長期施用生物炭對土婁土土壤理化性質及微生物的影響

劉 露，王梓廷，劉 楊，韓 娟，廖允成，溫曉霞

(西北農(nóng)林科技大學 農(nóng)學院，陜西楊凌 712100)

長期施用生物炭對土婁土土壤理化性質及微生物的影響

劉 露，王梓廷，劉 楊，韓 娟，廖允成，溫曉霞

(西北農(nóng)林科技大學 農(nóng)學院，陜西楊凌 712100)

為了研究生物炭對土壤改良的影響是否具有長期效應，對施用不同量生物炭0 kg/hm2(CK),1 000 kg/hm2(T1),5 000 kg/hm2(T2),10 000 kg/hm2(T3) 4 a之后的土婁土進行氮素和碳素質量分數(shù)測定和土壤氨氧化菌、反硝化細菌的定量分析。結果表明：與未添加生物炭的土壤(CK)相比，在冬前分蘗期和拔節(jié)期T2和T3處理下的氨氧化菌豐度顯著高于CK;在冬前分蘗期、拔節(jié)期和成熟期生物炭處理下的反硝化細菌豐度顯著高于CK。土壤銨態(tài)氮質量分數(shù)在分蘗前期、拔節(jié)期和成熟期的T3處理下顯著高于CK；土壤硝態(tài)氮質量分數(shù)在拔節(jié)期和成熟期的T2和T3處理下分別顯著高于CK；土壤堿解氮質量分數(shù)在越冬期和拔節(jié)期分別是CK和T3達到最高水平，且顯著高于其他處理；土壤全氮質量分數(shù)在分蘗前期和開花期的T3和T1處理下達到最高水平，均顯著高于CK；土壤有機碳質量分數(shù)在拔節(jié)期、開花期和成熟期的T3處理下達到最高水平，且顯著高于CK，但CK和T1、T2之間無顯著差異?？梢?，施用生物炭1 000 kg/hm2(T1)和5 000 kg/hm2(T2)4 a之后，與CK相比土壤氮素和碳素的提高不明顯；生物炭處理與CK相比，添加生物炭提高土壤中反硝化細菌豐度；施用生物炭10 000 kg/hm2(T3)顯著提高土壤中氨氧化菌豐度。

生物炭；氮素；碳素；氨氧化菌；反硝化細菌

陜西關中平原是中國冬小麥的主要產(chǎn)區(qū)，其產(chǎn)量高低對陜西省的糧食安全影響顯著。為了保持高產(chǎn)，該地區(qū)在小麥生產(chǎn)中普遍使用高肥高水的措施，雖然在一定程度上顯著提高小麥產(chǎn)量，但大量的化肥施用會顯著降低氮肥利用效率，同時不合理的施肥會造成小麥群體質量惡化、倒伏嚴重、產(chǎn)量及品質下降等不良影響，更會造成嚴重的生態(tài)危害[1-2]。生物炭是生物質材料在高溫無氧的環(huán)境中經(jīng)過熱解形成富含有機碳[3]的一種穩(wěn)定的土壤改良劑[4]，生物炭的表面有很多小孔，這樣的結構決定生物炭對土壤銨離子較強的吸附作用[5]；并且能顯著提高土壤全氮及有機碳質量分數(shù)進而提高土壤肥力[6]。還有研究發(fā)現(xiàn)，生物炭可以增加土壤通氣性，通過提高土壤中氧的質量分數(shù)，從而降低土壤中的硝化反應，同時促進土壤氮質量分數(shù)的提高[7]。但目前關于生物炭的研究多集中于添加生物炭對土壤水分、養(yǎng)分質量分數(shù)及作物生長發(fā)育的影響[8-10]，而關于生物炭施用對土壤微生物活性的影響研究報道較少。本試驗以關中冬小麥麥田土壤為對象，研究施入生物炭4 a之后，對土壤氮素和碳素及微生物的影響，為生物炭在關中地區(qū)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的長期應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗設在陜西省咸陽市楊凌區(qū)西北農(nóng)林科技大學標本園試驗地(108°24′E，34°20′N，海拔521 m)，該區(qū)屬于渭北旱塬，暖溫帶季風氣候，年均降雨量500～700 mm，年均日照時數(shù)2 196 h，無霜期210 d。試驗區(qū)土壤屬土婁土，其中粘粒、粉粒和沙礫質量分數(shù)分別為6.5%、61.1%、2.4%，耕層( 0～20 cm) 土壤有機質14.11 g/kg,速效磷7.73 mg/kg,速效鉀152.03 mg/kg,pH 7.61(水土質量比為1∶1)。采用的生物炭來自河南三利新能源公司，其基本理化性質為有機碳467.05 g/kg,全磷0.61 g/kg,全氮5.90 g/kg,鉀26.03 g/kg,C/N為79.10，灰分質量分數(shù)20.8%，pH 10.40。

