響應(yīng)面法優(yōu)化白薇抑菌物質(zhì)超聲提取工藝

彭 旋,萬(wàn)春鵬,陳玉環(huán),陳楚英,陳金印,*

(1.江西省果蔬采后處理關(guān)鍵技術(shù)與質(zhì)量安全協(xié)同創(chuàng)新中心,江西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,江西南昌 330045; 2.江西省果蔬保鮮與無(wú)損檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,江西南昌 330045)

響應(yīng)面法優(yōu)化白薇抑菌物質(zhì)超聲提取工藝

彭 旋1,2,萬(wàn)春鵬1,2,陳玉環(huán)1,2,陳楚英1,2,陳金印1,2,*

(1.江西省果蔬采后處理關(guān)鍵技術(shù)與質(zhì)量安全協(xié)同創(chuàng)新中心,江西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,江西南昌 330045; 2.江西省果蔬保鮮與無(wú)損檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,江西南昌 330045)

為研究白薇抑菌物質(zhì)的提取工藝條件,實(shí)驗(yàn)以白薇為原料,意大利青霉菌為供試菌,抑菌圈直徑為指標(biāo),采用超聲波輔助浸提白薇抑菌物質(zhì)。在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,研究響應(yīng)面分析法(Response Surface Methodology,RSM)優(yōu)化超聲波輔助提取白薇抑菌物質(zhì)的工藝參數(shù)。結(jié)果表明:白薇抑菌物質(zhì)的最佳提取工藝為乙醇濃度50%,浸提時(shí)間2 h,液料比31,浸提溫度69 ℃,在此條件下,白薇提取液對(duì)意大利青霉抑菌圈直徑達(dá)到40.58 mm,與理論最優(yōu)值40.81 mm接近。

白薇,響應(yīng)面法,超聲波提取,意大利青霉

白薇(CynanchumatratumBunge)為蘿藦科鵝絨藤屬植物直立白薇或蔓生白薇的干燥根莖,具有清熱涼血、利尿通淋、解毒療瘡的功效[1],常用于溫邪傷營(yíng)發(fā)熱、陰虛發(fā)熱等癥狀的治療。國(guó)內(nèi)外對(duì)白薇的研究目前主要集中在化學(xué)成分和藥理作用方面。對(duì)白薇化學(xué)成分的分析發(fā)現(xiàn),白薇含有C21甾體皂苷、白薇素、揮發(fā)油、強(qiáng)心苷等成分[2],其中主要為C21甾體皂苷[3-4]。對(duì)白薇藥理作用的研究發(fā)現(xiàn),C21甾體皂苷具有抗炎、鎮(zhèn)痛、退熱和抗腫瘤等藥理作用[5-7]。陳楚英等人[8]研究發(fā)現(xiàn)白薇對(duì)柑橘采后致病菌意大利青霉(Penicilliumitalicum)具有良好抑制效果,表明白薇含有意大利青霉的抑菌物質(zhì)。通過(guò)一定的提取方法和工藝可以獲得抑菌物質(zhì),傳統(tǒng)提取方法有水蒸氣蒸餾法[9]和有機(jī)溶劑提取法[10],但水蒸氣蒸餾法溫度較高,會(huì)導(dǎo)致抑菌物質(zhì)受熱分解,提取率較低,而有機(jī)溶劑提取法存在溶劑殘留問(wèn)題;超聲波具有強(qiáng)烈振動(dòng)、強(qiáng)化的空化效應(yīng)和攪拌作用,可以加快抑菌物質(zhì)的浸出,大大縮短提取時(shí)間,因而被廣泛用于藥用植物活性成分的提取[11]。

中藥有效成分的提取往往受多種因素及其交互作用的影響,傳統(tǒng)的正交設(shè)計(jì)得不到有關(guān)因子和響應(yīng)值的回歸方程,而均勻設(shè)計(jì)沒(méi)有考慮全部交互作用,結(jié)果不穩(wěn)定;響應(yīng)面分析法采用多元二次回歸方程擬合因子和響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系,能研究因子間的交互作用,且實(shí)驗(yàn)次數(shù)少、周期短、精度高,優(yōu)勢(shì)突出[12]。因此,本實(shí)驗(yàn)以抑菌圈直徑為響應(yīng)值,采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化白薇抑菌物質(zhì)超聲波提取工藝,選出最佳工藝參數(shù),為工業(yè)生產(chǎn)提供理論依據(jù)以及為后續(xù)白薇抑菌物質(zhì)分離鑒定奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白薇 江西省樟樹(shù)市華豐藥業(yè)有限公司,粉碎,過(guò)40目篩,藥粉常溫保存?zhèn)溆?意大利青霉菌 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理實(shí)驗(yàn)室提供;無(wú)水乙醇、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、石油醚、葡萄糖、瓊脂 均為市售分析純藥劑。

SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水真空泵 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司,ROTAVAPOR R-3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士BUCHI公司,AUY220電子天平 日本島津公司,KQ-500B超聲波清洗機(jī) 昆山超聲儀器有限公司,YXQ-LS-70A立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司,MIR-254恒溫培養(yǎng)箱 日本三洋,HS-1300U超凈工作臺(tái) 蘇靜集團(tuán)蘇州安泰公司,FW100高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 意大利青霉菌種活化及孢子懸浮液的制備 在無(wú)菌環(huán)境中挑取意大利青霉白色菌絲接種至PDA培養(yǎng)基上,放置28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)一周后(菌種活化),用無(wú)菌水將意大利青霉菌洗入三角瓶中,用普通玻璃珠將孢子打散,過(guò)濾,將濾液充分搖勻制成孢子懸浮液,血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),使菌懸液孢子濃度為108個(gè)/mL[13]。

1.2.2 白薇提取液抑菌效果的測(cè)定 采用杯碟法[14]測(cè)定白薇提取液的抑菌效果。無(wú)菌環(huán)境下,往未凝固的100 mL PDA培養(yǎng)基中加入1 mL意大利青霉菌懸液,搖勻倒入平板。待培養(yǎng)基凝固后,吸取200 μL濃度為1 g/mL的白薇提取液于牛津杯中,重復(fù)三次。將平板放置28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d,采用十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑,抑菌圈直徑越大,說(shuō)明抑菌效果越好,提取液中抑菌物質(zhì)越多。

1.2.3 提取溶劑的選擇 稱取5 g白薇藥粉置于6個(gè)三角瓶中,而后分別加入100 mL的蒸餾水、無(wú)水乙醇、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、石油醚溶液,用封口膜封住瓶口,常溫下超聲波(40 kHz)輔助浸提2 h。將浸提液抽濾、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮(45 ℃、-0.09 MPa)制成1 g/mL各提取溶劑的白薇提取液,測(cè)定其對(duì)意大利青霉的抑菌效果。

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.4.1 乙醇濃度對(duì)白薇提取液抑菌效果的影響 稱取5 g白薇藥粉置于5個(gè)三角瓶中,而后分別加入液料體積質(zhì)量比(液料比)為20的30%、40%、50%、60%和70%乙醇溶液,用封口膜封住瓶口,置于40 ℃溫度下超聲波輔助浸提1.5 h。將浸提液抽濾、濃縮制成1 g/mL的白薇提取液,測(cè)定其對(duì)意大利青霉的抑菌效果。

1.2.4.2 浸提時(shí)間對(duì)白薇提取液抑菌效果的影響 稱取5 g白薇藥粉置于5個(gè)三角瓶中,而后加入液料比為20的50%乙醇溶液,用封口膜封住瓶口,置于40 ℃溫度下,分別超聲波輔助浸提1、1.5、2、2.5和3 h。浸提結(jié)束后抽濾、濃縮制成1 g/mL的白薇提取液,測(cè)定其對(duì)意大利青霉的抑菌效果。

1.2.4.3 液料比對(duì)白薇提取液抑菌效果的影響 稱取5 g白薇藥粉置于5個(gè)三角瓶中,而后分別加入液料比為10、20、30、40和50的50%乙醇溶液,用封口膜封住瓶口,置于40 ℃溫度下超聲波輔助浸提2 h。將浸提液抽濾、濃縮制成1 g/mL的白薇提取液,測(cè)定其對(duì)意大利青霉的抑菌效果。

1.2.4.4 浸提溫度對(duì)白薇提取液抑菌效果的影響 稱取5 g白薇藥粉置于5個(gè)三角瓶中,而后加入液料比為30的50%乙醇溶液,用封口膜封住瓶口,分別置于40、50、60、70、80 ℃溫度下,超聲波輔助浸提2 h。浸提結(jié)束后抽濾、濃縮制成1 g/mL的白薇提取液,測(cè)定其對(duì)意大利青霉的抑菌效果。

