竹蓀中多酚提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性研究

吳林秀,胡榮康,陳藝煊,王娟娟,劉曉艷,*,劉 斌,*

(1.福建農(nóng)林大學食品科學學院,福建福州 350002; 2.國家菌草工程技術(shù)研究中心,福建福州 350002)

竹蓀中多酚提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性研究

吳林秀1,2,胡榮康1,2,陳藝煊1,2,王娟娟1,劉曉艷1,2,*,劉 斌1,2,*

(1.福建農(nóng)林大學食品科學學院,福建福州 350002; 2.國家菌草工程技術(shù)研究中心,福建福州 350002)

本文以長裙竹蓀為原料,以多酚得率為考察指標,通過乙醇濃度、料液比、提取溫度和提取時間4個單因素實驗和正交實驗確定竹蓀多酚的最佳提取條件;并且通過竹蓀提取液對2,2-二苯代苦味酰基(DPPH)自由基和羥基自由基的清除效果,評價竹蓀提取液的體外抗氧化活性。結(jié)果表明:在乙醇濃度為40%、提取溫度為80 ℃、料液比為1∶40 g/mL、提取時間為5 h的條件下,竹蓀多酚的得率最高,可達(8.18±0.52) mg/g;竹蓀提取液呈現(xiàn)出較好的抗氧化活性,且與濃度存在一定的量效關(guān)系,在質(zhì)量濃度為20 mg/mL時,提取液對DPPH自由基的清除率可達84.28%±1.15%,對羥基自由基清除率達到76.49%±1.14%。

竹蓀,多酚,抗氧化性,正交設(shè)計

竹蓀(Dictyophoraindusiata)屬真菌類,又名竹參、竹笙,其香氣芬芳,味道鮮美,營養(yǎng)豐富,含有人體所需的各種氨基酸以及維生素,在民間有“真菌皇后”的稱號[1],自古就被譽為“草八珍”[2-3];其子實體由菌托、菌柄、菌裙和菌蓋4部分組成[1]。近年來,國內(nèi)外對竹蓀的研究主要集中在其子實體提取物的成分分離、鑒定及免疫[4]、抗氧化[5]、抗腫瘤、降血脂等生物活性作用。而目前專門針對竹蓀多酚的研究不多,對其提取方法和體外抗氧化活性缺乏系統(tǒng)研究。王彥輝等人[6]用破壁-水提法對竹蓀總多酚的含量進行檢測,其含量為5.53 mg/g。李小雨等人[7]用福林酚法對竹蓀多糖里的多酚進行測定,含量為(2.90±0.10) mg/g。呂瑞等人[8]對竹蓀水提物進行抗氧化實驗,發(fā)現(xiàn)竹蓀水提物對羥自由基和DPPH自由基均具有不同程度的清除效果。本文以長裙竹蓀作為實驗原料,采用Folin-Ciocalten法測定多酚含量,以多酚得率為考察指標,通過單因素實驗確定乙醇、料液比、提取溫度和提取時間四個因素的合適水平,并在此基礎(chǔ)上進行正交實驗設(shè)計,優(yōu)化提取工藝以提高竹蓀多酚得率,并測定竹蓀提取液的抗氧化活性,為竹蓀在醫(yī)藥和食品領(lǐng)域提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

長裙竹蓀 購于福建省古田縣,清洗,烘干(80 ℃)、粉碎、過30目篩備用;沒食子酸 Sigma公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH) Sigma公司;福林酚試劑(Folin-Ciocalteu) 國藥集團化學試劑有限公司;其他試劑均為分析純。

電子分析天平EO2140 賽多利斯科學儀器北京有限公司;數(shù)顯三用水浴鍋 HH 金壇市精達儀器制造廠;臺式高速冷凍離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司;循環(huán)水式多用真空泵SHB-III 鄭州長城科技工貿(mào)有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海申生科技有限公司;紫外可見分光光度計7200 上海精密科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 竹蓀多酚的提取 準確稱取竹蓀粉末5.00 g,加一定料液比的乙醇溶液,在一定的溫度下回流提取,過濾,離心,取上清液,即為竹蓀提取液。

1.2.2 多酚含量的測定 分別取上述溶液0.3 mL,依次加入1.5 mL Folin-Ciocalteu試劑(稀釋10倍)和 1.2 mL 2%碳酸鈉溶液,45 ℃水浴15 min,在765 nm波長下測定樣品的吸光度。