本研究是長期定位試驗，2011年將生物炭一次施入土壤中，之后不再補施。設4個處理，施用水平分別為：0 kg/hm2(對照CK)、1 000 kg/hm2(T1)、5 000 kg/hm2(T2)、10 000 kg/hm2(T3)。采用隨機區(qū)組設計，每處理3次重復，小區(qū)面積5 m×4 m=20 m2，小麥品種采用‘陜麥139’，于2015-10-05播種，于2016-06-04收獲。

1.2 測定項目與方法

分別在冬小麥分蘗前期、越冬期、拔節(jié)期、開花期和成熟期，取0～20 cm的耕層土壤，先過2 mm篩除去土壤中的雜質，分裝成2份，一份土樣迅速帶回實驗室置于-40 ℃保存，用于土壤硝銨態(tài)氮的測定與土壤微生物DNA的提取；另一份土樣風干過篩后用于測定土壤中全氮、堿解氮及有機質質量分數(shù)測定。

1.2.1 土壤理化指標測定 采用流動注射分析儀進行測定土壤硝銨態(tài)氮，土壤全氮質量分數(shù)采用凱氏定氮儀測定，土壤堿解氮質量分數(shù)測定采用堿解擴散法，采用重鉻酸鉀外加熱法進行土壤有機碳的測定。

1.2.2 氨氧化細菌和反硝化細菌的實時熒光定量 稱取新鮮土壤0.5 g，采用MP試劑盒提取土壤微生物DNA。氨氧化菌的引物為amoA-1F和amoA-2R，實時熒光定量PCR擴增反應體系為：10 μL的SYBR，上下游引物(20 pmol/μL)各0.4 μL、0.5 μL的土壤微生物DNA模板，7.9 μL的滅菌雙蒸水和0.8 μL的BSA，反應體系總體積為20 μL；反硝化細菌的引物為cd3F和R3cd，實時熒光定量PCR擴增反應體系為：10 μL的SYBR，上下游引物(20 pmol/μL)各0.5 μL，1 μL的土壤微生物DNA模板和8 μL的滅菌雙蒸水。定量PCR反應在CFX96TMReal-Time System(Bio-Rad公司)擴增儀上進行。通過定量PCR擴增得到的基因拷貝數(shù)用于后續(xù)計算。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Microsoft Excel 2007和SigmaPlot 12.5分別進行數(shù)據(jù)整理和作圖，采用SPSS 16.0對數(shù)據(jù)進行方差分析及相關性分析。

2 結果與分析

2.1 生物炭對土壤氨氧化細菌和反硝化細菌的影響

如圖1所示，氨氧化細菌在冬前分蘗期，在T2處理下的拷貝數(shù)對數(shù)達到最大4.75，T1處理下氨氧化菌質量分數(shù)最低，且4個處理之間差異顯著；在越冬期CK顯著高于生物炭處理；在拔節(jié)期T2和T3處理下的氨氧化細菌數(shù)量分別顯著高于CK和T1 9.94%、8.85%和10.57%、9.48%；在開花期T3處理下的氨氧化細菌數(shù)量顯著高于T1、T2和CK；在成熟期氨氧化菌在4個處理下無明顯差異。

