顱腦創(chuàng)傷后循環(huán)血中腦源性微粒的研究

張建寧

·述評(píng)·

顱腦創(chuàng)傷后循環(huán)血中腦源性微粒的研究

張建寧

張建寧，男，主任醫(yī)師、教授，天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院院長(zhǎng)、天津市神經(jīng)病學(xué)研究所所長(zhǎng)。生于1961年，于1992年獲天津醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)外科學(xué)醫(yī)學(xué)博士學(xué)位；2002年赴美國(guó)Baylor醫(yī)學(xué)院研修博士后；我國(guó)神經(jīng)外科知名專家，國(guó)務(wù)院特殊津貼獲得者、衛(wèi)生部突出貢獻(xiàn)專家和天津市131第一層次人才。擔(dān)任第五屆亞洲神經(jīng)外科學(xué)會(huì)副主席、中華醫(yī)學(xué)會(huì)神經(jīng)外科分會(huì)副主任委員、中華醫(yī)學(xué)會(huì)神經(jīng)外科分會(huì)脊髓脊椎專業(yè)學(xué)組副組長(zhǎng)、中國(guó)醫(yī)師協(xié)會(huì)神經(jīng)外科分會(huì)創(chuàng)傷專家委員會(huì)委員、天津醫(yī)學(xué)會(huì)神經(jīng)外科學(xué)會(huì)主任委員、天津市神經(jīng)科學(xué)學(xué)會(huì)理事。發(fā)表學(xué)術(shù)論文240多篇，其中SCI文章35篇；主編主譯專著各1部，副主編專著3部，參編專著6部，承擔(dān)國(guó)際合作基金、國(guó)家自然基金重大項(xiàng)目以及國(guó)家科技部（973課題）子項(xiàng)目和省部級(jí)重點(diǎn)基金項(xiàng)目10余項(xiàng)，擁有國(guó)家級(jí)發(fā)明專利；曾獲天津市科技進(jìn)步一等獎(jiǎng)、二等獎(jiǎng)、三等獎(jiǎng)、四等獎(jiǎng)共計(jì)9項(xiàng)。

顱腦創(chuàng)傷； 腦源性微粒； 免疫反應(yīng)； 凝血機(jī)制

自從CT發(fā)明以來(lái)，腦外傷救治已取得了非常大的突破和進(jìn)展，但進(jìn)入21世紀(jì)以后，走向了平臺(tái)期。目前比較多的討論和研究集中在手術(shù)去大骨瓣是否有效、顱壓監(jiān)護(hù)是否有用、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)藥是否有用等，然而并沒有得出一致的結(jié)論。我認(rèn)為，在腦外傷領(lǐng)域如果還要取得突破性進(jìn)展，進(jìn)一步降低死亡率，就必須重視基礎(chǔ)研究。從臨床提出問題，以基礎(chǔ)研究為平臺(tái)，突破基礎(chǔ)理論和機(jī)理上的瓶頸，創(chuàng)新治療思路，找出治療辦法。近期我們對(duì)腦創(chuàng)傷后的腦源性微粒（brain-derived microparticles，BDMP）進(jìn)行了研究，取得了令人振奮的效果，將來(lái)有可能產(chǎn)生一些突破。現(xiàn)報(bào)道如下。

一、血中的微觀世界

事實(shí)上，我們的血液中并不那么“干凈”。除了人們所熟知的紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板之外，還包含許多更小的有形成分，其構(gòu)成復(fù)雜、種類繁多，人們按其直徑大小分為以下3類進(jìn)行研究：凋亡小體直徑約1～5μm，與血小板大小一致；再小一級(jí)是微粒（microparticles，MPs），直徑約0.1～1μm，與細(xì)菌大小一致；最小的是外泌體，直徑約30～100 nm，與病毒大小一致。它們都具有極其重要的生物學(xué)功能。例如血液中單獨(dú)存在的裸露mRNA會(huì)很快被酶切而失去生物活性，但是如果有MPs或者外泌體，就會(huì)成為一個(gè)很好的載體并作為相應(yīng)的歸巢定位去發(fā)揮它的生物功能。