1.2.3 沒食子酸標準曲線的繪制 精密稱取0.01200 g沒食子酸用水定容至100 mL,配成濃度為20、40、60、80、100、120 μg/mL溶液。以沒食子酸濃度(μg/mL)為橫坐標,吸光值為縱坐標,繪制沒食子酸標準曲線,計算回歸方程。

1.2.4 竹蓀多酚得率的測定 取不同條件下提取的樣液,測吸光值,通過上述回歸方程計算得到樣液中多酚的質(zhì)量濃度,按下式計算得率。

多酚得率=ρ·n·V/W

式(1)

式中,ρ為竹蓀提取液多酚的質(zhì)量濃度(mg/mL);n為提取液稀釋因子;V為提取液體積(mL);W為原料質(zhì)量(g)。

1.2.5 竹蓀多酚提取的單因素實驗

1.2.5.1 乙醇濃度對竹蓀多酚提取效果的影響 取竹蓀粉末5.0 g,按料液比1∶40 (g/mL),分別加入20%、40%、60%、80%的乙醇溶液,置于70 ℃水浴鍋中回流提取4 h,過濾,離心,取上清液,即為竹蓀提取液。

1.2.5.2 溫度對竹蓀多酚提取效果的影響 取竹蓀粉末5.0 g,按料液比1∶40 (g/mL),加入80%的乙醇溶液,分別置于60、70、80、90、100 ℃水浴鍋中回流提取4 h,過濾,離心,取上清液,即為竹蓀提取液。

1.2.5.3 料液比對竹蓀多酚提取效果的影響 取竹蓀粉末5.0 g,按料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 (g/mL),加入80%的乙醇溶液,置于70 ℃水浴鍋中回流提取4 h,過濾,離心,取上清液,即為竹蓀提取液。

1.2.5.4 時間對竹蓀多酚提取效果的影響 取竹蓀粉末5.0 g,按料液比(g/mL)1∶40,加入80%的乙醇溶液,置于70 ℃水浴鍋中回流提取1、2、3、4、5 h,過濾,離心,取上清液,即為竹蓀提取液。

1.2.6 正交實驗 為了進一步優(yōu)化多酚的提取條件,根據(jù)單因素實驗結(jié)果,以乙醇濃度、提取溫度、提取時間、料液比為自變量,進行4因素3水平正交實驗設(shè)計,以總多酚得率為指標進行正交實驗設(shè)計,因素水平設(shè)計見表1。

表1 正交因素水平表Table 1 The factors and levels of orthogonal design

1.2.7 體外抗氧化活性的測定

1.2.7.1 DPPH自由基清除能力的測定 參考文獻[9]的方法,將DPPH試劑溶解在無水乙醇中,配制成0.4 mmol/L溶液,取2.0 mL DPPH溶液分別與1.25、2.5、5、10、20 mg/mL濃度的樣品1∶1混合,于避光處保存35 min,于4500 r/min離心15 min,取其上清液在波長為517 nm處測量其吸光值,以VC做對照,按公式(2)計算清除率。重復3次。

DPPH清除率(%)=[1-(A樣品-A對照)/A空白]×100

式(2)

式中:A樣品:樣品與DPPH反應的吸光值;A對照:蒸餾水代替DPPH的吸光值;A空白:蒸餾水代替樣品的吸光值。

1.2.7.2 羥自由基清除能力的測定 參考文獻[10]，取1.25、2.5、5、10、20 mg/mL濃度的樣品溶液1 mL,加入9 mmol/L FeSO41 mL、9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液1 mL,最后加8.8 mmol/L H2O21 mL啟動反應,在37 ℃水浴下反應30 min,在510 nm下測定各濃度溶液的吸光值。以蒸餾水1 mL代替樣品作為空白;以蒸餾水1 mL代替H2O2作為顏色對照,其它反應物不變,按下式計算·OH清除率。重復3次。

·OH清除率(%)=[1-(A樣品-A對照)/A空白]×100

式(3)

式中:A樣品:樣品吸光值;A空白:蒸餾水代替樣品的吸光值;A對照:蒸餾水代替H2O2的吸光值。

1.3 統(tǒng)計分析

利用Origin8和SPSS17.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析實驗,每組實驗均重復3次,結(jié)果取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 回歸方程的確立

