溫陽(yáng)活血方對(duì)慢性心衰大鼠心肌組織轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1的影響

王 健，劉 麗

（廣東省深圳市福田區(qū)中醫(yī)院心內(nèi)科，廣東 深圳 518033）

論 著

溫陽(yáng)活血方對(duì)慢性心衰大鼠心肌組織轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1的影響

王 健，劉 麗

（廣東省深圳市福田區(qū)中醫(yī)院心內(nèi)科，廣東 深圳 518033）

目的：觀察溫陽(yáng)活血方對(duì)慢性心力衰竭大鼠心肌組織轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）的影響。方法：利用腎上腹主動(dòng)脈縮窄法制備慢性心力衰竭大鼠模型30只隨機(jī)分為3組各10只，溫陰活血方組給予溫陽(yáng)活血方（8mL/kg）每日灌胃，假手術(shù)組和模型組給予等量生理鹽水灌胃，假手術(shù)組只分離服主動(dòng)脈通不結(jié)扎。觀察各組大鼠左心室重量指數(shù)（LVMI）和膠原容積積分（CVF），RT—PCR測(cè)定各組大鼠左心室心肌TGF-β1mRNA表達(dá)水平。結(jié)果：與假手術(shù)組比較，模型組LVMI、CVF明顯升高，左心室心肌TGF-β1mRNA表達(dá)明顯升高（P＜0．05）；與模型組比較，溫陽(yáng)活血方組LVMI、CVF明顯下降，左心室心肌TGF-β1mRNA表達(dá)明顯下降（P＜0．05）。結(jié)論：溫陽(yáng)活血方通過(guò)影響信號(hào)通路中TGF-β1mRNA的表達(dá)而改善心衰大鼠心肌纖維化程度。

慢性心力衰竭；大鼠模型；溫陽(yáng)活血；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子影響

心室重塑是心衰的基本發(fā)病機(jī)制，心肌纖維化（myocardial fibrosis，MF）是多種心臟疾病發(fā)展到一定階段的共同病理改變，是心肌重構(gòu)的主要表現(xiàn)之一［1］。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)某些細(xì)胞因子與MF的關(guān)系密切，被認(rèn)為是各種促M(fèi)F因素作用的最后共同環(huán)節(jié)。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子- β（ transforming growth factor-β，TGF-β）在心肌纖維化發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中具有促進(jìn)肌性成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，促進(jìn)膠原基因表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成與沉積等作用，是最重要的促心肌纖維化細(xì)胞因子之一［2］。本研究旨在探討溫陽(yáng)活血方對(duì)慢性心力衰竭大鼠心肌組織轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）的影響，為防治MF提供新的理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。清潔雄性Wistar大鼠30只，體質(zhì)量200～220g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：粵監(jiān)證字2012C066。

試藥。溫陽(yáng)活血方桂枝0.5g/6g（表示藥物生粉量是0.5g相當(dāng)于原藥物劑量6g），制附子0.7g/6g，紅參1.2g/5g，黃芪2g/10g，三七末1.5g/2g，茯苓0.5g/10g，丹參1.5g/10g，郁金1g/10g，赤芍2g/10g，葶藶子1g/10g。三九醫(yī)藥公司提供中藥免煎劑各1包，加開水至100mL，每日按8mL/1kg［3］大鼠灌胃。

試劑。PT-PCR試劑盒（大連寶生物工程有限公司，批號(hào)RR390A，Trizol（心肌總RNA抽提試劑）購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，TGF-β1引物（上海生工公司合成，批號(hào)5596-026）。

主要儀器。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)ADI公司，型號(hào)T300），L6型紫外分光光長(zhǎng)度計(jì)（上海儀電儀器有限公司），2E型紫外透射反射分析儀（上海驥輝科學(xué)分析儀器有限公司）。