圖1 不同生物炭施用量下土壤的氨氧化菌拷貝數(shù)的常用對數(shù)Fig.1 Common logarithm of soil amoA gene copy number under different biochar amount

如圖2 所示，反硝化細菌數(shù)量在小麥整個生育期中呈現(xiàn)出逐漸上升的趨勢；在分蘗前期，反硝化細菌數(shù)量在T1和T3處理下顯著高于CK；在拔節(jié)期，T2處理下的反硝化細菌數(shù)量最高，CK最低，T1和T2顯著高于CK；在成熟期，反硝化細菌在T2處理下數(shù)量最高，CK最低，生物炭處理下反硝化細菌數(shù)量顯著高于CK；而在越冬期和開花期，4種處理下反硝化菌數(shù)量之間無顯著差異。

2.2 生物炭對土壤硝態(tài)氮和銨態(tài)氮質量分數(shù)的影響

由圖3可知，分蘗前期4個處理下土壤中的硝態(tài)氮質量分數(shù)表現(xiàn)為T3最高，且顯著高于CK、T1和T2各處理45.6%、26.2%和47.9%。在拔節(jié)期，T3和T2處理下的硝態(tài)氮質量分數(shù)顯著高于CK和T1的48.75%、53.72%和31.39%、35.78%；CK和T1處理下的硝態(tài)氮質量分數(shù)最低，之間無顯著差異。在成熟期，生物炭處理下的硝態(tài)氮質量分數(shù)均顯著高于CK，T1、T2和T3分別顯著高于CK 69.54%、40.07%和142.05%。在越冬期和開花期，各處理下的硝態(tài)氮質量分數(shù)無顯著差異。

圖2 不同生物炭施用量下反硝化細菌拷貝數(shù)的常用對數(shù)Fig.2 Common logarithm of soil nirS gene copy number under different biochar amount

圖3 不同生物炭施用量下土壤硝態(tài)氮的質量分數(shù)Fig.3 Soil nitrate nitrogen mass fraction under different biochar amount

在小麥整個生育期，各處理下的土壤銨態(tài)氮質量分數(shù)呈現(xiàn)出逐漸降低的趨勢。在分蘗前期和越冬期，各處理下的銨態(tài)氮質量分數(shù)表現(xiàn)為T1和T3均顯著高于CK和T2。在拔節(jié)期，各處理下的銨態(tài)氮質量分數(shù)表現(xiàn)出T2和T3顯著高出CK和T1的37.16%、24.88%和69.67%、54.57%。在開花期，各處理下的土壤銨態(tài)氮質量分數(shù)表現(xiàn)為T2和T3處理分別顯著高于CK和T1。在成熟期，各處理下的土壤銨態(tài)氮質量分數(shù)之間無顯著差異(圖4)。

2.3 生物炭對土壤堿解氮質量分數(shù)的影響

由圖5可知，在小麥各個生育時期，土壤堿解氮質量分數(shù)整體表現(xiàn)為先降低后增加的趨勢。在分蘗前期，T1顯著高于T3，而CK和T2與各處理之間的差異并不顯著。在越冬期，土壤堿解氮質量分數(shù)表現(xiàn)為CK質量分數(shù)最高，且顯著高出T1、T2和T3的21.34%、40.21%和21.64%。在拔節(jié)期，土壤堿解氮質量分數(shù)表現(xiàn)為T3處理顯著高于CK、T1和T2，而CK、T1和T2處理的堿解氮質量分數(shù)之間無顯著差異。在開花期，T1顯著高出CK的13.16%，而T2和T3與其他處理之間無顯著差異。在成熟期，土壤堿解氮質量分數(shù)表現(xiàn)為CK、T2和T3均顯著高于T1。

圖4 不同生物炭施用量下土壤銨態(tài)氮的質量分數(shù)Fig.4 Soil ammonium nitrogen mass fraction under different biochar amount

