過表達(dá)BCL-2對(duì)急性腦梗死大鼠神經(jīng)功能的影響

彭靜華， 金 飛， 張鴻日， 張育德， 閆俊強(qiáng)

過表達(dá)BCL-2對(duì)急性腦梗死大鼠神經(jīng)功能的影響

彭靜華1， 金 飛2， 張鴻日3， 張育德1， 閆俊強(qiáng)1

目的 探討采用慢病毒介導(dǎo)Bcl-2在急性腦梗死大鼠腦組織過表達(dá)對(duì)神經(jīng)功能的影響。方法 45只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和治療組。假手術(shù)組和模型組分別于手術(shù)前10 d通過顱內(nèi)動(dòng)脈給予慢病毒空載體，治療組給予慢病毒Bcl-2過表達(dá)載體。在采用線栓法制作大鼠大腦中動(dòng)脈腦梗死模型72 h后，分析大鼠腦組織梗死范圍、腦細(xì)胞凋亡指數(shù)以及神經(jīng)功能的變化。結(jié)果 慢病毒介導(dǎo)的Bcl-2表達(dá)質(zhì)粒可在大鼠腦組織中表達(dá)，治療組大鼠腦組織中Bcl-2的水平明顯高于假手術(shù)組和模型組；與假手術(shù)組比較，模型組和治療組腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡指數(shù)和腦組織梗死范圍明顯增加(P<0.05)，而治療組神經(jīng)細(xì)胞凋亡指數(shù)和腦組織梗死范圍較模型組明顯下降(P<0.05)；治療組大鼠神經(jīng)功能損傷評(píng)分較模型組明顯下降(P<0.05)。結(jié)論 過表達(dá)Bcl-2可降低大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡水平，對(duì)神經(jīng)具有一定保護(hù)作用，為臨床急性腦梗死治療提供了一定的參考依據(jù)。

腦梗死； Bcl-2； 細(xì)胞凋亡； 神經(jīng)保護(hù)

急性腦梗死發(fā)病率高、致死率高，已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅人類健康的疾病類型之一[1]。急性腦梗死發(fā)作時(shí)，腦組織血液供應(yīng)發(fā)生障礙，導(dǎo)致局部腦組織因缺血發(fā)生壞死、軟化。但是在缺血中心不可逆壞死區(qū)域與正常腦組織之間存著缺血半暗帶區(qū)，該區(qū)域的組織在功能上呈現(xiàn)可逆性損害，這部分組織細(xì)胞仍呈現(xiàn)正常的組織結(jié)構(gòu)，但是在形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)為凋亡狀態(tài)[2]。而細(xì)胞的凋亡則是由基因調(diào)控細(xì)胞程序性死亡的過程，其中Bcl-2是一個(gè)重要的與細(xì)胞凋亡相關(guān)的蛋白，其由239個(gè)氨基酸組成，在抑制細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著重要作用[3]。目前大量研究顯示Bcl-2基因和蛋白在急性腦梗死患者腦組織中表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致腦梗死細(xì)胞凋亡水平明顯增加，加劇了腦梗死患者神經(jīng)功能損傷程度[4]。通過抑制腦梗死半暗帶細(xì)胞的凋亡，則可達(dá)到保護(hù)神經(jīng)功能的作用。在這一理論的基礎(chǔ)上，鑒于Bcl-2的抑制細(xì)胞凋亡的特性，本研究在動(dòng)物水平上分析了采用慢病毒介導(dǎo)Bcl-2載體在急性腦梗死大鼠腦組織特異性高表達(dá)對(duì)大鼠腦神經(jīng)功能的影響，旨在為臨床治療急性腦梗死提供一定的理論依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器和材料 SD大鼠(180～200 g)購自上海斯萊克動(dòng)物中心；HRP-羊抗鼠二抗購自北京中杉有限公司；Triozol購自Invitrogen公司；Bcl-2購自美國Santa公司；TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒購自南京諾唯贊生物有限公司；TTC染液購自南京建成生物工程研究所。

1.2 急性腦梗死大鼠模型構(gòu)建及處理 采用longa的方法[5]建立大鼠大腦中動(dòng)脈腦梗死模型。在手術(shù)后2 h內(nèi)大鼠表現(xiàn)出精神萎靡，同側(cè)霍納氏癥，對(duì)側(cè)前肢下垂，內(nèi)收內(nèi)旋，并自發(fā)性向患側(cè)轉(zhuǎn)圈說明建模成功。若無此表現(xiàn)說明構(gòu)建模型失敗，則剔除該大鼠。實(shí)驗(yàn)分為3組，假手術(shù)組、模型組和治療組，每組15只。假手術(shù)組大鼠只分離血管不插線栓。假手術(shù)組和模型組分別于手術(shù)前10 d通過顱內(nèi)動(dòng)脈給予慢病毒空載體，治療組給予慢病毒Bcl-2過表達(dá)載體。

