水稻白葉枯病和細條病稻兼抗資源篩選及兼抗基因分析

秦鋼，閻勇*，馬增鳳，陳遠孟，秦媛媛，岑貞陸，羅同平，劉馳，張月雄，黃大輝＊＊

(1.廣西農(nóng)業(yè)科學院水稻研究所/廣西水稻遺傳育種重點實驗室/國家水稻改良中心南寧分中心，廣西南寧530007;2.廣西農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)科技信息研究所，廣西南寧530007;3.廣西農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，廣西南寧530007)

水稻白葉枯病和細條病稻兼抗資源篩選及兼抗基因分析

秦鋼1，閻勇1*，馬增鳳1，陳遠孟1，秦媛媛2，岑貞陸3，羅同平1，劉馳1，張月雄1，黃大輝1＊＊

(1.廣西農(nóng)業(yè)科學院水稻研究所/廣西水稻遺傳育種重點實驗室/國家水稻改良中心南寧分中心，廣西南寧530007;2.廣西農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)科技信息研究所，廣西南寧530007;3.廣西農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，廣西南寧530007)

為獲得抗白葉枯病兼抗細條病抗源，對285份水稻材料進行人工接種鑒定和分子標記分析。結果表明，獲得對強毒型白葉枯?、跣捅憩F(xiàn)為抗的材料9份，中抗的7份;對于細條病菌JZ-8菌株，高抗的2份，抗的31份，中抗的為50份;對于細條病菌LZ-4菌株，高抗的16份，抗的68份，中抗的100份;對白葉枯病菌和至少1個以上細條病菌株抗性達到中抗以上水平的兼抗材料有9份。兼抗材料具有優(yōu)良的農(nóng)藝性狀，其中2份材料含有兼抗基因xa5，其他7份不含該基因，屬于另一類型的兼抗性。白葉枯病抗性與細條病抗性無顯著相關，細條病不同菌株抗性間存在極顯著相關。

水稻;白葉枯病;細條病;資源篩選;基因

水稻白葉枯病和細菌性條斑病(簡稱細條病)分別由革蘭氏陰性菌黃單孢菌Xanthomona soryzae pv.Oryza(Xoo)和Xanthomonas oryzae pv.oryzicola(Xoc)引起，是世界性重要的細菌性病害，對水稻生產(chǎn)造成嚴重危害［1］。白葉枯病在流行年份爆發(fā)，可造成高達50%，甚至80%的產(chǎn)量損失［2－3］。細條病對水稻生產(chǎn)也危害甚重，可造成高達40%的減產(chǎn)［4］。施用化學農(nóng)藥是防治該兩種病害的重要手段，但是過量使用農(nóng)藥會增加水稻生產(chǎn)的成本，同時會導致環(huán)境的污染。利用優(yōu)良抗源培育抗性品種是防治白葉枯病和細條病最為經(jīng)濟有效和環(huán)境友好的辦法之一。而鑒定發(fā)掘優(yōu)異抗性資源和基因是影響抗性品種培育的關鍵因素。目前在稻種資源中已經(jīng)發(fā)掘鑒定出41個抗白葉枯病基因［5］。稻種資源富含細條病抗源，已定位發(fā)現(xiàn)多個控制抗性的數(shù)量性狀基因位點(QTLs)控制［6－7］，而在普通野生稻中發(fā)現(xiàn)了一個抗細條病主效基因BLS1［8］。白葉枯病和細條病由形態(tài)特征、生物學特性及病害流行因素等各方面都很相似的水稻黃單胞菌的2個致病變種引起，因此在育種實踐中，從豐富的抗源中篩選鑒定出抗紋枯病兼抗細條病的材料和基因資源引起科學家們重視和關注。郭亞輝等［9］對細條病菌致病力分化進行研究，提出在育種工作中優(yōu)先選用既抗白葉枯病又抗條斑病雙抗源材料的建議。但是雙抗源材料數(shù)量稀少，xa5是目前發(fā)現(xiàn)的鮮見抗白葉枯病兼抗細條病基因，因此加強兼抗材料的鑒定發(fā)掘，對于豐富白葉枯病和細條病抗性育種材料遺傳基礎有重要意義。

本研究對多份稻種資源進行白葉枯病和細條病抗性鑒定，企圖從中發(fā)掘出優(yōu)異兼抗材料，對兼抗材料進行分子檢測，為深入研究兼抗材料提供參考，此外考察兼抗中間材料農(nóng)藝性狀，對其育種利用價值進行評價。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用的285份材料由廣西水稻遺傳育種重點實驗室自行收集提供。