這些成分是如何產(chǎn)生的呢？有些是由凋亡產(chǎn)生，例如創(chuàng)傷可以導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，產(chǎn)生凋亡小體；有些是在細(xì)胞受到刺激以后釋放的，如MPs；還有一些是細(xì)胞主動(dòng)分泌的，如外泌體[1]。

二、BDMP：MP的新成員

研究提示，神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞損傷后可以釋放MPs。因?yàn)榫€粒體在細(xì)胞生物學(xué)功能上有很重要的作用，且線粒體標(biāo)記具有特異性，所以我們將線粒體微粒（mitochondria microparticles，mtMPs）作為觀察對(duì)象。研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是神經(jīng)元還是膠質(zhì)細(xì)胞，在損傷以后都可以釋放出mtMPs。通過流式細(xì)胞術(shù)可以在細(xì)胞培養(yǎng)的上清液中檢測(cè)到 mtMPs的釋放。mtMPs中含有線粒體的DNA，還可以檢測(cè)到一些mRNA及相應(yīng)的酶。這些測(cè)定結(jié)果為研究mtMPs的生物學(xué)功能打開了遐想的空間。

作為神經(jīng)外科學(xué)者，我們的研究集中在對(duì)顱腦創(chuàng)傷后BDMP的觀察。我們團(tuán)隊(duì)在國(guó)際上首先報(bào)道在腦組織和循環(huán)血液中可以觀察到BDMP。在透射電鏡下，可觀察到BDMP具有膜結(jié)構(gòu)、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等；通過流式細(xì)胞技術(shù)，可觀察到BDMP中含有豐富的磷脂以及一些腦組織特異性的蛋白，且都具有相應(yīng)的生物學(xué)功能。磷鎢酸負(fù)染色之后，發(fā)現(xiàn)其表面的磷脂膜中存在膜蛋白。

我們還研究了BDMP的生物學(xué)功能。把BDMP注入小鼠體內(nèi)后，會(huì)導(dǎo)致小鼠死亡，逐漸降低劑量之后，可以摸索出一個(gè)劑量非常微小的半數(shù)致死量。然后對(duì)BDMP表面進(jìn)行處理，在不破壞BDMP整體結(jié)構(gòu)的情況下用酶將其表面的蛋白消化掉，再次注入小鼠體內(nèi)后則不會(huì)出現(xiàn)小鼠死亡。研究還發(fā)現(xiàn)，將同樣濃度的BDMP打碎成為磷脂和蛋白質(zhì)后注入小鼠體內(nèi)，小鼠也未出現(xiàn)死亡。這些現(xiàn)象說明，BDMP有賴于其結(jié)構(gòu)的完整性和表面的膜蛋白去發(fā)揮作用。

我們發(fā)現(xiàn)，BDMP可激活血腦屏障上的某些細(xì)胞，使細(xì)胞之間的縫隙連接開放，血腦屏障打開。我們最近觀察了周細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)受BDMP刺激以后，原本扁平狀態(tài)的周細(xì)胞會(huì)揪起來(lái)，高度增加，縫隙開放。說明BDMP很有可能在創(chuàng)傷后的腦水腫中具有很重要的作用[2]。

三、顱腦創(chuàng)傷后BDMP的作用機(jī)制

（一）腦內(nèi)作用

中樞神經(jīng)系統(tǒng)在受到外傷后，不論是神經(jīng)元還是膠質(zhì)細(xì)胞受損，都可以釋放出BDMPs。BDMPs首先在腦內(nèi)局部起作用，其作用可能有兩個(gè)方面：（1）保護(hù)作用。有一些主動(dòng)分泌的外泌體，可以促進(jìn)軸索和神經(jīng)元的修復(fù)；（2）損傷作用。有些MP被釋放后，其生物學(xué)功能會(huì)激活，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生一定的損傷。