1.3 TUNEL分析腦組織細(xì)胞凋亡水平 大鼠建模72 h后處死大鼠，腦組織采用OCT包埋，然后采用冰凍切片機(jī)將腦組織切成厚度為7 μm的切片，粘附于玻片上。然后按照TUNEL試劑盒說明書進(jìn)行操作。大體操作流程如下：玻片采用4%多聚甲醛溶液(溶于PBS)固定，用2 mg/ml的Proteinase K溶液處理玻片，然后滴加100 μl 1 × Equilibration Buffer于標(biāo)本區(qū)域，孵育30 min后棄液體，在玻片上滴加50 μl TdT孵育緩沖液。37 ℃孵育60 min。PBS洗滌3次，每次5 min，用濾紙輕輕擦掉樣本周圍及背面的PBS溶液。立即在熒光顯微鏡下分析樣本。觀察時(shí)標(biāo)本放大400倍，隨機(jī)選取梗死區(qū)周邊的區(qū)域10個(gè)視野，計(jì)算凋亡細(xì)胞占總細(xì)胞的比例作為腦細(xì)胞的凋亡指數(shù)。

1.4 TTC染色分析腦組織梗死范圍變化 大鼠建模后72 h立即處死，取腦組織做冠狀切片，然后將切片置于2%的TTC磷酸緩沖液中37 ℃染色20 min。然后采用多聚甲醛固定，正常組織為紅色，梗死組織為白色。并在顯微鏡下分離梗死組織與正常腦組織，用分析天平稱取正常組織和梗死組織的濕重，梗死范圍為梗死組織重量占梗死組織與正常腦組織總質(zhì)量的百分?jǐn)?shù)。

1.5 大鼠神經(jīng)功能分析 假手術(shù)組、模型組和治療組大鼠分別于術(shù)后24 h，48 h和72 h采用Bederson標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分進(jìn)行神經(jīng)功能缺損分析[6]。無神經(jīng)功能缺損癥狀計(jì)0分；不能完全伸展患側(cè)前爪計(jì)1分；向患側(cè)轉(zhuǎn)圈計(jì)2分；向患側(cè)傾倒計(jì)3分；不能自發(fā)行走且意識(shí)喪失計(jì)4分；死亡5分。

2 結(jié) 果

2.1 不同處理組大鼠腦組織Bcl-2表達(dá)水平比較 結(jié)果如圖1所示，與假手術(shù)組和模型組比較，治療組大鼠經(jīng)慢病毒介導(dǎo)的Bcl-2載體在腦組織中表達(dá)高水平的Bcl-2蛋白。對(duì)3組大鼠腦組織中Bcl-2蛋白的水平分析顯示：治療組大鼠腦組織中Bcl-2的表達(dá)水平明顯高于假手術(shù)組和模型組(P<0.05)。

A：Western blot分析了3組大鼠腦組織Bcl-2表達(dá)水平；B：定量分析了3組大鼠腦組織Bcl-2表達(dá)水平

圖1 3組大鼠腦組織中Bcl-2蛋白的表達(dá)水平變化

2.2 3組大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡和腦梗死范圍比較 大鼠建模后72 h腦組織細(xì)胞凋亡指數(shù)和梗死范圍明顯增加，而在過表達(dá)Bcl-2的大鼠腦組織中細(xì)胞凋亡指數(shù)降低，梗死范圍較小(如圖2A

和2C所示)。對(duì)凋亡水平和梗死范圍進(jìn)行定量分析顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織中細(xì)胞凋亡指數(shù)和梗死范圍顯著增加(P<0.05)。而治療組大鼠腦組織中細(xì)胞凋亡指數(shù)和梗死范圍較模型組則顯著性下降(P<0.05)，但是其水平仍然顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)(如圖2B和2D)。

2.3 3組大鼠神經(jīng)損傷程度比較 結(jié)果如表1所示，對(duì)3組大鼠神經(jīng)損傷程度進(jìn)行評(píng)定顯示，模型組和治療組大鼠在建模后神經(jīng)損傷程度較假手術(shù)組明顯增加，治療組神經(jīng)功能損傷程度明顯低于模型組(P<0.05)，治療組大鼠神經(jīng)損傷程度仍然顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)。

表1 3組大鼠神經(jīng)損傷程度比較

*：與假手術(shù)組比較，P<0.05；#：與模型組比較，P<0.05

A：TUNEL分析3組大鼠腦細(xì)胞凋亡情況；B：定量分析3組大鼠腦細(xì)胞凋亡指數(shù)變化；C：TTC染色顯示3組大鼠腦組織梗死范圍情況；D：定量分析3組大鼠腦組織梗死范圍

