正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化發(fā)酵蜈蚣粉中總黃酮提取工藝

王彥多,劉春雨,呂世潔,王 穎,王立娜,王集會(huì)

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,山東濟(jì)南 250355; 2.山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心,山東濟(jì)南 250355)

正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化發(fā)酵蜈蚣粉中總黃酮提取工藝

王彥多1,劉春雨1,呂世潔1,王 穎1,王立娜1,王集會(huì)2，*

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,山東濟(jì)南 250355; 2.山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心,山東濟(jì)南 250355)

目的:采用正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化發(fā)酵蜈蚣粉總黃酮回流提取工藝。方法:在對(duì)發(fā)酵蜈蚣粉中總黃酮提取條件進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以提取溫度(A)、料液比(B)和提取時(shí)間(C)為自變量,發(fā)酵蜈蚣粉總黃酮得率為因變量,利用正交實(shí)驗(yàn)法探究最佳提取工藝條件。同時(shí)采用MTT體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)方法,研究發(fā)酵蜈蚣粉提取物對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞的抑制作用。結(jié)果:影響發(fā)酵蜈蚣粉總黃酮得率提取因素的大小次序?yàn)?料液比>提取溫度>提取時(shí)間,在此次實(shí)驗(yàn)中,發(fā)酵蜈蚣粉最佳提取工藝為:提取溫度80 ℃,料液比1∶40 (g∶mL),提取時(shí)間2.5 h,在此條件下發(fā)酵蜈蚣粉中總黃酮得率為1.970%;提取獲得的不同濃度的發(fā)酵蜈蚣醇提液對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞的抑制率均大于順鉑,具有較優(yōu)良的抗腫瘤活性。

發(fā)酵蜈蚣粉,正交實(shí)驗(yàn),回流提取,總黃酮,MTT法,肺腺癌A549細(xì)胞株

蜈蚣為蜈蚣科動(dòng)物少棘巨蜈蚣(ScolopendrasubspinipesmutilansL.Koch)的干燥體。辛,溫;有毒[1]。作為傳統(tǒng)中藥材,具有息風(fēng)止痙,解毒散結(jié),通絡(luò)止痛的作用[2]?，F(xiàn)在臨床常用于治療腫瘤、原發(fā)性高血壓、糖尿病及并發(fā)癥、神經(jīng)性頭痛、偏頭痛等[3-4]。

黃酮類(lèi)化合物具有抗炎、抗氧化壓力和抑制癌基因表達(dá)的作用[5]。而通過(guò)使用球孢白僵菌(Beauveriabassiana(Bals.)Vuill)對(duì)蜈蚣進(jìn)行發(fā)酵可以提高蜈蚣中黃酮類(lèi)物質(zhì)的含量,增強(qiáng)其解毒散結(jié)的功效,還可以較大幅度的改變藥性、提高療效、降低毒副作用[6]。由此本實(shí)驗(yàn)采用水浴回流提取法、通過(guò)設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵蜈蚣粉總黃酮的提取工藝,并對(duì)其進(jìn)行體外抗腫瘤活性研究。為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用該中藥提供理論依據(jù)。目前,對(duì)蜈蚣的研究大多聚焦于未發(fā)酵蜈蚣,而對(duì)發(fā)酵類(lèi)蜈蚣黃酮提取及生物活性研究卻鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蘆丁對(duì)照品 中國(guó)醫(yī)藥上?；瘜W(xué)試劑公司生產(chǎn);無(wú)水乙醇,亞硝酸鈉,六水氯化鋁,氫氧化鈉等試劑均為分析純;RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清 賽默飛世爾生物制品北京有限公司;胰酶 上海碧云天生物技術(shù)有限公司;注射用順鉑 齊魯制藥有限公司;MTT。

本實(shí)驗(yàn)所使用的蜈蚣粉 安徽亳州市(批號(hào):20150730),經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院高德民副教授鑒定為少棘巨蜈蚣(ScolopendrasubspinipesmutilansL.Koch)。發(fā)酵蜈蚣粉(批號(hào):20160301)由山東中醫(yī)藥大學(xué)化學(xué)實(shí)驗(yàn)室自制。

