乳制品中益生菌的定量方法研究進展

張娜娜, 姜 凱, 趙 渝, 劉 洋, 段文鋒

(1.上海師范大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 植物種質(zhì)資源開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心,上海 200234;2.上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗技術(shù)研究院/國家食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心(上海),上海 200233)

乳制品中益生菌的定量方法研究進展

張娜娜1, 姜 凱1, 趙 渝1, 劉 洋2*, 段文鋒2

(1.上海師范大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 植物種質(zhì)資源開發(fā)協(xié)同創(chuàng)新中心,上海 200234;2.上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗技術(shù)研究院/國家食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心(上海),上海 200233)

益生菌對健康有促進作用,乳制品中的益生菌的數(shù)量已成為評價其質(zhì)量優(yōu)劣的重要標準.建立簡單快速益生菌定量檢測方法很有必要.就乳制品中益生菌數(shù)量測定方法的研究現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢進行了綜述.

乳制品; 益生菌; 定量方法; 檢測

0 引 言

近年來“益生菌”這一名詞的熱潮只升不降,Fuller等[1]憑借有益菌對人及動物腸道的感化作用,把“一種能經(jīng)過改良腸道微生物的均衡而對宿主產(chǎn)生有利影響的微生物添加物”定義為益生菌,它對人和動物體都有重要的益生作用.益生菌基本都對其宿主有有益影響,主要功效為幫助消化,調(diào)節(jié)腸道菌群平衡,治療腹瀉和便秘,降低血液膽固醇水平,增強宿主免疫功能和抗腫瘤等[2-5].益生菌能可幫助人體吸收營養(yǎng)物質(zhì)[6-7].

乳制品中益生菌的數(shù)量是其產(chǎn)品發(fā)揮益生功效的重要條件,成為產(chǎn)品安全和功能性試驗的重要參數(shù)[8-9].《食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 乳酸菌檢驗》[10]中規(guī)定添加益生菌的乳制品中其添加量至少要達到1×106CFU/mL.本文作者介紹了目前常見的乳制品中益生菌數(shù)量的測定方法.

1 培養(yǎng)法

平板培養(yǎng)法是乳制品中益生菌測定的標準方法,也是目前實驗室中最常用的方法.其基本原理是:將待測樣品進行梯度稀釋使其中的微生物呈現(xiàn)為穩(wěn)定的、均勻的單細胞狀態(tài),然后取合適的量接種到加熱滅菌的培養(yǎng)基上,經(jīng)培養(yǎng),單個細菌生長為一個菌落.計算時根據(jù)稀釋度和接種量換算成樣品中的菌落總數(shù)[11].益生菌有好氧菌、厭氧菌和兼性厭氧菌之分,培養(yǎng)過程中注意培養(yǎng)方式,會使樣品中的菌落總數(shù)更加準確.

發(fā)酵乳制品中添加量較多的幾種菌有:雙歧桿菌、干酪乳桿菌、保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌.各菌種的特殊培養(yǎng)計數(shù)方法如下.

保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌作為發(fā)酵菌一般會同時出現(xiàn)在一種乳制品中[12],為更快、更方便地對保加利亞乳桿菌計數(shù)并減少在培養(yǎng)過程中雜菌的生長,魯慧峰等[13]對乳酸細菌培養(yǎng)基(MRS培養(yǎng)基)進行優(yōu)化,即在培養(yǎng)基中加入醋酸,將pH值調(diào)制5.4,使培養(yǎng)基酸化,從而保證在混合菌種中只生長保加利亞乳桿菌.

雙歧桿菌是厭氧型菌種,與其他菌混合時可以被簡單快速地在選擇性培養(yǎng)基中區(qū)分鑒別出來.國標GB 4789.35-2016中雙歧桿菌計數(shù)方法是在MRS培養(yǎng)基中添加莫匹羅星鋰鹽和半胱氨酸鹽酸鹽,接種過后厭氧培養(yǎng)[7].Thitaram等[14]通過在選擇性培養(yǎng)基中添加莫匹羅星這種抗生素可以很好地將雙歧桿菌分離出來,并進行計數(shù).

干酪乳桿菌的選擇性計數(shù)可使用乳桿菌培養(yǎng)基(LC瓊脂)[15],Talwalkar等[16]證明了這一培養(yǎng)基可以被廣泛地用在含有干酪乳桿菌的益生菌制品中.Colombo等[17]研究了在選擇性平板上加入10 mg/L的萬古霉素,可以將發(fā)酵乳中的干酪乳桿菌鑒別并計數(shù).