1.2.5 響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝的設(shè)計(jì) 綜合乙醇濃度、浸提時(shí)間、液料比和浸提溫度這四個(gè)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,根據(jù)Design Expert軟件中Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)原理,采用響應(yīng)面法設(shè)計(jì)了4因素3水平的實(shí)驗(yàn)對(duì)白薇抑菌物質(zhì)的提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化,以意大利青霉為指示菌,抑菌圈直徑大小為響應(yīng)值,實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。實(shí)驗(yàn)因子和水平見(jiàn)表1。

表1 Box-Benhnken設(shè)計(jì)因素及水平Table 1 Factors and levels of Box-Benhnken experimental design

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel 2003制圖、SPSS 17.0對(duì)單因素實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行Duncan多重比較分析以及Design Expert 8.0.6.1對(duì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑的選擇

不同提取溶劑的白薇提取液抑菌效果如圖1所示,從圖1中可以看出,石油醚、氯仿和乙酸乙酯的白薇提取液無(wú)抑菌效果,丙酮、乙醇和蒸餾水的白薇提取液有較好的抑菌效果,且蒸餾水和無(wú)水乙醇的白薇提取液抑菌效果顯著(p<0.05)好于丙酮的白薇提取液。另外,丙酮具有一定的毒性、價(jià)格相對(duì)較高,又因可以制毒、制爆,受公安部門管制,而蒸餾水的濃縮效率低,從工業(yè)生產(chǎn)獲取難易程度、安全性、成本及提取效率考慮,實(shí)驗(yàn)選用無(wú)水乙醇、蒸餾水混合溶液作為提取溶劑。

圖1 不同溶劑白薇提取液抑菌效果Fig.1 Antibacterial activity of the cynanchum atratum extracts with different solvents

圖2 乙醇濃度(A)、浸提時(shí)間(B)、液料比(C)、浸提溫度(D)對(duì)白薇提取液抑菌效果的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration(A),extraction time(B),liquid-to-material ratio(C), extraction temperature(D)on antibacterial activity of the Cynanchum atratum extracts

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 乙醇濃度對(duì)白薇提取液抑菌效果的影響 由圖2A可知,隨著乙醇濃度的升高,白薇提取液的抑菌效果呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢(shì),在乙醇濃度為50%時(shí),抑菌圈直徑最大,抑菌效果最好,顯著(p<0.05)好于其它濃度。濃度超過(guò)50%,抑菌效果減弱,可能是因?yàn)橐恍┯H脂性強(qiáng)、醇溶性雜質(zhì)成分增大浸出,從而影響了抑菌物質(zhì)的提取率[15]。因此實(shí)驗(yàn)將50%的乙醇濃度作為最佳的提取濃度。

2.2.2 浸提時(shí)間對(duì)白薇提取液抑菌效果的影響 在1～2 h的浸提時(shí)間內(nèi),隨著浸提時(shí)間的增加,白薇提取液的抑菌圈直徑也隨之增大(見(jiàn)圖2B)。在浸提時(shí)間為2 h時(shí),抑菌效果顯著(p<0.05)好于其它浸提時(shí)間。當(dāng)浸提時(shí)間超過(guò)2 h,抑菌效果隨浸提時(shí)間的增加而減弱,這可能是后期抑菌物質(zhì)已充分浸出,而非抑菌成分繼續(xù)浸出,降低了抑菌物質(zhì)的提取率[16]。因此實(shí)驗(yàn)將浸提時(shí)間2 h作為最佳浸提時(shí)間。

2.2.3 液料比對(duì)白薇提取液抑菌效果的影響 不同液料比的白薇提取液對(duì)意大利青霉的抑菌效果見(jiàn)圖2C,液料比從10增加到30,白薇提取液的抑菌圈直徑逐漸增大,抑菌效果逐漸增強(qiáng),繼續(xù)增大液料比,抑菌效果迅速下降,這可能是當(dāng)擴(kuò)散平衡后,增加提取劑的量不會(huì)再增加抑菌物質(zhì)的浸出,而非抑菌物質(zhì)會(huì)增加浸出,這樣最后濃縮,會(huì)降低白薇提取液中抑菌物質(zhì)的提取率[17]。因此實(shí)驗(yàn)將液料比30最為最佳料液比。