圖5 不同生物炭施用量下土壤堿解氮的質量分數(shù)Fig.5 Soil available nitrogen mass fraction under different biochar amount

2.4 生物炭對土壤全氮質量分數(shù)的影響

土壤全氮質量分數(shù)在小麥整個生育期表現(xiàn)出和堿解氮相似的變化趨勢均先降低后增加。由圖6可知，在分蘗前期，T3處理顯著高出T1 33.21%，而CK和T2與其他各處理之間無顯著差異。在拔節(jié)期，各處理下的土壤全氮質量分數(shù)表現(xiàn)為T2和T3顯著高于CK和T1，且分別高出CK和T1 42.31%、55.58%和18.03%、29.04%。在開花期，各處理下的土壤全氮質量分數(shù)表現(xiàn)為T1顯著高于CK、T2和T3。在越冬期和成熟期，各處理下的土壤全氮質量分數(shù)間無顯著差異。

2.5 生物炭對土壤有機碳質量分數(shù)的影響

由圖7可知，土壤有機碳質量分數(shù)除T3外均表現(xiàn)出先降低后升高的狀態(tài)。在分蘗前期，CK與T2處理均顯著高于T1和T3。在越冬期，各處理下的土壤有機碳質量分數(shù)間無顯著差異。在拔節(jié)期T3處理下的土壤有機碳質量分數(shù)最高，顯著高出CK、T1和T2 38.03%、60.71%和50.83%。在開花期和成熟期，T3處理下的土壤有機碳質量分數(shù)顯著高于CK、T1和T2。

圖6 不同生物炭施用量下土壤全氮的質量分數(shù)Fig.6 Soil total nitrogen mass fraction under different biochar amount

2.6 相關分析

表1表明，未添加生物炭處理下的氨氧化菌與土壤中的氮素及有機碳間無顯著相關性，而反硝化細菌與銨態(tài)氮和有機碳質量分數(shù)均呈極顯著負相關。而在添加生物炭的土壤中，有機碳質量分數(shù)對氨氧化細菌呈顯著正相關，而反硝化細菌則與土壤中的全氮、銨態(tài)氮質量分數(shù)呈極顯著負相關，與有機碳的質量分數(shù)呈顯著負相關；與硝態(tài)氮、堿解氮質量分數(shù)顯著無相關性。

圖7 不同生物炭施用量下土壤有機碳的質量分數(shù)Fig.7 Soil organic carbonmass fraction under different biochar amount

表1 氨氧化細菌和反硝化細菌拷貝數(shù)的常用對數(shù)與土壤氮素之間的皮爾遜相關性分析
Table 1 Pearson correlation analysis between common logarithm of amoA and nirS gene copy number and soil physical and chemical properties

項目Item全氮Totalnitrogen硝態(tài)氮Nitratenitrogen銨態(tài)氮Ammoniumnitrogen堿解氮Availablenitrogen有機碳Organiccarbon未添加生物炭 Withoutbiochar 氨氧化菌 amoAgene0．4030．377-0．1440．4330．266 反硝化細菌 nirSgene-0．0280．121-0．836??-0．47-0．791??添加生物炭 Withbiochar 氨氧化菌 amoAgene0．1350．058-0．1750．0770．393? 反硝化細菌 nirSgene-0．33??-0．204-0．626??0．074-0．377?

注：“*”和“**”分別表示在0.05和0.01水平的相關性。

Note:“*” and “**” mean correlation at 0.05 and 0.01 level,respectively.

