芋艿分離蛋白的制備及工藝條件優(yōu)化

黃友如，王教飛，李昕蓓，徐田甜

（常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇 常熟 215500）

芋艿分離蛋白的制備及工藝條件優(yōu)化

黃友如，王教飛，李昕蓓，徐田甜

（常熟理工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，江蘇 常熟 215500）

利用響應(yīng)面法對(duì)芋艿分離蛋白的制備工藝進(jìn)行優(yōu)化.在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以芋艿分離蛋白得率和純度為響應(yīng)值，進(jìn)行四因素三水平Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì).通過(guò)各個(gè)因素的顯著性和交互作用分析，得到芋艿分離蛋白制備的最佳工藝條件為：浸提體系pH值為10.00，溫度40℃，料液比1∶6，酸沉pH值為4.90，此工藝條件下制備的芋艿分離蛋白得率為1.33±0.020%，純度為84.67±0.011%.

芋艿分離蛋白；制備；響應(yīng)面

芋艿分離蛋白是以芋艿地下球莖為原料提取的，蛋白質(zhì)含量≥90%以上.據(jù)報(bào)道［1］，芋艿球莖蛋白組分中有一種黏液蛋白，有解毒作用，可提高機(jī)體的免疫力.芋艿蛋白中必需氨基酸占氨基酸總量的百分比和化學(xué)評(píng)分值接近或超過(guò)酪蛋白［2］.王教飛［3］和孫啊敏等人［4］通過(guò)堿溶酸沉法制備芋艿分離蛋白，分別研究了不同pH值環(huán)境條件下芋艿分離蛋白的流變特性，以及金屬離子對(duì)芋艿分離蛋白功能性質(zhì)的影響.目前，有關(guān)芋艿分離蛋白提取、純化及工藝優(yōu)化方面的研究甚少，常銀子等［5］曾研究了酶法提取芋艿蛋白質(zhì)工藝，在最佳提取工藝下蛋白質(zhì)提取率為10.20%，除此之外，迄今為止尚無(wú)芋艿分離蛋白提取工藝優(yōu)化的研究報(bào)道.本文在前期實(shí)驗(yàn)室芋艿分離蛋白研究的基礎(chǔ)上，以芋艿分離蛋白得率和純度為響應(yīng)值，通過(guò)單因素試驗(yàn)，采用響應(yīng)面法設(shè)計(jì)優(yōu)化芋艿分離蛋白提取工藝，為芋艿蛋白質(zhì)商業(yè)化生產(chǎn)提供一定的依據(jù).

1 材料和方法

1.1 材料、試劑與設(shè)備

芋艿：產(chǎn)自常熟地區(qū)；氫氧化鈉、鹽酸等均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司.

LXY-II型離心沉淀機(jī)，上海醫(yī)用分析儀器廠；FE20實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)，梅特勒-托利多（上海）公司；Freezone 6冷凍干燥機(jī)，美國(guó)Labeonco公司.

1.2 方法

1.2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

優(yōu)化實(shí)驗(yàn)均以芋艿分離蛋白得率及純度為響應(yīng)值評(píng)價(jià)因素水平的優(yōu)劣.以浸提時(shí)的堿溶pH值、溫度、料液比及等電點(diǎn)沉淀蛋白時(shí)的酸沉pH值為優(yōu)化對(duì)象進(jìn)行優(yōu)化.如探討堿溶pH值的影響，可準(zhǔn)確稱取10 g芋艿干粉于100 mL燒杯中，加入60 mL，0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液（pH值分別為6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0，12.0），低速攪拌30 min，以10 000 r/min離心30 min，得上清液.調(diào)上清液pH值為5.0進(jìn)行酸沉，靜置30 min，以10 000 r/min離心30 min，得沉淀.將沉淀回調(diào)pH值至7.0，用分子量為3 000的透析袋流水透析24 h，然后用去離子水透析24 h，每4 h換一次水，將透析后樣品冷凍干燥得分離蛋白粉，稱重及純度分析.其他單因素實(shí)驗(yàn)（3次平行）分別設(shè)定溫度（25，30，35，40，45，50，55℃），料液比（1∶2，1∶4，1∶6，1∶8 m/v），酸沉pH值（1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0）.各水平重復(fù)3次.

蛋白質(zhì)純度即芋艿分離蛋白制品的蛋白含量，采用凱氏定氮法（N取6.25）測(cè)定.

1.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以溫度、堿溶pH值、料液比和酸沉pH值為關(guān)鍵工藝參數(shù)，設(shè)計(jì)四因素三水平Box–Behnken響應(yīng)面.根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素水平，以芋艿分離蛋白得率和純度為相應(yīng)指標(biāo)，共設(shè)計(jì)5個(gè)中心點(diǎn)和29個(gè)不同組合的實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)因素水平如表1所示.