1.2 白葉枯病抗性鑒定

選用華南秈稻區(qū)強毒菌株(Ⅴ型)，采用人工剪葉法分蘗盛期接種，接種菌液濃度約為1×109個/ mL，每株接種5張葉片，接種21 d后根據(jù)Gu等［10］的調(diào)查標準調(diào)查病斑長度和抗性級別，抗(R):病斑長度≤3.0 cm;中抗(MR):3.0 cm﹤病斑長度≤6.0 cm;中感(MS):6.0 cm﹤病斑長度≤9.0 cm;S:病斑長度﹥9.0 cm。

1.3 細條病抗性鑒定

接種菌株為JZ-8和LZ-4，分別是Ⅱ和Ⅲ致病型，是廣西優(yōu)勢致病型。按照岑貞陸等［11］的針刺法在水稻分蘗期接種，接種20 d后進行，參考農(nóng)秀美等［12］的方法，以1.5 cm的病斑長度作為抗感分界線，按照如下標準調(diào)查病情:免疫(I)，傷口無癥狀或僅有褐點;高抗(HR)，0.1＜病斑長≤0.5 cm;抗(R)，0.5＜病斑長≤1 cm;中抗(MR)，1.0 cm﹤病斑長度≤1.5 cm;感(S)，1.5 cm﹤病斑長度≤2.5 cm;高感(HS)，病斑長度﹥2.5 cm。

1.4 抗性基因xa5檢測

試驗材料葉片基因組DNA采用CTAB法提取。利用與xa5緊密連鎖的SSR標記RM17743進行基因檢測［13］。RM17743引物序列及PCR擴增程序見文獻［13］。擴增產(chǎn)物通過7%PAGE膠電泳銀染檢測。

1.5 農(nóng)藝性狀考察

田間試驗采用完全隨機區(qū)組設計，3次重復，每個小區(qū)種植50株，成熟期，每小區(qū)隨機收割3株，對株高、單株有效穗、穗長、總實粒數(shù)、總秕谷數(shù)、穗粒數(shù)、結實率、千粒重及單株產(chǎn)量等農(nóng)藝性狀進行考察，算出平均值。

1.6 統(tǒng)計分析

利用Excel軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 結果與分析

2.1 白葉枯病及細條病抗性反應

利用強毒型菌株(Ⅴ型)對285份水稻材料進行白葉枯病接種結果表明(表1):抗(R)的材料9份，僅占3.2%;中抗(MR)的材料7份，占2.5%;中感(MS)材料最少，為3份，占1.1%;感(S)的材料為266份，占93.3%。對于細條病菌JZ-8菌株(表1):高抗(HR)材料有2份，占0.7%;抗(R)的材料31份，占10.9%;中抗(MR)的材料50份，占17.5%;感(S)和高感(HS)的材料均為101份，各占35.4%。對于細條病菌LZ-4菌株(表1):高抗(HR)材料有16份，占5.6%;抗(R)的材料68份，占23.9%;中抗(MR)的材料100份，占35.1%;感(S)的材料有99份，占34.7%;高感(HS)的材料僅為5份，占1.8%。接種鑒定結果未發(fā)現(xiàn)對細條病菌JZ-8和LZ-4菌株表現(xiàn)免疫的材料(表1)。

表1 285份材料對白葉枯病和細條病的抗性反應Table 1 Reaction of 285 rice lines to bacterial blight and bacterial leaf streak

表2 兼抗材料的抗性級別和平均病斑長度Table 2 The resistance scale and average disease lesion length of the lines with resistance to both bacterial blight and bacterial leaf streak

白葉枯病(Ⅴ型)抗性與細條病菌JZ-8和LZ-4菌株抗性相關系數(shù)分別是－0.02和0.11，均不存在顯著相關性。JZ-8和LZ-4菌株抗性相關系數(shù)為0.46，呈極顯著相關性(P=0.01)。