3 討 論

3.1 生物炭對土壤氮素和有機碳質量分數(shù)的影響

生物炭處理 4 a之后與對照相比并沒有顯著提高堿解氮和全氮質量分數(shù)，這與Jones等[11-12]的研究結果相一致；生物炭施用量為1 t/hm2、5 t/hm2對第4年的麥田土壤硝銨態(tài)氮質量分數(shù)提高的影響并不顯著，只有施用量達到10 t/hm2時才能顯著提高小麥土壤中的硝銨態(tài)氮質量分數(shù)，而何飛飛等[13]的研究表明添加少量的生物炭就可以提高酸性土壤中硝態(tài)氮的質量分數(shù)，這可能是因為生物炭對土壤中硝態(tài)氮質量分數(shù)的影響因土壤質地不同而不同[14]。前人的研究發(fā)現(xiàn)，在添加生物炭的前2 a，顯著提高土壤中的堿解氮質量分數(shù)[15-16]；在第4年與CK相比并未對土壤堿解氮質量分數(shù)的促進作用，這可能是因為施用生物炭后對土壤養(yǎng)分的影響僅僅停留在最初的1～2 a，隨著時間的推移，生物炭對土壤養(yǎng)分的促進作用不斷下降，Quilliam等[17]的發(fā)現(xiàn)也證實了這一想法。根據(jù)前人研究發(fā)現(xiàn)，在添加生物炭的前2 a，顯著提高土壤中有機碳的質量分數(shù)[15,18]，而本研究中發(fā)現(xiàn)，在添加生物炭的第4年，只有T3顯著提高土壤中的有機碳質量分數(shù)，CK與T1和T2的有機碳質量分數(shù)之間無顯著差異，通過研究結果推論這可能與施用生物炭量的多少有關，施用生物炭量越大，則發(fā)揮生物炭土壤改良作用的時間就越長。根據(jù)本試驗結果表明，生物炭的施用量在很大程度上影響著生物炭對土壤養(yǎng)分質量分數(shù)促進作用的時間，但具體影響還需進一步研究。

3.2 生物炭對土壤氨氧化菌和反硝化細菌的影響

土壤中的氮只有轉化為硝態(tài)氮才能夠被作物吸收利用[19]，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的氮肥主要以銨態(tài)氮的形式輸入，而氨氧化菌將銨態(tài)氮先轉化成亞硝態(tài)氮，亞硝態(tài)氮又經(jīng)過亞硝化微生物的作用轉化成硝態(tài)氮，從而完成整個硝化過程。因此，氨氧化過程是硝化過程的第一步，而在土壤硝化過程中氨氧化微生物擔任驅動者的角色[20]。在添加生物炭4 a之后，T1和T2處理并未能顯著提高土壤中氨氧化菌的豐度，而T3處理顯著提高土壤中氨氧化菌的豐度，這與有關研究[21-23]的結果相一致，但CK處理下氨氧化菌與土壤氮素和有機碳均無顯著相關性，這與邢肖毅等[24]的研究結果不一致，這很可能是因為大田生態(tài)系統(tǒng)中人為管理的情況下土壤中氮素質量分數(shù)會顯著高于未施肥的土壤，而氨氧化菌微生物以氮素作為底物生長很可能在高肥力土壤上對氮素的響應不再敏感。

土壤硝態(tài)氮通過反硝化細菌轉化成氮氣。本研究中發(fā)現(xiàn)添加生物炭4 a之后顯著提高土壤中nirS型反硝化細菌的群落豐度，而顧美英等[25]發(fā)現(xiàn)在灰漠土和風沙土上施加生物炭能降低土壤中反硝化細菌的群落豐度，這很可能是因為土壤質地不同而導致。本研究發(fā)現(xiàn)，在未添加生物炭的處理下，土壤中nirS型反硝化細菌的群落豐度與土壤銨態(tài)氮和有機碳呈極顯著負相關，有機碳作為提供反硝化細菌的碳源直接影響土壤中反硝化細菌的群落豐度[26]；而在添加生物炭的處理下反硝化細菌群落豐度與土壤有機碳呈顯著負相關，與土壤中的全氮和銨態(tài)氮質量分數(shù)呈極顯著負相關，這很可能是因為生物炭的添加提高了土壤中的有機碳質量分數(shù)[27]，而本研究中生物炭的施用已有4 a，第4年中僅有T3處理下的土壤有機碳質量分數(shù)顯著提高于CK，張娜[15]和曾愛等[16]的研究發(fā)現(xiàn)在前2 a生物炭處理均能顯著提高土壤中有機碳的質量分數(shù)，因此反硝化細菌很可能在前3 a中開始適應高有機碳濃度的環(huán)境，所以與有機碳的相關性由CK的極顯著負相關轉變?yōu)轱@著負相關；另一方面添加生物炭會降低土壤體積質量[28]，從而增加土壤的通氣性，而反硝化細菌是厭氧菌，在此基礎上對原本有敏感響應的有機碳不再敏感，而對影響其反硝化過程氮素的響應敏感，具體原因還有待進一步對生物炭和氮肥的互作進行研究。