2.2.4 浸提溫度對(duì)白薇提取液抑菌效果的影響 不同浸提溫度的白薇提取液對(duì)意大利青霉的抑菌效果如圖2D所示,在40～70 ℃范圍內(nèi),白薇提取液的抑菌圈直徑隨著浸提溫度的上升明顯增大,浸提溫度70 ℃時(shí),白薇提取液的抑菌效果最好,顯著(p<0.05)好于其它浸提溫度,溫度再升高,白薇提取液的抑菌圈直徑下降,這可能是由于抑菌物質(zhì)的結(jié)構(gòu)被破壞[18]。因此實(shí)驗(yàn)將浸提溫度70 ℃作為最佳浸提溫度。

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化白薇抑菌物質(zhì)的超聲波提取工藝

2.3.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果 按表1的設(shè)計(jì)方案,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果Table 2 Experimental design and results of the Box-Benhnken test

2.3.2 模型的建立及顯著性檢驗(yàn) 用Design Expert 8.0.6.1軟件對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合,得到抑菌圈直徑(Y)對(duì)乙醇濃度(A)、浸提時(shí)間(B)、液料比(C)和浸提溫度(D)的模型回歸方程:

Y=40.77-0.063A+0.33B+0.11C-0.21D+0.53AB+0.72AC+0.94AD-0.69BC+0.031BD-1.57CD-1.05A2-1.64B2-1.47C2-1.62D2(R2=0.9652)

從方程可以看出響應(yīng)值與實(shí)驗(yàn)因子之間不是簡(jiǎn)單線性關(guān)系,而是呈二次拋物線關(guān)系。方程中存在AB、AC、AD、BC、BD、CD項(xiàng),說(shuō)明各因子間存在交互作用,此外方程的決定系數(shù)R2=0.9652,表明96.52%的數(shù)據(jù)可用此方程解釋,說(shuō)明該模型與實(shí)際實(shí)驗(yàn)擬合良好。

表3 回歸模型方差分析Table 3 ANOVA for response surface quadratic model

2.3.3 響應(yīng)面分析與優(yōu)化 利用Design Expert 8.0.6.1軟件,根據(jù)回歸模型作響應(yīng)曲面及等高線,結(jié)果見(jiàn)圖3～圖8。若一個(gè)響應(yīng)曲面的坡度非常陡峭,表明形成該坡度曲面的兩個(gè)因子對(duì)響應(yīng)值有顯著影響,從另一個(gè)方面表明這兩個(gè)因子間存在較強(qiáng)的交互作用[20]。另外,等高線近似圓形,表明兩個(gè)因子對(duì)響應(yīng)值無(wú)顯著影響,且兩個(gè)因子間無(wú)顯著交互作用;而等高線呈橢圓形,表明兩個(gè)因子對(duì)響應(yīng)值具有顯著影響,且兩個(gè)因子間有顯著交互作用[21]。

從圖3～圖8的響應(yīng)面圖中可以看出,AD項(xiàng)、CD項(xiàng)所形成的曲面比較陡峭,表明AD項(xiàng)、CD項(xiàng)對(duì)抑菌圈直徑有顯著影響。

圖3 乙醇濃度與浸提時(shí)間對(duì)抑菌效果影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.3 Response surface plot and contour plot for the effects of ethanol concentration and extraction time on antibacterial activity of the cynanchum atratum extracts

圖4 乙醇濃度與液料比對(duì)抑菌效果影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.4 Response surface plot and contour plot for the effects of ethanol concentration and liquid-to-material ratio on antibacterial activity of the Cynanchum atratum extracts

圖5 乙醇濃度與浸提溫度對(duì)抑菌效果影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.5 Response surface plot and contour plot for the effects of ethanol concentration and extraction temperature on antibacterial activity of the Cynanchum atratum extracts

圖6 浸提時(shí)間與液料比對(duì)抑菌效果影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.6 Response surface plot and contour plot for the effects of extraction time and liquid-to-material ratio on antibacterial activity of the Cynanchum atratum extracts

圖7 浸提時(shí)間與浸提溫度對(duì)抑菌效果影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.7 Response surface plot and contour plot for the effects of extraction time and extraction temperature on antibacterial activity of the Cynanchum atratum extracts

圖8 液料比與浸提溫度對(duì)抑菌效果影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.8 Response surface plot and contour plot for the effects of liquid-to-material ratio and extraction temperature on antibacterial activity of the Cynanchum atratum extracts