2.2 兼抗材料篩選

在所鑒定的285份材料中，對白葉枯病菌(Ⅴ型)和至少1個以上細條病菌菌株抗性達到中抗(MR)以上水平的材料總共有9份(表2)。在兼抗材料中，IRBB5的綜合抗性最好，對強毒型白葉枯病菌(Ⅴ型)表現(xiàn)為抗(R)，對細條病菌JZ-8菌株也表現(xiàn)為抗(R)，對LZ-4菌株表現(xiàn)為高抗(HR);L661對接種的白葉枯病和細條病菌株均顯為抗(R); L743中抗(MR)白葉枯，高(HR)細條病菌JZ-8菌株，抗細條病菌LZ-4菌株;L742、L747、L748、明恢63和茂3R抗譜一樣，均中抗(MR)白葉枯病，抗(R)細條病菌的JZ-8和JZ-4菌株;L708中抗(MR)白葉枯病和細條病菌的LZ-4菌株，但是高感(HS)細條病菌的JZ-8菌株。

圖1 利用RM 17743檢測xa5基因Fig.1 Detection of xa5 with RM17743

2.3 兼抗材料基因檢測

利用與兼抗基因xa5緊密連鎖的SSR標記RM17743對9份兼抗材料進行檢測，結果表明: L661和IRBB5(xa5供體)攜帶有xa5基因，能擴增出小于100 bp的DNA片段;其他7份材料，L708、L742、L743、L747、L748、明恢63和茂3R，均不含有兼抗基因xa5，擴增不出特異帶(圖1)。

2.4 兼抗材料農(nóng)藝性狀表現(xiàn)

如表3所示，9份兼抗材料株高適中，介于83～118 cm;有效穗介于9～14;穗長最高為30.7 cm，最短為24.0 cm;單株總實粒數(shù)介于1237～2202;總秕谷數(shù)介于163～512;穗粒數(shù)最高為199，最小為130;結實率較好，介于80.6～91.6;千粒重介于21.9～28.9;單株產(chǎn)量介于33.0～52.7。分析結果表明9份兼抗材料表現(xiàn)出較好的綜合農(nóng)藝性狀，可作為優(yōu)異抗性資源應用于育種實踐。

如表3所示，9份兼抗材料株高適中，介于83～118 cm;有效穗介于9～14;穗長最高為30.7 cm，最短為24.0 cm;單株總實粒數(shù)介于1237～2202;總秕谷數(shù)介于163～512;穗粒數(shù)最高為199，最小為130;結實率較好，介于80.6～91.6;千粒重介于21.9～28.9;單株產(chǎn)量介于33.0～52.7。分析結果表明9份兼抗材料表現(xiàn)出較好的綜合農(nóng)藝性狀，可作為優(yōu)異抗性資源應用于育種實踐。

3 討論

在抗性育種實踐中，由于病原菌生理小種發(fā)生了變異，而導致抗性品種喪失抗性的現(xiàn)象一直是育種工作者關注和研究的熱點問題。白葉枯?、跣途侨A南稻區(qū)新上升發(fā)展的強毒菌系，使很多抗性基因喪失抗性，對水稻生產(chǎn)造成嚴重威脅，迫使人們對Ⅴ型菌研究的重視。普通野生稻資源和國際水稻資源中含有較為豐富的白葉枯?、跣途悼乖?。本研究對285份適應華南生態(tài)條件的水稻材料進行分析，獲得9份抗和7份中抗的材料，說明從適應華南稻區(qū)生態(tài)條件的種質(zhì)資源中篩選獲得可供育種利用的白葉枯病Ⅴ型菌抗源是可行的。

表3 9份兼抗材料的產(chǎn)量相關農(nóng)藝性狀Table 3 Yield-related agronomic traits of the lines with resistance to both bacterial blight and bacterial leaf streak

細條病對水稻生產(chǎn)造成嚴重危害，近10多年來，已上升為華南、中南稻區(qū)上的主要細菌病害，其危害程度已超過水稻白葉枯?。?4］，稻種資源中細條病抗源比較豐富［15］。本研究從285份水稻材料中，篩選獲得多份對細條病JZ-8和LZ-4菌株表現(xiàn)為中抗以上的材料，進一步說明稻種資源中細條病抗源豐富。前人研究發(fā)現(xiàn)稻種資源中少有對細條病菌表現(xiàn)為免疫的材料［16］，本研究也未發(fā)現(xiàn)存在對細條病菌JZ-8和LZ-4菌株免疫的材料。

白葉枯病和細條病是水稻黃單胞菌的兩個不同致病變種引起，兩者的致病機制和癥狀表現(xiàn)均不同。本研究結果也表明水稻對白葉枯病和對細條病的抗性之間不存在顯著相關。但是，水稻對細條病菌JZ-8和LZ-4菌株抗性之間存在極顯著的正相關性。JZ-8菌株中抗以上的材料比LZ-4的少，說明JZ-8菌株的致病力比LZ-4菌株的強。