2 方 法

動(dòng)物分組。30只大鼠隨機(jī)分為3組，假手術(shù)組、模型組、溫陽(yáng)活血方組，每組10只。

造模。參照文獻(xiàn)［4］建立大鼠慢性心力衰竭（congestive heart failure，CHF）模型。用3%戊巴比妥鈉0.15 mL／100g腹腔注射麻醉，腹部正中劍突下切開皮膚2～3cm，打開腹腔，在左腎動(dòng)脈上方分離腹主動(dòng)脈，穿過(guò)1條0號(hào)絲線，將去尖磨鈍的7號(hào)手術(shù)針置于絲線處，結(jié)扎絲線，迅速抽取手術(shù)針，檢查腹主動(dòng)脈通暢后分層關(guān)腹。術(shù)后均給予連續(xù)3天腹腔青霉素20萬(wàn)U注射。常規(guī)喂養(yǎng)4周，大鼠逐漸出現(xiàn)呼吸、心跳加快、倦怠無(wú)力、食欲減退等表現(xiàn)，并檢測(cè)血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)，以左心室舒張末壓（LVEDP）≥15mmHg作為模型成功標(biāo)準(zhǔn)。假手術(shù)組只分離腹主動(dòng)脈而不結(jié)扎。成功建立模型后，溫陽(yáng)活血方組給予溫陽(yáng)活血方按8mL/（kg·d）大鼠灌胃。模型組和假手術(shù)組給予等量生理鹽水灌胃，連續(xù)4周。

3 檢測(cè)指標(biāo)

左心室重量指數(shù)（LVMI）。處死大鼠后，迅速開胸取出心臟，用0.9%氯化鈉清洗，濾紙吸干，稱重；沿房室環(huán)剪去心房及右室游離壁，稱重，余下的左室游離壁和室間隔測(cè)定左室質(zhì)量，左室質(zhì)量與體質(zhì)量的比值為左室質(zhì)量指數(shù)（LVMI，mg/g）。

Masson染色和膠原容積分?jǐn)?shù)檢測(cè)。每只大鼠選取左室中段橫截面心肌，3張組織切片進(jìn)行Masson染色，采用Biosens Digital Imaging System醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)，每組大鼠心肌病理切片中隨機(jī)選取10高倍個(gè)視野（×400）測(cè)量選定區(qū)域染色組織的面積（膠原染色呈紅色），計(jì)算膠原面積與心肌組織總面積的比值，取其均值為膠原容積分?jǐn)?shù)（CVF）。

R T-P C R檢測(cè)心肌T G F-β1m R N A表達(dá)水平。用Trizol提取心肌總RNA，紫外分光光度計(jì)（A260nm/A280nm）測(cè)量總RNA的量，取2μL 總RNA行RT-PCR擴(kuò)增。大鼠TGF-β1上游引物序列：TGGACCGCAACAACGCAATCTA，下游引物：CACCTCGACGTTTGGGACTGATC，擴(kuò)增產(chǎn)物為396 bp；β-actin作為內(nèi)參上游引物：GAGAGGGAAATCGTGCGTGAC，下游引物：CATCTGCTGGAAGGTGGACA，擴(kuò)增產(chǎn)物為452bp。擴(kuò)增條件：取3μg總RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，PCR反應(yīng)條件為：94℃，2min；94℃，30s；50℃～65℃，30s；72℃，1min，第2步起循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，采用ZF型紫外透射反射分析儀攝像，采用Quantity-4.6.2軟件分析照片中目的條帶的灰度值，并計(jì)算各目的條帶與其相應(yīng)內(nèi)參β-actin的灰度值比值。

4 結(jié) 果

各組LVMI與CVF比較見表1。

表1 各組LVMI與CVF比較 （±s）

表1 各組LVMI與CVF比較 （±s）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05，與模型組比較，△P＜0.05。

組別 n LVMI（mg/g-1） CVF（%）假手術(shù)組 10 2.07±0.36 12.11±2.02模型組 10 2.89±0.79*27.09±7.12*溫陽(yáng)活血方組 10 2.46±0.23△16.83±2.79△

各組RT-PCR檢測(cè)TGF-β1mRNA表達(dá)水平見表2。

表2 各組大鼠心肌TGF-β1mRNA表達(dá)水平比較 （±s）

表2 各組大鼠心肌TGF-β1mRNA表達(dá)水平比較 （±s）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。

組別 n TGF-β1假手術(shù)組 10 0.92±0.12模型組 10 1.98±0.53*溫陽(yáng)活血方組 10 1.24±0.23△

5 討 論

MF是指在心肌間質(zhì)中膠原纖維過(guò)量積聚，心組織中膠原濃度升高或膠原成分發(fā)生改變，可引起心力衰竭，心律失常，心源性猝死等嚴(yán)重并發(fā)癥，因此阻止心肌纖維化的發(fā)生，延緩及其發(fā)展對(duì)提高心臟疾病的生存率有重要意義［5］。本實(shí)驗(yàn)中與假手術(shù)組相比，模型組LVMI增加、CVF濃度增加，說(shuō)明模型組出現(xiàn)心肌肥厚。