肺腺癌A549細(xì)胞株 由山東省立醫(yī)院提供。

UV9100B型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京萊伯泰科儀器有限公司;ST 16R高速冷凍離心機(jī) 賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司;SHB-III循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;FA1004N電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司;SK-1快速混勻漩渦器 中國(guó) 深圳;遠(yuǎn)紅外輻射干燥箱 上海陽(yáng)光實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;梅特勒-托利多分析天平 上海先悅機(jī)電有限公司;Memmert 二氧化碳培養(yǎng)箱 北京五洲東方科技發(fā)展有限公司;EL340i型全自動(dòng)酶標(biāo)儀 Molecular Davices。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱(chēng)取蘆丁對(duì)照品0.0200 g,用60%的乙醇溶解并定容至100 mL容量瓶中,靜置,得到2 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液[7]。分別取此溶液0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL,分別加入5個(gè)干燥的10 mL試管中,加入30%的乙醇至5 mL,再加入0.30 mL 5%的NaNO2溶液,搖勻,靜置6 min,加入0.60 mL 10%的AlCl3·6H2O溶液,搖勻,靜置5 min,然后加入2.00 mL 4%的NaOH溶液,最后加入30%乙醇定容至10 mL刻度,搖勻。在 510 nm處測(cè)定吸光度,以吸光度對(duì)濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 提取工藝流程 精密稱(chēng)取發(fā)酵蜈蚣粉1.0000 g,按料液比加入80%乙醇,回流提取兩次,抽濾,取上清液于3000 r/min離心10 min,收集上清液于50 mL容量瓶中定容,置于4 ℃ 冰箱保存?zhèn)溆肹8-9]。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 以溫度、料液比和提取時(shí)間三個(gè)因素為研究對(duì)象,以發(fā)酵蜈蚣粉總黃酮得率為指標(biāo)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。

1.2.3.1 提取溫度對(duì)總黃酮得率的影響 以發(fā)酵蜈蚣粉中總黃酮得率為指標(biāo),在固定料液比1∶25(g∶mL)、乙醇濃度80%、提取兩次的條件下,考察不同提取溫度(60、70、80、90、100 ℃)對(duì)總黃酮得率的影響。

1.2.3.2 料液比對(duì)總黃酮得率的影響 以發(fā)酵蜈蚣粉中總黃酮得率為指標(biāo),在固定提取溫度70 ℃、回流提取時(shí)間1.5 h、乙醇濃度80%、提取兩次的條件下,考察不同料液比(1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40 g∶mL)對(duì)總黃酮得率的影響[10]。

1.2.3.3 提取時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響 以發(fā)酵蜈蚣粉中總黃酮得率為指標(biāo),在固定提取溫度70 ℃、料液比1∶25(g∶mL)、乙醇濃度80%、提取兩次的條件下,考察不同提取時(shí)間(0.5、1、1.5、2、2.5 h)對(duì)總黃酮得率的影響。

1.2.4 工藝條件的優(yōu)化 為了獲得以乙醇作為溶劑,回流提取發(fā)酵蜈蚣粉中總黃酮的最佳工藝條件,在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,以總黃酮得率為指標(biāo),設(shè)計(jì)三因素、三水平的正交實(shí)驗(yàn)。

表1 因素水平編碼Table 1 Coded of factors and levels

1.2.5 發(fā)酵中藥蜈蚣中總黃酮得率的計(jì)算:

式中:A為吸光度,Y為發(fā)酵中藥蜈蚣總黃酮得率(%)。

1.2.6 抑瘤實(shí)驗(yàn)方法 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肺腺癌A549細(xì)胞以每孔100 μL接種于96孔培養(yǎng)板,每孔培養(yǎng)前的細(xì)胞個(gè)數(shù)為8×104,預(yù)留三個(gè)調(diào)零孔,調(diào)零孔只加不含血清的1640培養(yǎng)基,不加細(xì)胞,在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后,細(xì)胞數(shù)增長(zhǎng)至整個(gè)孔的90%左右,棄掉培養(yǎng)基,調(diào)零組、空白對(duì)照組加100 μL不含血清的1640培養(yǎng)基,陽(yáng)性對(duì)照組加100 μg/mL的順鉑100 μL,其他給藥組每孔分別加入0.125,0.25,0.5,1,2 mg/mL的藥物100 μL,每個(gè)濃度的藥物重復(fù)5個(gè)孔,其中以發(fā)酵蜈蚣醇提液作為對(duì)照組。然后細(xì)胞在37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后,每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μL于培養(yǎng)箱內(nèi)避光反應(yīng)4 h。吸去上清液,加入100 μL DMSO,用酶標(biāo)儀于490 nm測(cè)定OD值,按下式計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞的抑制率[11]。

