo)致抗精子抗體產(chǎn)生[7-8]。研究表明，多種自身免疫性疾病均存在T淋巴細(xì)胞功能紊亂，同時(shí)多種細(xì)胞因子在男性生殖系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用[9]。T淋巴細(xì)胞主要分為CD8+T和CD4+T細(xì)胞，CD8+T細(xì)胞又稱殺傷性T細(xì)胞，主要功能為特異性直接殺傷靶細(xì)胞，CD4+T細(xì)胞又稱輔助性T細(xì)胞，其中Th1細(xì)胞主要分泌IL-2、IL-12、IL-15、TNF-α 和IFN-γ等，功能為增強(qiáng)吞噬細(xì)胞功能，介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，Th2細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL-13等，功能為促進(jìn)B細(xì)胞的增殖、分化和抗體生成[10]。而本研究所選AsAb陽(yáng)性的免疫性不育患者卻出現(xiàn)了促進(jìn)細(xì)胞免疫功能的CD8+T及Th1細(xì)胞升高，提示免疫性不育患者免疫功能紊亂，主要為細(xì)胞免疫介導(dǎo)引起的如血睪屏障破壞，而B(niǎo)細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫及AsAb的產(chǎn)生可能為被動(dòng)從屬關(guān)系，通過(guò)中藥脫敏煎治療后可明顯降低CD8+T、Th1細(xì)胞及IFN-γ mRNA，進(jìn)而改善細(xì)胞免疫功能。

傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)沒(méi)有免疫性不育這一病名，依據(jù)臨床表現(xiàn)，將其歸于中醫(yī)學(xué) “不育”、“無(wú)子”范疇。目前中醫(yī)學(xué)雖對(duì)本病的病因機(jī)制尚無(wú)統(tǒng)一的認(rèn)識(shí)，但通過(guò)其臨床表現(xiàn)及長(zhǎng)期臨床實(shí)踐的體會(huì)，我們認(rèn)為其基本病機(jī)不外虛實(shí)兩端，且為虛實(shí)夾雜。虛者責(zé)之于腎氣虧虛，實(shí)者責(zé)之于肝經(jīng)濕熱，故腎虛肝實(shí)、虛實(shí)夾雜是其基本病機(jī)?！秲?nèi)經(jīng)》載“男子七八精少，八八天葵絕而無(wú)子”，《千金方·求子論》中云：“凡人無(wú)子當(dāng)為夫妻懼有五勞七傷、虛贏百病所致，故有絕嗣之患”。腎主生殖，因此不育癥多從腎論治。若先天稟賦不足，腎氣虧虛，生殖之精不足，可導(dǎo)致不育?；蛞蛲庑敖Y(jié)聚日久，傷及腎氣，造成腎氣虧虛，正虛邪實(shí)，不能主持生殖，從而導(dǎo)致不育。肝主疏泄，與生殖關(guān)系密切。如肝疏泄不及，氣血不暢，瘀血、濕熱等有形之邪羈于下焦，阻滯精室精道，日久損正，以致滅活精子，發(fā)為免疫性不育。因此，腎肝同病，虛實(shí)夾雜，是免疫性不育的基本病機(jī)，而氣血失和、濕瘀互結(jié)則被認(rèn)為是免疫性不育的辯證要點(diǎn)。脫敏煎正是我們基于以上認(rèn)識(shí)治療免疫性不育的經(jīng)驗(yàn)方。方中百合、女貞子補(bǔ)腎益氣，可顯著提高精漿免疫抑制物活性，減輕免疫反應(yīng)。女貞子可通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞表面受體活性而促進(jìn)T細(xì)胞活動(dòng)[11-12]。丹參、丹皮具有活血化瘀、通精祛邪等功效，其能調(diào)節(jié)機(jī)體微循環(huán)，使體內(nèi)抗原抗體復(fù)合物加速代謝。丹參能通過(guò)雙向調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的分泌而影響機(jī)體有免疫調(diào)功能，可抑制抗體形成，并對(duì)已沉積的抗原抗體復(fù)合物有促進(jìn)吸收和消除的作用[13-16]。黃芩、徐長(zhǎng)卿具有清熱利濕藥、抗菌消炎等作用，并能對(duì)異常的免疫反應(yīng)起抑制作用[17-19]。防風(fēng)祛風(fēng)，乃風(fēng)能勝濕之意，且為風(fēng)藥之潤(rùn)劑，無(wú)傷正之弊，現(xiàn)代藥理學(xué)研究認(rèn)為防風(fēng)有提高機(jī)體免疫機(jī)抑制變態(tài)反應(yīng)的作用[20]，全方共奏清熱利濕、活血祛瘀、補(bǔ)腎益氣之功，通過(guò)改善細(xì)胞及體液免疫功能，消除導(dǎo)致AsAb產(chǎn)生的因素，進(jìn)而有效治療男性免疫性不育。

