響應(yīng)面法優(yōu)化木瓜蛋白酶提取紅稗多糖工藝

蘇 偉,宋 玉,母應(yīng)春,李澤秀,黎以欒

(貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院,貴州貴陽(yáng) 550025)

響應(yīng)面法優(yōu)化木瓜蛋白酶提取紅稗多糖工藝

蘇 偉,宋 玉,母應(yīng)春,李澤秀,黎以欒

(貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院,貴州貴陽(yáng) 550025)

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上應(yīng)用響應(yīng)面法對(duì)木瓜蛋白酶提取紅稗多糖工藝進(jìn)行優(yōu)化。優(yōu)化的木瓜蛋白酶提取紅稗多糖的最佳工藝條件如下:加酶量0.3%、酶作用時(shí)間1.0 h、酶作用pH6.5、酶作用溫度50 ℃,在此條件下,多糖得率為28.47%。優(yōu)化的木瓜蛋白酶法提取紅稗多糖工藝合理、可行。

木瓜蛋白酶,紅稗多糖,工藝優(yōu)化

紅稗(Bacca sedge)是一種表皮為紅褐色的粒子,也叫野紅米草、紅米和芭茅草等,最初記載于《滇南本草》,屬于莎草科苔屬植物[1]。紅稗是貴州,四川,云南等西南地區(qū)的一種特色雜糧,是云南民間一種習(xí)用藥。在很早以前,民間就將紅稗當(dāng)成食物食用,但因其產(chǎn)量低,且不是主要糧食,所以對(duì)其研究較少。紅稗營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富,主要含有粗蛋白質(zhì)5.20%,總糖76.73%,粗纖維2.57%,水分10.15%,粗脂肪2.66%,灰分2.21%,紅稗所含的必需氨基酸組成比例和人體需求相近,與FAO/WHO推薦模式較為符合[2],所以,紅稗將來(lái)很有可能成為一種較好的功能性食品原料。目前,研究發(fā)現(xiàn)多糖及其復(fù)合物,可參與和介導(dǎo)細(xì)胞的各種生命現(xiàn)象調(diào)節(jié),具有抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、抗病毒、降血脂等生物活性[3]。

李澤秀[4]等對(duì)紅稗多糖超聲提取工藝進(jìn)行了系統(tǒng)的研究,但其使用的是sevage法(三氯甲烷∶正丁醇=5∶2)來(lái)除掉蛋白,這種方法不僅耗時(shí),而且提取率也比較低(僅23.82%)。因此,優(yōu)化紅稗中多糖的提取工藝對(duì)紅稗多糖的開(kāi)發(fā)利用具有一定意義。目前,最常用于多糖提取的方法主要有水提醇沉法[5-7]、超聲輔助提取法[8-11]以及微波輔助提取法[12-16]、酶提法[17-22]等。本實(shí)驗(yàn)采用響應(yīng)面法優(yōu)化木瓜蛋白酶法提取紅稗多糖工藝,簡(jiǎn)化了除蛋白的過(guò)程,為以后開(kāi)發(fā)和利用紅稗多糖提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅稗 由貴州省遵義市君惠園食品有限公司提供;木瓜蛋白酶(酶活性80萬(wàn)U/g) 購(gòu)自廣西龐博生物工程有限公司;其他試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

FW135粉碎機(jī)、DK-98-IIA電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司;101型電熱鼓風(fēng)干燥箱 北京市光明醫(yī)藥儀器廠;BS124S電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司;HN88-Hl超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 上海汗諾儀器有限公司;TDl8M臺(tái)式低速冷凍離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀器儀表有限公司;T6新世紀(jì)紫外分光光度計(jì) 北京市普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 提取液中的多糖含量測(cè)定采用苯酚硫酸法[23],稱105 ℃干燥至質(zhì)量恒定的葡萄糖50 mg,用超純水溶解并定容至50 mL,精確量取2.5 mL葡萄糖溶液用超純水定容至50 mL的容量瓶中,配制成葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液,精確量取配制好的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL,分別置于干燥帶塞的試管中,加超純水到1.0 mL,依次加入1.0 mL的5%苯酚溶液,搖勻,再依次滴加5.0 mL的濃硫酸,搖勻,蓋好玻璃塞于室溫下靜置30 min,于490 nm下,調(diào)空白對(duì)照組的吸光度為零,測(cè)定其吸光度。以吸光度(A)為縱坐標(biāo)、葡萄糖濃度(C)為橫坐標(biāo)繪制葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖,其回歸方程為:Y=0.0036x-0.0036(R2=0.9987)。