細(xì)胞抑制率(%)=[1-(加藥組OD-調(diào)零組)/(空白組OD-調(diào)零組)]×100

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)用SPSS 17.0單因素方差、多因素方差分析進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)驗(yàn)結(jié)果

蘆丁對(duì)照品溶液在吸光度0.2～0.7 L/(g·cm)線性范圍內(nèi)成良好線性關(guān)系,線性回歸方程為A=0.9543C,其中A為吸光度,C為黃酮含量(mg/mL),線性相關(guān)系數(shù)為r=0.9996。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 提取溫度對(duì)總黃酮提取量的影響 由圖1可知,隨著提取溫度的上升,發(fā)酵蜈蚣粉中總黃酮的得率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),溫度為80 ℃ 時(shí)總黃酮得率達(dá)到最大,在提取溫度超過(guò)80 ℃ 后,總黃酮得率逐漸下降,下降至90 ℃ 后趨于穩(wěn)定。是因?yàn)閺妮^低溫度升至 80 ℃,熱效率升高,分子運(yùn)動(dòng)加快,利于黃酮的破壁溶出;但隨著溫度的繼續(xù)升高,會(huì)引起黃酮類(lèi)化合物結(jié)構(gòu)被破壞,部分蛋白凝固從而不利于黃酮溶出,故得率降低。據(jù)此,選定70、80、90 ℃ 作為正交實(shí)驗(yàn)中提取溫度的三個(gè)水平[12-14]。

圖1 提取溫度對(duì)發(fā)酵蜈蚣粉總黃酮得率的影響Fig.1 The effect of temperature on the yield of total flavonoids

2.2.2 料液比對(duì)總黃酮提取量的影響 由圖2可知,隨著溶劑量的增加,總黃酮得率呈現(xiàn)先升高后平穩(wěn)的趨勢(shì)。當(dāng)料液比低于1∶35 (g∶mL)時(shí),提取總黃酮得率隨著料液比的增大而增大,這是因?yàn)榈寐实母叩团c黃酮向溶劑擴(kuò)散的難易程度有關(guān),料液比小,溶劑量少,導(dǎo)致兩相界面間的濃度差小,不利于黃酮的擴(kuò)散。但當(dāng)料液比高于1∶35 (g∶mL)時(shí),提取總黃酮得率隨料液比的增大增長(zhǎng)趨勢(shì)明顯降低,這說(shuō)明一定比例的溶劑即可將有效成分提取完全。因此,選定1∶30、1∶35、 1∶40 (g∶mL)作為正交實(shí)驗(yàn)中料液比的三個(gè)水平[15-17]。

圖2 料液比對(duì)發(fā)酵蜈蚣粉總黃酮得率的影響Fig.2 The effect of solid on the yield of total flavonids

2.2.3 提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取量的影響 由圖3可知,隨著時(shí)間的增加,發(fā)酵蜈蚣粉中總黃酮得率在提取時(shí)間是0.5～1 h時(shí)十分平穩(wěn),而從1 h開(kāi)始明顯增高,可見(jiàn)提取時(shí)間越長(zhǎng),提取越充分。當(dāng)提取時(shí)間超過(guò)2 h后,黃酮得率趨于穩(wěn)定,可見(jiàn),當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到一定長(zhǎng)度黃酮溶出量便達(dá)到飽和,不再明顯溶出。因此,選定1.5、2、2.5 h作為正交實(shí)驗(yàn)中提取時(shí)間的三個(gè)水平[18-21]。

圖3 提取時(shí)間對(duì)發(fā)酵蜈蚣粉總黃酮得率的影響Fig.3 The effect of times of extraction on the yield of total flavonoids