而且，BDMP還可以刺激周細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，促使血腦屏障打開從而進(jìn)入循環(huán)血。在循環(huán)血中能夠激活血小板、刺激白細(xì)胞并產(chǎn)生相關(guān)反應(yīng)。這些反應(yīng)對(duì)腦外傷后的病理生理機(jī)制產(chǎn)生極其重要的作用。

（二）MP與凝血功能障礙的關(guān)系

腦外傷后患者常合并凝血功能障礙，其可導(dǎo)致或加重腦外傷后腦水腫、顱內(nèi)出血、腦梗塞等一系列繼發(fā)性腦損害。而且創(chuàng)傷后出現(xiàn)不能控制的自發(fā)性出血，也是導(dǎo)致創(chuàng)傷患者死亡的一個(gè)主要原因，占創(chuàng)傷患者人數(shù)的30%～40%[3-5]。文獻(xiàn)報(bào)道腦外傷的凝血障礙發(fā)生率為10%～87.5%不等[6]。周良輔教授報(bào)道有超過50%的重型腦創(chuàng)傷患者會(huì)伴發(fā)凝血功能障礙。凝血功能障礙的發(fā)生與損傷嚴(yán)重程度相關(guān)，它還是腦創(chuàng)傷后死亡的一個(gè)獨(dú)立影響因素。

凝血功能障礙的發(fā)生與MP是否有關(guān)系呢？研究發(fā)現(xiàn)BDMP可與血小板結(jié)合，在熒光顯微鏡下首先表現(xiàn)為膜與膜可以碰到一起；其次發(fā)現(xiàn)兩者可以融合，一些是MP完整地被血小板吞噬，另一些是融合后將內(nèi)容物釋放到血小板里。流式細(xì)胞術(shù)也證實(shí)了上述改變，這種改變會(huì)導(dǎo)致血小板被激活。實(shí)驗(yàn)顯示，BDMP的促凝活性強(qiáng)度和組織因子一樣。

組織因子等因素通過內(nèi)源性機(jī)制可導(dǎo)致血小板激活，血小板的激活分為兩個(gè)階段。首先血小板活化，然后通過血小板上的蛋白結(jié)構(gòu)來(lái)抓取周圍的紅細(xì)胞等，從而形成血塊、血栓。但研究發(fā)現(xiàn)，雖然BDMP可以激活血小板，但卻只激活第一階段，即被BDMP激活后的血小板處于一種高能狀態(tài)，卻并不直接將紅細(xì)胞等聚合在一起形成血塊。此時(shí)如果出現(xiàn)其他繼發(fā)性損害，如手術(shù)時(shí)間過長(zhǎng)或肺部感染，就很可能會(huì)馬上出現(xiàn)大量的微血栓及彌散性血管內(nèi)凝血。手術(shù)過程中，我們不難發(fā)現(xiàn)有些重傷患者的血液和正常血液是完全不一樣的，表現(xiàn)為血液流出后基本不會(huì)凝固，這很可能就是BDMP的作用。因?yàn)樗鼤?huì)消耗大量的纖維蛋白原，使血小板處于高水平激活狀態(tài)，一旦出現(xiàn)繼發(fā)性損害，就會(huì)形成微血栓。

腦外傷以后，血液中有內(nèi)皮細(xì)胞、血小板、白細(xì)胞等來(lái)源的MP，BDMP只占了一部分。相比MP的總量來(lái)講，BDMP的數(shù)量很小，但它的作用卻可能很大。經(jīng)血液測(cè)定，神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白陽(yáng)性的MP在外傷后3 h出現(xiàn)高峰，神經(jīng)元特異性烯醇化酶陽(yáng)性的MP則在外傷1 h后即出現(xiàn)高峰。BDMP可以導(dǎo)致凝血時(shí)間的改變，將BDMP去除之后，其上清液就不會(huì)引起這樣的改變。

循環(huán)血中BDMP含量改變的結(jié)果是什么呢？隨著凝血機(jī)制被激活，體內(nèi)纖維蛋白原會(huì)被大量消耗形成纖維蛋白，覆蓋在血小板的表面，再結(jié)合紅細(xì)胞等形成血栓。所以外傷后，血中的纖維蛋白原一般是呈降低狀態(tài)的，凝血時(shí)間是延長(zhǎng)的。這就是MP的作用之一。當(dāng)這一過程完成后，纖維蛋白會(huì)沉積到肺、腎臟、心肌等部位，其具體代謝途徑我們以后還會(huì)深入研究。