嗜酸乳桿菌是乳制品中添加量較多的益生菌,但一般與其他菌混合存在.研究證明MRS-山梨醇在厭氧條件下只允許嗜酸乳桿菌生長,利用MRS-山梨醇培養(yǎng)基可以在多菌種存在的乳制品中選擇性計數(shù)目標菌[18].另外也可以在MRS培養(yǎng)基中添加克林霉素(體積分數(shù)0.02%)至其體積分數(shù)為0.05%,添加環(huán)丙沙星(體積分數(shù)0.2%)至其體積分數(shù)為0.5%,可抑制保加利亞乳桿菌、雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌等的生長[16].但這種方法只適用于乳制品中嗜酸乳桿菌含量不低于104CFU/g的情況.克林霉素和環(huán)丙沙星添加過多也會抑制嗜酸乳桿菌的生長,導(dǎo)致計數(shù)偏低.培養(yǎng)法可以很好地計數(shù)活菌的信息,但對于死菌或受損菌則無法計數(shù),而且培養(yǎng)法操作繁瑣,耗時長,結(jié)果易受多因素影響.

2 腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)生物熒光法

ATP是生命的能量來源,存在于活細胞中,含量相對穩(wěn)定,但細菌死后幾分鐘內(nèi)ATP便被水解,故而ATP與活菌量有直接聯(lián)系[19].生物熒光法的原理是:熒光素酶將熒光素、氧和ATP作為底物,產(chǎn)生熒光現(xiàn)象[20].自1850年代開始用于食品微生物檢測,并且在1990年代開始迅速發(fā)展[21].此方法在動物、植物、微生物及醫(yī)藥領(lǐng)域的檢測中都有著廣泛的應(yīng)用[22-23].ATP在食品中的應(yīng)用主要是檢測食品中的細菌總數(shù),并逐漸發(fā)展到檢測乳制品中益生菌的總數(shù).Wu等[24]優(yōu)化了ATP快速定量檢測方法,并確認可以快速測定固體或液體益生菌產(chǎn)品中細菌的活菌數(shù).陳藝虹[25]對啤酒中乳酸菌和酵母菌進行了檢測,發(fā)現(xiàn)此方法可以快速方便地對細菌進行定量檢測,但是只能對活的細菌進行定量,而對于滅活的細菌沒有作用.

3 電子阻抗法

電子阻抗測量法的基本原理是:微生物在生長過程中能夠使培養(yǎng)基中的阻抗和電極周邊的雙電層電極阻抗產(chǎn)生轉(zhuǎn)變,這種變化與微生物的數(shù)量相關(guān)[26].黃吉城等[27]運用電子阻抗法測定食品中的菌落總數(shù),并與國標法相對比得出其差異性不大,但檢測時間縮短了很多.杜寒春等[28]將此方法運用到巴氏殺菌牛乳的菌落總數(shù)測定并繪制了標準曲線,得出其相關(guān)系數(shù)為-0.9907,可信度較高.顧其芳等[29-30]將電子阻抗法應(yīng)用到食品的乳酸菌定量中,對324份樣品檢驗并繪制相關(guān)曲線,得相關(guān)系數(shù)為0.95,用時僅為18 h,證明此方法在乳酸菌的定量中具有很好的應(yīng)用性.此方法與平板計數(shù)法相比,結(jié)果無顯著差異,且重現(xiàn)性較好、靈敏度高,具有廣泛的實用性和適用性[28].

4 聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)

PCR反應(yīng)技術(shù)是在體外發(fā)生的一種極速擴增核酸數(shù)目的方法,它能使微量的核酸在一個較短時間內(nèi)成倍數(shù)地擴增[31].只要選擇合適的引物,PCR就可以特異性地擴增出目標物的某一段比較保守的基因片段,從而達到特殊檢測的目的[32].該方法已在食品的益生菌檢測中廣泛使用[33-34].

技術(shù)的不斷發(fā)展使得PCR技術(shù)與其他新興技術(shù)結(jié)合,產(chǎn)生了一些以PCR技術(shù)為基底的衍生技術(shù),包括:熒光定量PCR(RTQ-PCR)、多重PCR(M-PCR)、逆轉(zhuǎn)錄PCR、PCR-ELISA技術(shù)、PCR-DGGE技術(shù)、Lamp技術(shù)等.這些PCR衍生技術(shù)主要用于某一樣本中的微生物定性或微生物的菌群分布研究[35-38].熒光定量PCR目前在微生物定量檢測中應(yīng)用較為廣泛.

熒光定量PCR的基本原理與普通PCR相似,只是在擴增的同時通過熒光染料或熒光標記的具有特異性的探針,跟蹤標記PCR產(chǎn)物,實時監(jiān)測反應(yīng)過程并結(jié)合相應(yīng)的軟件分析,計算待測樣品模板的濃度,最后通過標準曲線對未知模板逆推得出樣品的含量.其分為絕對定量和相對定量兩種.相對定量是分別對目的基因和參比基因定量測定,再求出相對于參比基因的目的基因的相對量,最后再進行樣品間相對量的比較[39].絕對定量是對未知樣品的絕對量進行測定的方法,通過一系列稀釋已知濃度的標準品制作標準曲線,對未知濃度的樣品進行其拷貝數(shù)的測定,所使用的標準品可以是dsDNA、ssDNA或cDNA[40].根據(jù)這些原理郭子好等[41]將TR-PCR應(yīng)用到發(fā)酵物料中嗜酸乳桿菌的數(shù)量,并且準確地檢測出樣品中菌含量為1.5×109CFU/g.斯日古冷[42]通過16S rRNA序列對發(fā)酵乳中的植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)進行定量檢測,并準確檢測出樣品中的植物乳桿菌數(shù).Furet等[39,43-45]對乳制品中的益生菌進行定量檢測,其樣品中菌含量最少是106CFU/mL,檢測限為103CFU/mL.其最大的優(yōu)勢是不僅可以定量乳制品中的活菌數(shù),而且可以為滅活菌定量.