2.3 正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選取影響發(fā)酵蜈蚣粉總黃酮提取因素中有意義的水平做正交實(shí)驗(yàn),對(duì)結(jié)果進(jìn)行極差分析,以確定最佳提取工藝條件。采用 L9(34)正交因子水平表(見(jiàn)表1),設(shè)計(jì)L9(34)正交實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化條件下發(fā)酵蜈蚣粉中總黃酮得率Table 2 The yield of total flavonoids under orthogonal experiment

表3 方差分析表Table 3 Variance analysis table

注:*表示有顯著性差異,p<0.05。

結(jié)合文獻(xiàn)[22]，由極差和方差分析結(jié)果可知,以總黃酮得率為評(píng)價(jià)指標(biāo),進(jìn)行直觀分析發(fā)現(xiàn),各因素對(duì)總黃酮提取得率的影響順序?yàn)锽>A>C,方差分析表明,因素B對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有顯著性影響。因此此次實(shí)驗(yàn)回流提取總黃酮的最佳條件為A2B3C3,即料液比為 1∶40 (g∶mL),提取溫度為80 ℃,提取時(shí)間為2.5 h。

2.4 最佳工藝條件的驗(yàn)證

根據(jù)所篩選的最佳工藝條件提取發(fā)酵蜈蚣粉3批,按照1.2.1下的方法測(cè)定總黃酮得率,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Verify the experimental results

RSD為1.9%,小于5%,說(shuō)明該工藝條件穩(wěn)定可行。

2.5 MTT法測(cè)定體外抗腫瘤活性

MTT法測(cè)定最佳工藝下發(fā)酵蜈蚣粉醇提液對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞的抑制作用結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 順鉑及不同濃度發(fā)酵蜈蚣醇提液對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞的抑制率Fig.4 The inhibition ratio of cis-platinum and different concentration of alcohol extraction of fermented centipede powder to lung adenocarcinoma cell A549

由圖4可看出在濃度為0.25 mg/mL后抑制率隨濃度的增大不斷增大,在不同濃度下發(fā)酵蜈蚣醇提液對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞的抑制率均大于順鉑,并且在濃度為2 mg/mL時(shí)抑制效果在實(shí)驗(yàn)條件下達(dá)到最佳。此現(xiàn)象表明蜈蚣醇提液對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞具有較優(yōu)抑制效果,初步認(rèn)為是醇提液總黃酮發(fā)揮的藥理藥效,具體原因及是否具有依賴(lài)性有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

3 結(jié)論與討論

研究表明,黃酮類(lèi)化合物具有抗炎、抑制癌細(xì)胞基因表達(dá)的作用[23]。近年來(lái),隨著抗腫瘤藥理作用研究的不斷深入,其在臨床抗腫瘤的應(yīng)用上也更加廣泛。對(duì)蟲(chóng)類(lèi)中藥的發(fā)酵處理能夠?qū)χ兴幉闹性械某煞诌M(jìn)行修飾和轉(zhuǎn)化,或者產(chǎn)生有效的次生代攝物質(zhì),從而改變?cè)幮阅?、產(chǎn)生新的藥理作用等。預(yù)實(shí)驗(yàn)研究表明,發(fā)酵可以使中藥蜈蚣黃酮極大地增加(相關(guān)研究未發(fā)表)。因此本實(shí)驗(yàn)選用發(fā)酵后蜈蚣粉,以總黃酮得率為指標(biāo)優(yōu)化其提取工藝并對(duì)其進(jìn)行抗腫瘤作用研究具有一定的創(chuàng)新性。

黃酮不溶于水,易溶于乙醇等有機(jī)溶劑,因此本實(shí)驗(yàn)主要選用醇溶液提取,而對(duì)于其他有機(jī)溶劑的提取效果還有待進(jìn)一步研究。用醇溶液進(jìn)行提取時(shí),脂溶性物質(zhì)如黃酮類(lèi)可被大量溶出,因此以黃酮類(lèi)化合物得率為指標(biāo)確定最佳提取工藝。中藥提取大多選用80%的乙醇濃度。醇提發(fā)酵蜈蚣的主要目的是盡可能全面地提取有代表性的脂溶性成分,超過(guò)80%的乙醇濃度就會(huì)有多肽和蛋白溶出。因?yàn)榻酉聛?lái)的實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)酵蜈蚣還要考察水溶性物質(zhì)的藥理活性,所以盡可能地將脂溶性的物質(zhì)提取出來(lái),同時(shí)又盡可能將水溶性的蛋白保留下來(lái),用80%的乙醇進(jìn)行提取,可以同時(shí)兼顧脂溶與水溶物質(zhì),其水溶性部分的相關(guān)研究有待于今后的進(jìn)一步推動(dòng)。