總結(jié)以上，我們的研究可以證實(shí)以下幾點(diǎn)：（1）外傷后損傷的神經(jīng)細(xì)胞可產(chǎn)生BDMP；（2）BDMP在體外和體內(nèi)均具有高度的促凝活性；（3）創(chuàng)傷后的BDMP可以穿透血腦屏障進(jìn)入循環(huán)血中，導(dǎo)致血小板激活等系列變化；（4）BDMP與TBI后凝血功能障礙的發(fā)生和發(fā)展關(guān)系密切。

（三）顱腦損傷后的免疫反應(yīng)

以前中樞神經(jīng)系統(tǒng)一直被認(rèn)為是免疫豁免器官，但現(xiàn)在則認(rèn)為，中樞神經(jīng)系統(tǒng)也并非排除在免疫調(diào)控作用之外。已有研究發(fā)現(xiàn)在顱內(nèi)矢狀竇附近存在淋巴管結(jié)構(gòu)。顱腦創(chuàng)傷后免疫炎癥反應(yīng)通過引起的血腦屏障破壞可致大量腦組織碎片及細(xì)胞顆粒釋放入血，同時(shí)外周循環(huán)系統(tǒng)免疫炎性細(xì)胞亦可浸潤(rùn)腦組織引起局部免疫反應(yīng)，直接損傷神經(jīng)元細(xì)胞，導(dǎo)致繼發(fā)性損傷。

顱腦損傷既可以使血腦屏障發(fā)生改變，又使單核-巨噬細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞的“清道夫”作用泛化，減弱其識(shí)別“自我”的能力，導(dǎo)致?lián)p傷區(qū)腦組織產(chǎn)生相應(yīng)的病理變化。

顱腦損傷后免疫炎癥反應(yīng)貫穿繼發(fā)性腦損傷的全過程，由MP介導(dǎo)的免疫炎癥反應(yīng)機(jī)制逐漸受到廣泛關(guān)注，并被證實(shí)與多種免疫炎性疾病發(fā)生有關(guān)。

重型顱腦損傷患者外周血和腦脊液中不僅血小板來(lái)源的MP顯著增高，且內(nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞來(lái)源的MP數(shù)量也顯著增高。MP本身可以攜帶多種促炎物質(zhì)，當(dāng)MP被免疫細(xì)胞吞噬或與免疫細(xì)胞結(jié)合時(shí)，則會(huì)改變靶細(xì)胞的生物活性。這些改變很可能為我們進(jìn)一步研究顱腦創(chuàng)傷打開一個(gè)新的窗口。

因心磷脂只存在于線粒體中，我們以心磷脂抗體為標(biāo)記進(jìn)行研究，通過檢測(cè)心磷脂陽(yáng)性的微粒，可以發(fā)現(xiàn)小鼠顱腦創(chuàng)傷后會(huì)有心磷脂抗體的產(chǎn)生，且具有其特異性及其相應(yīng)的功能[7]。

以抗腦抗體為例，我們對(duì)小鼠創(chuàng)傷性腦損傷后抗腦自身抗體進(jìn)行檢測(cè)。通過ELISA法檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)小鼠傷后14 d血漿中抗腦抗體的含量在逐漸增高，說明其在繼發(fā)性損傷當(dāng)中，免疫炎癥反應(yīng)是參與作用的。

顱腦損傷后損傷的神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞碎片以BDMP形式釋放并進(jìn)入外周血。除細(xì)胞膜MP外，細(xì)胞器也可以從損傷的細(xì)胞中釋放出來(lái)。在顱腦損傷的急性期外周血中可檢測(cè)到完整或部分破壞的腦源性mtMP，其占BDMP的比例超過50%。有理由認(rèn)為BDMP是導(dǎo)致顱腦損傷后免疫炎癥反應(yīng)異常和凝血功能障礙發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