以沒食子酸標準溶液濃度為橫坐標,以其吸光度為縱坐標,繪制標準曲線,計算得沒食子酸標準曲線回歸方程為:可得其回歸方程為y=0.00934x+0.01236,R2=0.99514。沒食子酸濃度在0～120 μg/mL范圍內(nèi),吸光值與沒食子酸濃度線性關(guān)系良好。

2.2 竹蓀多酚提取單因素實驗

2.2.1 乙醇濃度對竹蓀多酚得率的影響 由圖1可知,乙醇濃度在0～20%時,水作為主要的提取溶劑,多酚得率比低濃度的乙醇高,這與王彥輝[6]等人對棘托竹蓀孢子粉抗氧化活性研究的結(jié)果相近,但由于竹蓀的品種和提取工藝的不同,導致結(jié)果有所差異;乙醇濃度在20%～80%范圍內(nèi)時,隨著乙醇濃度的升高,多酚得率逐漸提高;根據(jù)相似相溶原理,當乙醇濃度增大時,溶劑的極性增加,有利于多酚的溶出[11],且80%乙醇的極性與竹蓀多酚的極性相近,因而多酚的溶解性較大,有利于提取[12]。因此,乙醇濃度為80%時,多酚得率最高為(7.84±0.61) mg/g。

圖1 乙醇濃度對竹蓀多酚得率的影響Fig.1 Effect of alcohol concentration on the yield of D. indusiata polyphenols

2.2.2 提取溫度對竹蓀多酚得率的影響 由圖2可知,在提取溫度為60～100 ℃之間,隨著提取溫度的升高,多酚含量先增加后減少;在溫度為60～70 ℃之間時,隨著溫度的升高,細胞組織破壞,使得多酚更好的從細胞中溶出,從而增加多酚的含量;但溫度過高,易使多酚氧化、水解[13];因此,提取溫度在70 ℃時,多酚得率最高為(6.31±0.55) mg/g。

圖2 提取溫度對竹蓀多酚得率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on the yield of D. indusiata polyphenols

2.2.3 料液比對竹蓀多酚得率的影響 由圖3可知,在料液比為1∶10～1∶50 g/mL之間,隨著料液比比值的增大,多酚含量先增加后減少;在料液比為1∶10～1∶40 g/mL之間時,隨著溶劑量的增加,竹蓀粉末與溶劑的接觸面增加,有利于多酚類物質(zhì)的溶出[14],繼續(xù)增加溶劑量,多酚得率下降,可能原因是擴散達到了平衡,多酚類物質(zhì)不再隨著溶劑量的增加而增加[15];從濃縮成本考慮,選用料液比為1∶40 g/mL最佳。

圖3 料液比對竹蓀多酚得率的影響Fig.3 Effect of substrate to liquid ration on yield of D. indusiata polyphenols

2.2.4 提取時間對竹蓀多酚得率的影響 由圖4可知,在提取時間為1～5 h之間,隨著時間的延長,多酚含量整體呈上升趨勢,可能是因為隨著時間的增加,多酚逐漸溶出,但提取時間過長,易使多酚受到破壞,而且提取的成本也增加;綜合以上原因,提取時間為4 h時較好。

圖4 提取時間對竹蓀多酚得率的影響Fig.4 Effect of extraction duration on the yield of D. indusiata polyphenols

2.3 正交實驗

由表2可知,4個因素對竹蓀多酚的影響順序為B>D>C>A,即提取溫度>提取時間>料液比>乙醇濃度,提取溫度對總多酚的得率影響最大,在一定范圍內(nèi),提取溫度越高得率越高;最優(yōu)提取條件為A1B2C2D3,即乙醇濃度為40%、提取溫度為80 ℃、料液比為1∶40 g/mL、提取時間為5 h。

表2 L9(34)正交實驗結(jié)果Table 2 Orthogonal experiment and its results

2.4 驗證實驗

取竹蓀粉末5.0 g,在最佳提取條件下提取3次,取平均值,驗證實驗結(jié)果。測得竹蓀多酚得率為(8.18±0.52) mg/g,明顯高于其他組合,說明實驗結(jié)果與該設(shè)計符合良好,優(yōu)化的提取工藝參數(shù)是可靠的,此正交實驗具有可行性。