實(shí)驗(yàn)采用正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化發(fā)酵蜈蚣粉中總黃酮的提取工藝條件。不同量的溶劑會(huì)影響黃酮的溶出量,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明料液比是影響黃酮提取的關(guān)鍵性因素。用最佳提取工藝,料液比1∶40 (g∶mL),提取時(shí)間2.5 h,提取溫度80 ℃ 取得的發(fā)酵蜈蚣粉中的總黃酮得率為1.970%。通過(guò)體外抗腫瘤藥理實(shí)驗(yàn)證明:蜈蚣醇提液對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞的抑制率均大于順鉑,具有較優(yōu)良的抗腫瘤效果,蜈蚣醇提液體外對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制有無(wú)劑量依賴(lài)關(guān)系還有待研究。

本實(shí)驗(yàn)采用回流提取的方法,對(duì)超聲提取、索氏提取及浸漬法提取等其他提取方法的研究還有待進(jìn)行。近年來(lái),探究蜈蚣體內(nèi)的抗腫瘤活性成分一直是蜈蚣研究的熱點(diǎn),可能由于蜈蚣醇提液對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞有一定毒副作用,并未于臨床大量應(yīng)用。從目前文獻(xiàn)報(bào)道來(lái)看,蜈蚣的生藥學(xué)鑒別研究方面還存在不足,整體報(bào)道的僅有少棘巨蜈蚣的鑒別研究,對(duì)于其他幾種蜈蚣的研究則少之甚少,有待于今后在研究中加強(qiáng)。

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Optimization of total flavonoids extraction process in centipede fermentation by orthogonal test

WANG Yan-duo1,LIU Chun-yu1,LV Shi-jie1,WANG Ying1,WANG Li-na1,WANG Ji-hui2，*

(1.College of pharmacy,Shandong University of Traditional Chinese Medicine,Jinan 250355,China; 2.The experiment center of Shandong University of Traditional Chinese Medicine,Jinan,250355,China)

Objective:Orthogonal experiment is used to optimize the extraction process of total flavonoids from fermented centipede powder. Method:Regarding the yield of total flavonoids from fermented centipede as the research index. On the basic of single-factor test,the ultrasonic-assisted extraction process parameters of total flavonoids from fermented centipede including the ratio of extractive temperature(A),the ratio of material(B)and extractive time(C)were optimized by orthogonal test and the yield of total flavonoids was used as the responsive values. The antineoplastic activity of extraction to lung adenocarcinoma cell A549 were measured by using MTT assayinvitro.Result:The order of the effect of these factors on the yield of total flavonoids from fermented centipede powder was the ratio of material>extractive temperature>extractive time. In this experiment,the best extractive process was under 80 ℃ of the extractive temperature,1∶40 (g∶mL) of the ratio of material,2.5 h of the extraction time. Under these conditions,the yield of total flavonoids was 1.970%. The inhibition ratio of different concentration of alcohol extraction of fermented centipede powder to lung adenocarcinoma cell A549 was all greater than cis-platinum,and it had good antineoplasmic activity.

fermented centipede powder;orthogonal test;reflux extraction;total flavonoids;assay of MTT;lung adenocarcinoma A549 cell line

2016-11-11

王彥多(1997-)，女，本科，研究方向：中藥學(xué)， E-mail：m17864190855@163.com。

*通訊作者:王集會(huì)(1962-)，男，本科，副教授，研究方向：蟲(chóng)類(lèi)中藥發(fā)酵及活性成分研究，E-mail：wangjihui10@126.com。

山東中醫(yī)藥大學(xué)大學(xué)生研究訓(xùn)練(SRT)計(jì)劃資助項(xiàng)目(校編號(hào)：2016054，國(guó)家編號(hào)：201610441048)。

TS201.2

B

1002-0306(2017)07-0183-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.07.027