圖2 3組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡指數(shù)和梗死情況比較

3 討 論

細(xì)胞凋亡是指細(xì)胞在一定生理或者病理?xiàng)l件下，有許多基因精密調(diào)控的程序化死亡過程，是細(xì)胞維持自我穩(wěn)定的重要機(jī)制[7]。目前研究發(fā)現(xiàn)急性腦梗死過程中抑制缺血半暗帶區(qū)域細(xì)胞凋亡是治療急性腦梗死的關(guān)鍵，這部分細(xì)胞具有可逆性，可通過抑制細(xì)胞凋亡使其恢復(fù)功能。因此有效抑制該區(qū)域細(xì)胞的凋亡對(duì)降低腦組織細(xì)胞凋亡，降低神經(jīng)功能損傷具有重要的意義[8]。 Bcl-2是細(xì)胞凋亡調(diào)控中主要的調(diào)控蛋白，是主要的凋亡抑制蛋白。但是研究發(fā)現(xiàn)在急性腦梗死患者血清中Bcl-2的表達(dá)水平明顯下降，說明機(jī)體抗凋亡能力下降，細(xì)胞凋亡的穩(wěn)態(tài)被打破[9]。因此通過重建機(jī)體腦組織中凋亡穩(wěn)態(tài)環(huán)境，可能抑制腦梗死半暗帶區(qū)域細(xì)胞的凋亡，對(duì)腦組織起到保護(hù)作用。在這一思想的指導(dǎo)下，我們分析了大腦腦組織過表達(dá)Bcl-2對(duì)急性腦梗死大鼠腦組織凋亡的影響。本研究采用慢病毒介導(dǎo)Bcl-2在大鼠腦組織中過表達(dá)Bcl-2，Western bolt顯示治療組大鼠腦組織中Bcl-2的表達(dá)水平明顯增加。說明采用慢病毒作為傳輸載體可實(shí)現(xiàn)Bcl-2在腦組織中的過表達(dá)。

Bcl-2高表達(dá)抑制了急性腦梗死大鼠腦組織細(xì)胞的凋亡[10]。由于凋亡被抑制，腦組織半暗帶凋亡可能發(fā)生逆轉(zhuǎn)，因此有可能減少腦組織梗死面積。我們研究結(jié)果證實(shí)Bcl-2大鼠腦組織腦組織梗死范圍較模型組明顯下降，這一結(jié)果凋亡指數(shù)下降的現(xiàn)象一致。腦組織梗死面積減小，細(xì)胞凋亡水平減少，對(duì)大鼠神經(jīng)功能評(píng)定發(fā)現(xiàn)Bcl-2大鼠神經(jīng)功能的缺損程度明顯低于模型組。值得注意的是Bcl-2的高表達(dá)對(duì)凋亡的抑制有一定的限度，Bcl-2高表達(dá)的大鼠腦組織細(xì)胞凋亡水平、梗死范圍以及神經(jīng)功能缺損程度明顯高于假手術(shù)組大鼠。

綜上所述，急性腦梗死大鼠腦組織高表達(dá)Bcl-2可顯著抑制腦細(xì)胞凋亡、降低腦梗死范圍，保護(hù)神經(jīng)功能，本研究為急性腦梗死治療藥物的研發(fā)提供了一定的理論基礎(chǔ)。

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Neuroprotective effects of Bcl-2 overexpression in rats with acute cerebral infarction

PENGJinhua，JINFei，ZHANGHongri，etal.

(DepartmentofNeurology，TheFirstAffiliatedHospitalofHenanUniversityofScienceandTechnology，Luoyang471003，China)

Objective To investigate the neuroprotective effects of Bcl-2 overexpression in rats with acute cerebral infarction. Methods 45 rats were randomly divided into sham group(only isolated vascular suture unplugged，n=15)，model group(n=15)and treatment group(n=15). Rats in sham group and model group were treated with empty vector mediated by lentiviral. Rats in treatment group were treated with Bcl-2 overexpression mediated by lentiviral. After middle cerebral artery infarction model were constructed at 72 h，infarct size and neural function defect of brain cell were analyzed. Results Bcl-2 protein mediated by lentiviral can be expressed in rat brain. Bcl-2 protein levels in treatment group significantly increased than that of the sham group and model group(P<0.05). Apoptosis index and infarction range of brain tissues in model group and treatment group significantly enhanced than that of sham group(P<0.05). Apoptosis index and infarction range of brain tissues in treatment group significantly decreased than that of model group(P<0.05). Compared with sham group，neural function defect scores in model group and treatment group significantly enhanced(P<0.05)，while those scores in treatment group significantly decreased than that of model group(P<0.05). Conclusion Overexpression of Bcl-2 can reduce the level of apoptosis in rat brain nerve cells and have a protective effect on nerve provides a frame of reference for the clinical treatment of acute cerebral infarction.

Acute cerebral infarction； Bcl-2； Cell apoptosis； Neuroprotective effect

2016-09-15；

2017-02-26

國家自然科學(xué)基金(No. U1304809)；河南洛陽市青年醫(yī)學(xué)科技創(chuàng)新聯(lián)合專項(xiàng)資金項(xiàng)目(No. 1503008A-15)

(1.河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 洛陽 471003；2.河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院第一藥房，河南 洛陽 471003；3.河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，河南 洛陽 471003)

彭靜華，E-mail：jinghuapeng@126.com

1003-2754(2017)03-0217-04

R743

A