目前男性免疫性不育的發(fā)病機(jī)制仍然不完全透徹，而在該病的治療方面中醫(yī)治療的療效較西醫(yī)優(yōu)勢(shì)明顯，本研究發(fā)現(xiàn)脫敏煎對(duì)男性免疫性不育療效明顯，能明顯降低精漿AsAb，改善患者外周血中T細(xì)胞及其亞群失衡，但相關(guān)藥理及免役學(xué)機(jī)制仍須進(jìn)一步研究。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 張曉霞，魏任雄，周俊，等. 男性免疫性不育患者外周血T細(xì)胞亞型分析[J]. 中華臨床免疫和變態(tài)反應(yīng)雜志，2016，10（3）：242-246.

[2] Luo HQ，F(xiàn)eng WY，Zhong YG，et al. Clinical Significance of the Balance shift of Th1 and Th2 Type Cytokines in Patients with Primary Immune Thrombocytopenic Purpura Detected by Cytometric Bead Array[J]. Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi，2016，24（6）：1846-1849.

[3] Zhao JL，Wang X，Wang YS. Relationships between Th1/Th2 cytokine profiles and chest radiographic manifestations in childhood Mycoplasma pneumoniae pneumonia[J].Ther Clin Risk Manag，2016 ，11（12）：1683-1692.

[4] Berker M，F(xiàn)rank LJ，Ge？ner AL，et al. Allergies-AT cells perspective in the era beyond the TH1/TH2 paradigm[J]. Clin Immunol，2016，12（174）：73-83.

[5] Zhang Y，Gu W. Th1/Th2 cell's function in immune system[J]. Adv Exp Med Biol，2014，8（41）：45-65.

[6] WHO.《人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》（第五版）[M].北京：人民衛(wèi)生出版，2011.

[7] Marshburn PB. The role of antisperm antibodies in infertility[J]. Fertil Steril，1994，61（5）：799-811.

[8] Vazquez-Levin MH，Marín-Briggiler C，Veaute C. Antisperm antibodies：Invaluable tools toward the identification of sperm proteins involved in fertilization[J]. Am J Reprod Immunol，2014，72（2）：206-218.

[9] Chaouat G，Zourbas S，Ostojic S，et al. A brief review of recent data on some cytokine expressions at the maternofoetal interface which might challenge the classical Th1/Th2 dichotomy[J]. J Reprod Immunol，2002，53（1/2）：241-256.

[10] 何廣勝，周玲，吳德沛. Th1和Th2細(xì)胞的分化調(diào)節(jié)機(jī)制[J]. 中華血液學(xué)雜志，2005，26（2）：125-128.

[11] 金芝貴，金劍，肖忠革，等. 女貞子的藥理作用及其臨床應(yīng)進(jìn)展[J]. 藥學(xué)服務(wù)與研究，2011，11（3）：10-12.

[12] 于東波，張宏方，鄭玉，等. 女貞子對(duì)免疫相關(guān)調(diào)節(jié)作用研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)中醫(yī)藥現(xiàn)代遠(yuǎn)程教育，2016，14（7）：150-153.

[13] 常德貴. 男性免疫性不育的中醫(yī)論治[J]. 中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2007，27（11）：969.

[14] 寇華勝，林建予. 中醫(yī)免疫醫(yī)學(xué)[M]. 武漢：湖北科學(xué)技術(shù)出版社，1990：136.

[15] 閆瑾，崔志清. 丹參及其有效成分的藥理作用研究述略[J]. 中醫(yī)藥學(xué)刊，2004，22（9）：371-372.

[16] 張燕麗，孟凡佳，左冬冬. 丹參與丹皮配伍后的化學(xué)成分及藥理作用變化研究進(jìn)展[J]. 中醫(yī)藥信息，2014，21（1）：127-128.

[17] 陳如鉤，江魚(yú). 不孕不育治療學(xué)[M]. 上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1997：144.

[18] 馬玲玲，孫燕. 中藥黃芩藥理作用的研究進(jìn)展[J]. 沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2016，18（2）：115-117.

[19] 楊大堅(jiān).重用徐長(zhǎng)卿治療抗精子抗體陽(yáng)性[J].中醫(yī)雜志，2001，42（8）：458.

[20] 竇紅霞，高玉蘭. 防風(fēng)的化學(xué)成分和藥理作用研究進(jìn)展[J]. 中醫(yī)藥信息，2009，16（2）：15-17.

（收稿日期：2016-11-07）