1.2.2 紅稗多糖提取工藝流程 紅稗→除雜→粉碎→過(guò)篩→烘干→乙醇浸泡脫色→烘干→甲醇回流脫脂→烘干→磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液超聲波破碎提取→加酶→水浴提取→離心取上清液→加苯酚和濃硫酸→紫外分光光度計(jì)測(cè)吸光值→乙醇沉淀→乙醇、丙酮洗滌→真空冷凍干燥→紅稗粗多糖[24]。

1.2.3 多糖的提取與含量測(cè)定 新鮮紅稗清洗,除雜,粉粹,過(guò)120目篩,烘干,用乙醇溶劑脫色3次,每次15 min,再用甲醇在冷凝管中回流脫脂,在80 ℃的水浴鍋中加熱6 h,烘干,稱取1.0 g的紅稗粉于燒杯中,加入20倍體積的pH4.5磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液,用超聲破碎提取15 min,加木瓜蛋白酶水解,然后4000 r/min離心10 min,取上清液1 mL,用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量,按式(1)計(jì)算紅稗多糖的得率。

式(1)

式中:Y為紅稗多糖的得率(%);C為多糖的質(zhì)量濃度(μg/g);F為樣品稀釋倍數(shù);V為加入反應(yīng)液的總體積(mL);m為樣品準(zhǔn)確稱取的質(zhì)量(g)。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn) 選取加酶量,酶作用時(shí)間,酶作用pH和酶作用溫度四個(gè)因素,每個(gè)因素設(shè)置3個(gè)水平,每個(gè)水平重復(fù)三次:準(zhǔn)確稱取脫脂過(guò)的紅稗粉1.0 g左右,加入20倍體積的pH4.5磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液[25],超聲15 min,冷卻至室溫,依次加入相當(dāng)于紅稗粉質(zhì)量比0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的木瓜蛋白酶,于50 ℃的水浴鍋中提取60 min,離心(10 min,4000 r/min),取上清液,使用苯酚-硫酸比色法檢測(cè)多糖含量,考察不同加酶量對(duì)多糖得率的影響;固定加酶量為0.3%,酶作用pH為4.5,酶解溫度為50 ℃,其余步驟同上,比較不同酶作用時(shí)間(30、45、60、75、90 min)對(duì)紅稗多糖提取得率的影響;控制加酶量為0.3%,酶作用溫度為50 ℃,酶作用時(shí)間為60 min,通過(guò)加入20倍體積的pH為3.5、4.5、5.5、6.5、7.5的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液,比較不同酶解pH對(duì)紅稗多糖得率的影響;控制加酶量為0.3%,酶作用時(shí)間為60 min,酶作用pH為6.5,比較不同酶解溫度(20、30、40、50、60 ℃)對(duì)紅稗多糖得率的影響。按照公式(1)計(jì)算多糖的得率。

1.2.5 優(yōu)化實(shí)驗(yàn) 響應(yīng)面法對(duì)紅稗多糖提取條件優(yōu)化,根據(jù)Box-Behnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,選取4因素(加酶量,酶作用pH,酶作用時(shí)間,酶作用溫度)3水平對(duì)紅稗多糖提取條件進(jìn)行優(yōu)化,實(shí)驗(yàn)因子和水平見(jiàn)表1。

表1 Box-Behnken設(shè)計(jì)因素水平表Table 1 Factors and levels used in Box-Behnken

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Origin 9.0軟件作圖,Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 木瓜蛋白酶加酶量對(duì)紅稗多糖得率的影響 由圖1可知,在加酶量低于0.3%時(shí)，隨著木瓜蛋白酶加酶量的增大,紅稗多糖得率逐漸增大,當(dāng)加酶量超過(guò)0.3%以后,多糖得率趨于平緩。說(shuō)明酶用量在0.3%之前,底物和酶沒(méi)有充分的結(jié)合,而在0.3%的酶濃度時(shí),底物和酶已經(jīng)完全結(jié)合,多糖已經(jīng)完全釋放,當(dāng)再增大酶用量時(shí),增加的酶分子也沒(méi)有機(jī)會(huì)與底物結(jié)合,多糖得率就很難以有顯著增加。因此,選擇木瓜蛋白酶加酶量為0.3%。

圖1 不同加酶量對(duì)紅稗多糖得率的影響Fig.1 Effect of enzyme amount on the extraction yield of polysaccharide of Baccage sedge

圖2 不同酶作用時(shí)間對(duì)紅稗多糖得率的影響Fig. 2 Effect of different enzymolysis time on the extraction yield of polysaccharide of Baccage sedge