研究表明，TGF-β1過(guò)度表達(dá)可促進(jìn)心肌纖維化和心肌肥厚而導(dǎo)致心室重構(gòu)，參與心肌纖維化發(fā)生的早期過(guò)程［6］。TGF-β1是一類多功能細(xì)胞因子，在纖維化的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起著重要作用，是組織器官纖維化的主要調(diào)控因子之一［7］，其高表達(dá)具有促組織發(fā)生纖維化的病理作用，它可促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的合成與分泌，減少細(xì)胞外基質(zhì)的降解，增加膠原與基質(zhì)蛋白的生成，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞外基質(zhì)的沉積，從而引起心肌纖維化［8］。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）是由多種細(xì)胞分泌的一類具有廣泛生物學(xué)效應(yīng)的生長(zhǎng)因子，對(duì)心血管系統(tǒng)有多種病理生理作用。Smads蛋白是TGF-β1下游的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)節(jié)分子。Smads蛋白是TGF-β唯一的作用底物，能將TGF-β信號(hào)從細(xì)胞外傳遞到細(xì)胞核的中介分子，是該信號(hào)通路中的關(guān)鍵步驟，其分子組成與調(diào)節(jié)復(fù)雜，與其他信號(hào)通路存在廣泛的交互影響，對(duì)心肌纖維化、心肌肥大等的發(fā)生和發(fā)展有明確的作用近年研究表明，TGF-β/Smads信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與多種心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［9］，作為TGF-β1下游的信號(hào)蛋白介導(dǎo)TGF-βI的促纖維化作用，是引起MF的重要細(xì)胞因子之一。本實(shí)驗(yàn)中，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的左室心肌，TGF-β1表達(dá)明顯增加，說(shuō)明，TGF-β1在MF和心室重塑進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。

溫陽(yáng)活血法是目前治療心衰最常用的方法。多年的臨床證實(shí)，溫陽(yáng)活血方對(duì)心衰有明顯的療效。方中單藥具有降壓、調(diào)脂、改善血流動(dòng)力學(xué)和內(nèi)皮細(xì)胞的功能［10-11］，可顯著抑制心肌纖維化［12-14］。溫陽(yáng)活血方藥中黃芪、桂枝益氣通陽(yáng)；制附子溫陽(yáng)宣肺利水；丹參、赤芍活血化瘀通痹，治療血分之瘀滯；紅參、三七益氣活血、通絡(luò)止痛；桂枝、葶藶子、茯苓能增加冠狀動(dòng)脈血流，增強(qiáng)心肌收縮力，減慢心率，心輸出量；茯苓、桂枝有顯著利尿作用，能促進(jìn)水濕排出，減輕心肌負(fù)荷。黃芪具有強(qiáng)心、降低總外周阻力、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、改善微循環(huán)、降低心肌耗氧，以及抗氧自由基、保護(hù)細(xì)胞功能等作用。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型組比較溫陽(yáng)活血方組LVMI、CVF明顯下降，TGF-β1mRNA表達(dá)明顯下降，說(shuō)明溫陽(yáng)活血中藥能抑制心肌肥厚，其減輕MF、改善心臟功能的作用，可能與其抑制心肌組織TGF-β1mRNA的過(guò)度表達(dá)有關(guān)。

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Objective：To observe the effect of WenYang HuoXue Decoction on the expression of TGF-β1 in rats with chronic heart failure.Method：A CHF model of rat was established by constricting the abdominal aorta superior to renal artery.30 male Wistar rats were randomly divided into sham operation group，model group，and WenYang HuoXue Decoction group, 10 rats in each group. WenYang HuoXue Decoction group were given WenYang HuoXue Decoction（8kg/kg） by intragastric administration everyday. Their LVMI and CVF was measured and TGF-β1 mRNA in the left ventricular myocardium were assessed by RT—PCR.Result：The LVMI、CVF and TGF-β1 mRNA were significantly higher in model group than that in sham operation（P＜0.01）.The LVMI、CVF and TGF-β1 mRNA were significantly lower in WenYang HuoXue group than that of the model group（P＜0.01）.Conclusion：WenYang HuoXue Decoction could significantly improve myocardial fibrosis through decreasing the over-expression of TGF-β1 mRNA.

Chronic heart failure；Rat model；WenYang HuoXue Deccotion；Connective tissue growth factor

R256.214.61

B

1004-2814（2017）02-0110-03

2016-10-18