白葉枯病菌和細條病菌在形態(tài)特征、生物學特性和流行特點等各方面都非常相似，因此有學者提出在育種工作中優(yōu)先選用既抗白葉枯病又抗條斑病雙抗源材料的建議，以便達到事半功倍的防治效果［9］。研究發(fā)現(xiàn)含有xa5的近等基因系抗白葉枯病同時兼抗細條病［17－18］。Xie等［19］通過基因精細定位和克隆進一步驗證抗白葉枯病基因?qū)殫l病的抗性。本研究所得的9份抗白葉枯病兼抗細條病的材料中，經(jīng)標記檢測，只有L661和IRBB5攜帶xa5兼抗基因。如果將xa5介導的兼抗性分為一種類型，那么其他不含xa5的7份材料屬于不同類型的兼抗性。有必要對這7份材料開展進一步的研究，以便明確兼抗性是否由同一基因或者不同的抗性基因控制。比如明恢63，研究表明其含有抗白葉枯病基因Xa25［20］，因此需要進一步的遺傳分析來明確Xa25是否介導細條病抗性，或者明恢63含有不一樣的細條病抗性基因。

本研究所得的9份材料具有較好的綜合農(nóng)藝性狀。明恢63是應用面積最大的強恢復系之一，IRBB5已經(jīng)廣泛應用水稻抗性改良育種。這些具有優(yōu)良農(nóng)藝性狀的兼抗材料，對于拓寬白葉枯病和細條病抗性育種材料基礎及提高育種效率有重要意義。

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(責任編輯 王冠玉)

Gene Analysis of Rice Germ plasm for Resistance to Bacterial Blight and Bacterial Leaf Streak

QIN Gang1，YAN Yong1*，MA Zeng-feng1，CHEN Yuan-meng1，QIN Yuan-yuan2，CEN Zhen-lu3，LUO Tong-ping1，LIU Chi1，ZHANG Yue-xiong1，HUANG Da-hui1＊＊
(1.Rice Research Institute，Guangxi Academy of Agricultural Sciences/Guangxi Key Laboratory of Rice Genetics and Breeding/Nanning Subcenter of the National Center for Rice Improvement，Guangxi Nanning 530007，China;2.Agricultural Science and Technology Information Research Institute，Guangxi Academy of Agricultural Sciences，Guangxi Nanning530007，China;3.Plant Protection Research Institute，Guangxi Academy of Agricultural Sciences，Guangxi Nanning 530007，China)

285 rice lines were used to screen resources and getboth resistance to bacterial blightand bacterial leaf streak by artificial inoculation and molecularmarker analysis in present study.The results indicated 9 and 7 lineswere resistant to strong virulentⅤtype strain of bacterial blight at resistant level and moderate level respectively.For JZ-8 strain of bacterial leaf streak，2 lineswere highly resistant，31 lines were resistant，and 50 lines weremoderately resistant.For LZ-4 strain of bacterial leaf streak，16 lineswere highly resistant，68 lineswere resistant，and 100 lines weremoderately resistant.From all the 285 lines，9 lines were resistant to bacterial blight and at least one of the strains of bacterial leaf streak abovemoderate resistance level.The 9 lines with resistance to both bacterial blight and bacterial leaf streak showed good yield-related agronomical traits.Two of these lineswere found to carry xa5 thatmediated resistance to both bacterial blight and bacterial leaf streak.Other seven of these lineswere not found to carry xa5 that belong to another type of resistance.There was no significant correlation between the resistance of bacterial blight and bacterial leaf streak.There was highly significant correlation between the resistance of JZ-8 and LZ-4 of bacterial leaf streak.

Rice;Bacterial blight;Bacterial leaf streak;Screening of resources;Genes

S511

A

1001－4829(2017)2－0354－05

10.16213/j.cnki.scjas.2017.2.019

2016－10－19

國家自然科學基金項目(31360329);廣西農(nóng)業(yè)科學院基本科研業(yè)務專項(桂農(nóng)科2016YM59，桂農(nóng)科2015YM10)

秦鋼(1978－)，男，廣西全州人，副研究員，主要從事水稻育種研究工作，E-mail:68578721@qq.com，*為共同第一作者，＊＊為通訊作者，E-mail:hdh1103@163.com。