2.1.2 木瓜蛋白酶作用時(shí)間對(duì)紅稗多糖得率的影響 由圖2可知,在60 min之前隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng),紅稗多糖得率呈上升趨向,在60 min時(shí)到達(dá)極值,而后隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng),紅稗多糖得率反而呈下降趨勢(shì),這估計(jì)是由于有些糖苷鍵因提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)而在蛋白酶的催化作用下被裂解了,或者是提取時(shí)間太久使得多糖的結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。因此選擇酶作用時(shí)間為60 min。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

2.1.3 木瓜蛋白酶酶解pH對(duì)多糖得率的影響 由圖3可知,在pH6.5之前隨著pH的增大,紅稗多糖的得率逐漸增加,當(dāng)增加到pH6.5時(shí),紅稗多糖的得率達(dá)到極值,隨后再繼續(xù)增大pH,紅稗多糖得率反而呈下降趨勢(shì)。因?yàn)槟竟系鞍酌傅淖钸mpH在6.5左右,pH除了對(duì)酶活性有很大影響外,對(duì)酶的穩(wěn)定性也有很大影響。過(guò)高過(guò)低的pH會(huì)改變酶的活性中心的構(gòu)象,甚至改變整個(gè)酶分子的結(jié)構(gòu)使其變性失活,從而影響紅稗多糖的得率。因此最佳pH選擇6.5。

圖3 不同酶作用pH對(duì)紅稗多糖得率的影響Fig.3 Effect of different pH value on the extraction yield of polysaccharide of Baccage sedge

2.1.4 木瓜蛋白酶作用溫度對(duì)紅稗多糖得率的影響 由圖4可得知,在50 ℃之前隨著酶作用溫度的升高,紅稗多糖得率逐漸增大,于50 ℃時(shí)多糖得率達(dá)到最大值,而當(dāng)溫度大于50 ℃后多糖得率出現(xiàn)下降的趨勢(shì),出現(xiàn)以上的現(xiàn)象是因?yàn)闇囟葘?duì)酶促反應(yīng)和細(xì)胞擴(kuò)散反應(yīng)具有雙重影響,木瓜蛋白酶的最適作用溫度為50 ℃左右,當(dāng)溫度過(guò)高會(huì)使酶活力降低甚至失去活性,使得多糖得率下降。因此,最佳溫度選擇50 ℃。

圖4 不同酶作用溫度對(duì)紅稗多糖得率的影響Fig.4 Effect of different enzymolysis temperature on the extraction yield of polysaccharide of Baccage sedge

表3 響應(yīng)面ANOVA分析結(jié)果Table 3 Response surface analysis results ANOVA

注:p<0.01,為差異極顯著,用“**”表示;p<0.05,為差異顯著,用“*”表示;p>0.05,為不顯著。

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

2.2.1 木瓜蛋白酶對(duì)紅稗多糖提取工藝的響應(yīng)面優(yōu)化 以單因素實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ),采用Box-Behnken的中心原理進(jìn)行實(shí)驗(yàn),以多糖得率(%)作為響應(yīng)值。以加酶量(%),酶作用時(shí)間(h),酶作用pH,酶作用溫度(℃)四因素作為自變量,結(jié)果如表2所示。

用響應(yīng)面分析軟件Design-Expert 8.0.6對(duì)表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合分析(analysis of variance,ANOVA)結(jié)果見(jiàn)表3。

各個(gè)實(shí)驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值(紅稗多糖得率)的影響,可以通過(guò)以下回歸擬合后與紅稗多糖得率(Y)的回歸方程表示:

Y=28.99+0.84A+0.71B-0.81C-0.90D-2.43AB+0.98AC-0.37AD-3.25BC+2.31BD+1.29CD-4.22A2-3.81B2-3.35C2-1.51D2

2.2.2 各因素對(duì)紅稗多糖得率交互影響的響應(yīng)面圖 各圖顯示酶作用時(shí)間,酶作用溫度,加酶量,酶作用pH任意兩個(gè)因素之間的交互作用對(duì)紅稗多糖得率(Y)的影響,由響應(yīng)面三維圖的最高點(diǎn)可以看出,在所選因素的范圍內(nèi)有極值存在,這個(gè)值就是響應(yīng)面的最高點(diǎn)。

使用Design Expert 8.0.6軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,并繪制得出加酶量、酶作用時(shí)間、酶作用pH及酶作用溫度對(duì)響應(yīng)值紅稗多糖得率的交互影響的曲面圖,各因素固定值為0水平值,結(jié)果如圖5所示。