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(責任編輯：成 敏 Responsible editor:CHENG Min)

Long-term Effect of Application of Biochar on Physiochemical Properties and Microorganism of Loessial Soil

LIU Lu,WANG Ziting,LIU Yang,HAN Juan,LIAO Yuncheng and WEN Xiaoxia

(College of Agronomy,Northwest A&F University,Yangling Shaanxi 712100,China)

In order to explore long-term effect of biochar on soil improvement,the field experiment was conducted with four biochar levels,including 0 kg/hm2(CK),1 000 kg/hm2(T1),5 000 kg/hm2(T2),and 10 000 kg/hm2(T3) four years ago,nitrogen and carbon mass fraction of soil was measured,and the abundance of soil microorganism was analyzed with Real-time PCR of amoA and nirS gene . The results showed that the amoA gene abundance in T2 and T3 were significantly higher than CK in early tilleringand jointing stage,and the nirS gene abundance of biochar treatments were significantly higher than CK inearly tillering,jointing stage and maturity. The soil nitrate nitrogen mass fraction in T2 and T3 were significantly higher than CK in jointing stage and maturity,meanwhile the soil ammonium nitrogen mass fraction in T3 was significantly higher than CK inearly tillering,jointing and maturity. The soil available nitrogen mass fraction in CK and T3 was respectively the maxium mass fraction inearly tillering and jointing stage,while the soil total nitrogen mass fraction in T3 and T1 was the maxiummass fraction in early tillering and flowering stage respectively and both were significantly higher than CK. The soil organic carbonmass fraction in T3 was the highest level in jointing,flowering stage and maturity,while there was no significance difference between CK,T1 and T2 in soil organic matter mass fraction.We found that after application of 1 000 kg/hm2and 5 000 kg/hm2biochar four years,the improvenment of soil nitrogen and carbon was no longer remarkable. Application of biochar had a long-term improvement on amoA gene abundance after four years. Adding 10 000 kg/hm2(T3) biochar to soil after years improved the nirS gene abundance significantly.

Biochar;Nitrogen; Carbon; amoA gene; nirS gene

LIU Lu,female，master student.Research area:efficient farming system.E-mail:15129399391@163.com

WEN Xiaoxia,female,Ph.D,professor.Research area:agro-ecology and efficient farming system. E-mail:wenxiaoxia6811@163.com

日期：2017-03-30

2016-09-01

2016-11-01

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201503121-09)；陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計劃(2015KTZDNY01-02)；陜西省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新與攻關項目(2016NY-001)。

劉 露，女，碩士研究生，研究方向為高效農(nóng)作制度。E-mail:15129399391@163.com

溫曉霞，女，博士，教授，研究方向為農(nóng)業(yè)生態(tài)和高效農(nóng)作制度。E-mail:wenxiaoxia6811@163.com

S365

A

1004-1389(2017)04-0596-07

網(wǎng)絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20170330.1509.030.html

Received 2016-09-01 Returned 2016-11-01

Foundation item Special Fund for Agro-scientific Research in the Public Interest(No. 201503121-09);Shaanxi Science and Technology Innovation Project Plan(No. 2015KTZDNY01-02);Agricultural Science and Technology Innovation and Key Project of Shaanxi Province(No. 2016NY-001).