5 流式細胞術(shù)(FCM)

FCM是一種在細胞分子水平上通過單克隆抗體或染料染色后對單個細胞或其他的生物粒子進行快速定量分析的技術(shù)[46].目前已廣泛應(yīng)用于食品、飲料等領(lǐng)域.Hahne等[47-48]將FCM應(yīng)用于食品、飲料行業(yè)進行酵母菌、霉菌和食品中其他細菌的計數(shù).Bunthof等[49]研究了乳制品中乳酸菌染料染色后所表現(xiàn)出的活力程度,表明FCM可以明確地將活、死細胞區(qū)分開來.Cassoil[50]研究發(fā)現(xiàn)FCM與標準的平板計數(shù)法相比在數(shù)值上會有很大的差異,但是其差異不會超過一個數(shù)量級.平板計數(shù)法只可以將活性較好的菌培養(yǎng)出來并計數(shù),流式細胞術(shù)則是將受損但未死亡的細胞也計算在活細胞范圍內(nèi),導(dǎo)致計數(shù)結(jié)果差異較大.另外,楊莉婷等[51]利用FCM對生乳中細菌總數(shù)計數(shù)時,其檢測限達到了10 CFU/mL,且與平板計數(shù)法結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)具有顯著的相關(guān)性(P<0.01).FCM操作簡便,檢測周期短,能夠區(qū)分活死菌,適合乳制品中益生菌的計數(shù).

6 結(jié)束語

本文歸納總結(jié)了5種乳制品中乳酸菌的檢測方法.培養(yǎng)法是現(xiàn)行的國家標準,但培養(yǎng)法只能培養(yǎng)活性較好的細菌,對于活性較差或不可培養(yǎng)細菌無法計數(shù);ATP法和電阻法可以對活菌進行準確快速的檢測,且置信度高,但也不能對死菌進行檢測;PCR方法是目前在乳制品中乳酸菌定量檢測使用較多的定量方法,不但可以對活菌進行定量,還可以通過建立標準曲線對死菌進行定量,另外根據(jù)引物的不同也可以對單一菌種進行定量;FCM通過使用熒光染料對細菌進行標記從而快速地區(qū)分活菌和死菌,但不能達到對單一菌種進行檢測的要求.研究人員可根據(jù)需求選擇合適的定量檢測方法,在減少檢測時間的同時提高檢測效率.

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(責任編輯:顧浩然,馮珍珍)

Advancesinquantitativedetectionmethodsofprobioticsindairyproducts

Zhang Nana1, Jiang Kai1, Zhao Yu1, Liu Yang2*, Duan Wenfeng2

(1.Development Center of Plant Germplasm Resources,College of Life and Environmental Sciences,Shanghai Normal University,Shanghai 200234,China; 2.Shanghai Institute of Quality Inspection andTechnical Research/National Center of Supervision and Inspection on Food Products Quality (Shanghai),Shanghai 200233,China)

Plenty of studies showed the probiotics can promote health.The number of probiotic bacteria in probiotic dairy products has become an important criterion for evaluating the produces′ quality.Therefore,it is necessary to establish a simple and rapid method for quantitative determination of the probiotics in dairy products.In this paper,the research status and development trend of quantitative determination method of probiotics in dairy products are summarized.

dairy products; probiotics; quantitative method; detection

N 34

A

1000-5137(2017)05-0751-06

2017-08-31

國家自然科學(xué)基金(31301486);上海市自然科學(xué)基金(13ZR1439600);上海市2017年度“科技創(chuàng)新行動計劃”(17142203000);上海植物種質(zhì)資源工程技術(shù)研究中心項目(17DZ2252700)

張娜娜(1992-),女,碩士研究生,主要從事食品微生物及應(yīng)用方面的研究.E-mail:znsh@163.com

導(dǎo)師簡介: 趙 渝(1973-),男,博士,副教授,主要從事食源性致病菌快速檢測方面的研究.E-mail:zhaoyu@shnu.edu.cn

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劉 洋(1980-),女,高級工程師,主要從事生物學(xué)技術(shù)在食品檢測中的應(yīng)用方面的研究.E-mail:liuyang@sqi.org.cn