從圖3～圖8的等高線圖中可以看出,除了BD項(xiàng)的等高線近似圓形,其它交互項(xiàng)的等高線均為橢圓形,表明除了BD項(xiàng)對(duì)抑菌圈直徑無(wú)顯著影響,其它交互項(xiàng)對(duì)抑菌圈直徑均有顯著影響,這和模型方差分析的結(jié)果一致。

由響應(yīng)面的分析可知,回歸模型存在最大值。通過(guò)軟件分析計(jì)算得出理論最佳提取工藝:乙醇濃度49.66%,浸提時(shí)間2.04 h,液料比30.68,浸提溫度68.92 ℃,理論抑菌圈直徑為40.81 mm。

2.3.4 最優(yōu)條件的驗(yàn)證 為檢驗(yàn)響應(yīng)面法的可行性,采用最佳提取工藝進(jìn)行驗(yàn)證,同時(shí)考慮實(shí)際操作方便,實(shí)驗(yàn)以乙醇濃度50%,浸提時(shí)間2 h,液料比31,浸提溫度69 ℃進(jìn)行驗(yàn)證,3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)抑菌圈直徑平均值為40.58 mm,落于模型理論值的95%置信區(qū)間(40.4398～41.1702 mm)內(nèi)。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用響應(yīng)面法對(duì)超聲波輔助提取白薇抑菌物質(zhì)的工藝進(jìn)行優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):AC項(xiàng)、AD項(xiàng)、BC項(xiàng)、CD項(xiàng)、A2項(xiàng)、B2項(xiàng)、C2項(xiàng)、D2項(xiàng)對(duì)抑菌圈直徑有極顯著(p<0.01)的影響,AB項(xiàng)對(duì)抑菌圈直徑有顯著(p<0.05)的影響。此外,得到方便實(shí)際操作的最佳提取工藝:乙醇濃度50%,浸提時(shí)間2 h,液料比31,浸提溫度69 ℃,抑菌圈直徑為40.58 mm。在此條件下的抑菌圈直徑落于模型理論值的95%置信區(qū)間內(nèi)。

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Optimization of ultrasound extraction of antibacterial material fromCynanchumatratumBunge with response surface methodology

PENG Xuan1,2,WAN Chun-peng1,2,CHEN Yu-huan1,2,CHEN Chu-ying1,2,CHEN Jin-yin1,2,*

(1.Collaborative Innovation Center of Post-harvest Key Technology and Quality Safety of Fruits and Vegetables in Jiangxi Province,College of agronomy,Jiangxi Agricultural University,Nanchang 330045,China; 2.Jiangxi Key Laboratory for Postharvest Technology and Nondestructive Testing of Fruits & Vegetables, College of agronomy,Jiangxi Agricultural University,Nanchang 330045,China)

In order to study the conditions of extracting antibacterial material fromCynanchumatratum,C.atratumwas used as material,the diameter of inhibition zone andPenicilliumitalicumworked as an indicator and bacterial strain in this experiment respectively,beside these ultrasound-assisted extraction was used to antibacterial material fromC.atratum. On the basis of single factor tests,the method of response surface methodology was used to optimize ultrasound-assisted extraction of antibacterial material formC.atratum. The result indicated that the optimal conditions to extract antibacterial material fromC.atratumwere that ethanol concentration was 50%,extraction time was 2 h,liquid-to-material ratio was 31 and extraction temperature was 69 ℃. Under these conditions,the inhibitory effect againstP.italicumbyC.atratumextracts was 40.58 mm,close to the theoretically predicted value of 40.81 mm.

Cynanchumatratum;response surface methodology;ultrasound extraction;Penicilliumitalicum

2016-09-14

彭旋(1991-)，男，碩士研究生，研究方向：果蔬植物源保鮮劑開(kāi)發(fā)與利用，E-mail：pengx1104@163.com。

*通訊作者:陳金印(1962-)，男，博士，教授，研究方向：果蔬采后生理及貯藏技術(shù)，E-mail：jinyinchen@126.com。

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目 (2012BAD38B03-2)；江西省教育廳科技落地計(jì)劃項(xiàng)目(111)；江西省“贛鄱英才555工程”(2012)。

TS201.2

B

1002-0306(2017)07-0176-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.07.026