圖5 各因素對(duì)紅稗多糖得率交互影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface graphs showing the interactive effects of hydrolysis conditions on Baccage sedge

由圖5(a)、圖5(c)、圖5(d)、圖5(e)、圖5(f)得,等高線呈橢圓形,說(shuō)明加酶量和酶作用時(shí)間、加酶量和酶作用溫度、酶作用時(shí)間和酶作用pH、酶作用時(shí)間和酶作用溫度、酶作用pH和酶作用溫度均存在交互作用。由圖5(b)可知,其等高線形狀接近圓形,說(shuō)明加酶量和酶作用時(shí)間這兩因素交互作用不明顯。用軟件Design Expert 8.0.6 分析得到最優(yōu)工藝參數(shù)為:加酶量0.31%,酶作用時(shí)間1.02 h,酶作用溫度50.39 ℃,酶作用pH6.35,紅稗多糖的得率為29.28%。

表4 最佳提取條件驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)Table 4 Verification experiment of the optimal extraction conditions

2.2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 為了驗(yàn)證響應(yīng)面法的可行性,采用得到的最佳提取條件進(jìn)行紅稗多糖浸提的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),見(jiàn)表4,同時(shí)考慮到實(shí)際操作和生產(chǎn)條件等因素,修正工藝參數(shù)為:加酶量0.3%,酶作用時(shí)間1.0 h,酶作用溫度50 ℃,酶作用pH6.5,進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)得到的多糖實(shí)際得率28.47%,與預(yù)測(cè)值29.28%,相對(duì)誤差為0.81%。因此,響應(yīng)面法優(yōu)化木瓜蛋白酶對(duì)紅稗多糖提取條件是可行的,得到的紅稗多糖提取條件是具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值的。

3 結(jié)論

木瓜蛋白酶是一種含巰基(—SH)肽鏈內(nèi)切酶,具有蛋白酶和酯酶的活性[25],在紅稗多糖提取過(guò)程中可使紅稗中的游離蛋白質(zhì)發(fā)生水解,并進(jìn)一步水解蛋白等結(jié)合蛋白中的蛋白質(zhì),減少它們與紅稗多糖的結(jié)合力,有利于紅稗多糖的溶出,同時(shí)也提高了紅稗多糖的純度,簡(jiǎn)化了紅稗多糖的提取工藝。

本實(shí)驗(yàn)采用響應(yīng)面法優(yōu)化木瓜蛋白酶提取紅稗多糖工藝,通過(guò)F值得出,四個(gè)因素對(duì)紅稗多糖得率的影響順序從大到小依次為:酶作用的溫度>加酶量>酶作用的pH>酶作用的時(shí)間。經(jīng)單因素和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn),得出木瓜蛋白酶提取紅稗多糖的最佳工藝為加酶量0.3%、酶作用pH6.5、酶作用時(shí)間1.0 h、酶作用溫度50 ℃,在此條件下得到的實(shí)際多糖得率為28.47%，與預(yù)測(cè)值的相對(duì)誤差僅為2.77%,表明Box-Benhnken設(shè)計(jì)法用于木瓜蛋白酶提取紅稗多糖工藝優(yōu)化是可行的。李澤秀[4]等人采用超聲波輔助分離提取紅稗多糖,實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到實(shí)際多糖得率為23.82%,這表明木瓜蛋白酶輔助提取紅稗多糖優(yōu)于超聲提取。

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Optimization of extraction of polysaccharides from Baccage Sedge using papain by response surface methodology

SU Wei,SONG Yu,MU Ying-chun,LI Ze-xiu,LI Yi-luan

(School of Liquor and Food Engineering,Guizhou University,Guiyang 550025,China)

Based on the single factor experiments,the response surface methodology(RSM)was employed to optimize the extraction conditions of polysaccharides from Baccage sedge using papain. The results of optimum extraction conditions were as follow:enzyme amount 0.3%,enzyme time 1.0 h,pH6.5,temperature of 50 ℃. Under these conditions,the average extraction yield was 28.47%. The optimization of Baccage sedge extraction process technology was reasonable and feasible.

papain;Baccage sedge polysaccharide;extraction process

2016-10-19

蘇偉(1974-)，男，博士，副教授，研究方向：食品加工與安全，E-mail:suwei1886@163.com。

貴州省科技廳農(nóng)業(yè)攻關(guān)項(xiàng)目(黔科合NY[2013]3052號(hào))。

TS201.2

B

1002-0306(2017)07-0256-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.07.042