四、顱腦創(chuàng)傷后BDMP研究的展望

顱腦損傷后損傷的神經(jīng)細(xì)胞可產(chǎn)生BDMP，其具有高度的促凝活性及潛在的促炎活性，導(dǎo)致?lián)p傷后凝血功能障礙。BDMP是介導(dǎo)免疫炎癥反應(yīng)異常和凝血功能障礙這兩個(gè)相互重疊的病例變化的重要介質(zhì)之一，TBI后免疫炎癥反應(yīng)異常和凝血功能障礙關(guān)系密切，它們是TBI患者預(yù)后不良及致殘的重要原因之一。

MP在人體內(nèi)的清除半衰期為5 h，但其清除機(jī)制仍不清楚。MP可能成為揭示TBI發(fā)生發(fā)展機(jī)制、探索TBI治療的新靶標(biāo)。

我們做了一些研究，發(fā)現(xiàn)一種蛋白可以在體外阻斷MP的作用，注入體內(nèi)后，觀察到外傷后腦水腫出現(xiàn)減少。將該蛋白注入小鼠體內(nèi)后，再注入致死量的MP后發(fā)現(xiàn)，小鼠卻并未出現(xiàn)死亡。通過對(duì)該現(xiàn)象的深入研究，將來(lái)是否可以開發(fā)出一種新型早期干預(yù)治療的手段？另外，外傷后局部高濃度的BDMP也有可能是把雙刃劍。在其引起血腦屏障損傷的同時(shí)，如果通過更加精細(xì)深入的劃分，發(fā)現(xiàn)比外泌體更小的成分，或許可以促進(jìn)外傷后半暗帶區(qū)神經(jīng)組織的修復(fù)以及神經(jīng)損傷區(qū)血管單元的再建立。研究提示，顱腦創(chuàng)傷后血液中的許多MP會(huì)聚集到外傷損傷區(qū)，其進(jìn)一步發(fā)生機(jī)制如何，信號(hào)傳導(dǎo)通路是怎樣的，是否可通過基因修飾或MP干預(yù)來(lái)阻斷或增強(qiáng)其相關(guān)變化？這將很有可能為顱腦創(chuàng)傷治療開辟一條新途徑。

[1]Beyer C,Pisetsky DS.The role of microparticles in the pathogenesis of rheumatic diseases[J].Nat Rev Rheumatol,2010, 6(1):21-29.

[2]Zhao Z,Wang M,Tian Y,et al.Cardiolipin-mediated procoagulant activity of mitochondria contributes to traumatic brain injury-associated coagulopathy in mice[J].Blood,2016,127 (22):2763-2772.

[3]Hulka F,Mullins RJ,Frank EH.Blunt brain injury activates the coagulation process[J].Arch Surg,1996,131(9):923-927.

[4]Hoots WK.Experience with antithrombin concentrates in neurotrauma patients[J].Semin Thromb Hemost.1997,Suppl 1: 3-16.

[5]Cap AP,Spinella PC.Severity of head injury is associated with increased risk of coagulopathy in combat casualties[J].JTrauma, 2011,71(Suppl):S 78-81.

[6]Tian Y,Salsbery B,Wang M,et al.Brain-derived microparticles induce systemic coagulation in amurinemodel of traumatic brain injury[J].Blood,2015,125(13):2151-2159.

[7]Singh SB,OrnatowskiW,Vergne I,et al.Human IRGM regulates autophagy and cell-autonomous immunity functions through mitochondria[J].Nat Cell Biol,2010,12(12):1154-1165.（收稿日期：2017-01-23）

（本文編輯：張麗）

張建寧.顱腦創(chuàng)傷后循環(huán)血中腦源性微粒的研究[J/CD].中華神經(jīng)創(chuàng)傷外科電子雜志,2017,3(2):065-067.

10.3877/cma.j.issn.2095-9141.2017.02.001

300052天津，天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院神經(jīng)外科

張建寧，Email：jianningzhang@hotmail.com