2.5 竹蓀多酚抗氧化活性分析

2.5.1 對DPPH自由基清除作用 由圖5可知,在多酚質(zhì)量濃度為1.25～20 mg/mL之間,DPPH自由基的清除率與竹蓀提取液的質(zhì)量濃度呈正相關(guān),當質(zhì)量濃度為20 mg/mL時,竹蓀提取液對DPPH自由基的清除率達到84.28%±1.15%,表明其有一定的抗氧化能力,但其抗氧化能力不及相同條件下等濃度的VC。這與呂瑞等人在研究竹蓀水提物體外抗氧化活性的趨勢一致,但在相同的清除率下,水提物的抗氧化活性比醇提物效果更好,可能原因是水提物中含有多糖等抗氧化活性較高的物質(zhì)存在,這與江玉姬等人[16]的研究結(jié)果一致。

圖5 竹蓀提取液對DPPH自由基的清除能力Fig.5 DPPH radical scavenging ability of D. indusiata extract

2.5.2 對羥自由基清除作用 由圖6可知,當多酚提取液質(zhì)量濃度在1.25～20 mg/mL之間時,羥自由基的清除率與竹蓀提取液的質(zhì)量濃度呈正相關(guān),當質(zhì)量濃度為20 mg/mL時,竹蓀提取液對羥基自由基清除率達到76.49%±1.14%。竹蓀提取液的抗氧化能力比林陳強等人[16]研究報道的較低,可能原因是提取的竹蓀種類和工藝條件不同所致。

圖6 竹蓀提取液對羥基自由基的清除能力Fig.6 Hydroxyl free radical scavenging ability of D. indusiata extract

3 結(jié)論

通過正交實驗,得出竹蓀多酚的最佳提取工藝條件為:乙醇濃度為40%、提取溫度為80 ℃、料液比為1∶40 g/mL、提取時間為5 h,在該條件下竹蓀多酚的得率為(8.18±0.52) mg/g。

體外抗氧化實驗研究表明:當竹蓀多酚質(zhì)量濃度為20 mg/mL時,提取液對DPPH自由基、羥基自由基的清除率分別達到84.28%±1.15%和76.49%±1.14%,且其抗氧化能力與提取液濃度存在一定的量效關(guān)系。因此,竹蓀提取液可以作為天然的抗氧化劑,具有很好的開發(fā)前景。

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Study on the extraction and antioxidant activity of total phenolic compounds fromDictyophoraindusiata

WU Lin-xiu1,2,HU Rong-kang1,2,CHEN Yi-xuan1,2,WANG Juan-juan1,LIU Xiao-yan1,2,*,LIU Bin1,2,*

(1.College of Food Science,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002,China; 2.National Engineering Research Center of JUNCAO Technology,Fuzhou 350002,China)

The contents of polyphenols fromDictyophoraindusiatawere determined by the Folin-Ciocalteu method in the paper. The effects of optimal alcohol concentration,liquid-solid ratio,extraction time and extraction temperature yield ofD.indusiatawere investigated,and the extraction technology was optimized by single-factor experiments and orthogonal design. The antioxidant activity ofD.indusiataphenols was also studied. The results showed that the optimal extraction conditions were found that the optimal alcohol concentration,solid-liquid ratio,extraction time and extraction temperature were 40%,1∶40 g/mL,80 ℃ and 5 h respectively. Under these conditions,the largest extraction quantity of total phenols could reach(8.18±0.52) mg/g. The DPPH radical scavenging ratio and ·OH radicals of the polyphenol extracts reached 84.28%±1.15% and 76.49%±1.14% respectively when the extract concentration was 20 mg/mL.

Dictyophoraindusiata;polyphenol;antioxidant;orthogonal design

2016-09-29

吳林秀(1992-),女,在讀碩士生,研究方向:食品化學與營養(yǎng),E-mail:18359171036@163.com。

*通訊作者:劉斌(1969-),男,博士，教授,研究方向:食品生物技術(shù),E-mail:liubin618@hotmail.com。 劉曉艷(1981-),女,在職博士,助理實驗師,研究方向:食品營養(yǎng),E-mail:liuxiaoyan8112@163.com。

國家科技支撐計劃子課題(2014BAD15B01-6);福建省科技重大專碩(2014NZ2002-1);福建農(nóng)林大學青年基金課題(k13xjj17a)。

TS201.1

B

1002-0306(2017)07-0203-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.07.031