1.2.3 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(guò)PASW statistics 18軟件進(jìn)行分析，ANOVA程序用于方差分析，當(dāng)P<0.05時(shí)認(rèn)為平均值間有顯著性差異.最小顯著差異法（LSD）用于數(shù)據(jù)多重比較分析.數(shù)據(jù)以3次獨(dú)立樣品測(cè)定結(jié)果的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示.

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的因素水平及編碼

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 堿溶pH值

研究表明，芋艿蛋白質(zhì)得率和純度主要受溫度、堿溶pH值、料液比、酸沉pH值等因素的影響［3-4］.堿溶pH值對(duì)芋艿分離蛋白提取率及純度影響見(jiàn)圖1.由圖1可知，pH值在6.0～12.0范圍內(nèi)，芋艿分離蛋白得率隨著pH值的升高而增加.本實(shí)驗(yàn)室前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，芋艿分離蛋白各組分的等電點(diǎn)pI主要集中在6.73和5.21兩個(gè)條帶，分別占分離蛋白總量的16.36%和27.30%.由于浸提pH值大于芋艿蛋白的等電點(diǎn)，在芋艿蛋白的浸提過(guò)程中隨著pH值的增加，蛋白質(zhì)自身帶負(fù)電荷，同種電荷的蛋白質(zhì)之間相互排斥、展開和解離，阻止了蛋白質(zhì)的聚集和沉淀，提高了它們的溶解度及得率.但是當(dāng)pH值超過(guò)10.0時(shí)，蛋白質(zhì)的得率變化不大，純度也降低，pH值過(guò)高會(huì)導(dǎo)致脫氨、脫羧及水解反應(yīng)，產(chǎn)生色澤和異味，影響產(chǎn)品品質(zhì)和功能特性［6-7］.綜合考慮，浸提體系的pH值宜選擇在10.0左右.

圖1 堿溶pH值對(duì)芋艿分離蛋白得率與純度的影響

圖2 酸沉pH值對(duì)芋艿分離蛋白得率與純度的影響

2.1.2 酸沉pH值

圖2為酸沉pH值對(duì)芋艿分離蛋白得率及純度的影響，可見(jiàn)pH值在4.0～6.0范圍內(nèi)，芋艿蛋白質(zhì)得率和純度較高.這是因?yàn)楫?dāng)pH值接近于芋艿蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時(shí)，芋艿蛋白因聚集而沉淀.當(dāng)pH值小于4.0或者大于6.0時(shí)，具有同種電荷的芋艿蛋白相互排斥、解離和展開，抑制了蛋白質(zhì)的聚結(jié)沉淀，使其溶解度增加，導(dǎo)致芋艿分離蛋白得率降低，純度下降.酸沉pH值降低會(huì)使終產(chǎn)品芋艿分離蛋白的鹽份增加，另外過(guò)低的pH值還將引發(fā)水解與脫酰胺化，產(chǎn)生色澤和異味，影響產(chǎn)品品質(zhì)和功能特性［6-7］.綜合考慮，酸沉pH值控制在5.0左右.

圖3 浸提溫度對(duì)芋艿分離蛋白得率與純度的影響

2.1.3 浸提溫度

溫度對(duì)芋艿分離蛋白提取得率及純度的影響結(jié)果見(jiàn)圖3.由圖3可知，在一定范圍內(nèi)，提取溫度的升高有助于蛋白質(zhì)溶解度的增加，從而提高蛋白質(zhì)得率.在25～35℃之間，隨著溫度的升高，芋艿分離蛋白質(zhì)的得率隨之提高，但提取溫度超過(guò)40℃時(shí)，蛋白質(zhì)得率下降.這是因?yàn)樯邷囟龋欣诘鞍踪|(zhì)的疏水相互作用，蛋白質(zhì)分子聚集，溶解度降低，蛋白質(zhì)得率下降［8］.溫度對(duì)純度的影響在25～30℃之間增加顯著，30℃后其純度無(wú)明顯變化.綜合考慮，浸提溫度宜控制在35℃左右.

2.1.4 料液比

圖4為料液比對(duì)芋艿分離蛋白得率與純度的影響.從圖4可以看出，料液比從1∶2增加到1∶4時(shí)，蛋白質(zhì)得率提高了6.37%；料液比從1∶4增加到1∶6時(shí)，蛋白質(zhì)得率提高了8.52%.但當(dāng)料液比再繼續(xù)增大時(shí)，蛋白質(zhì)得率增加很小.料液比從1∶2到1∶4之間，蛋白質(zhì)純度增加，但料液比繼續(xù)增加純度沒(méi)有明顯變化.因此要提高芋艿分離蛋白得率和純度，減少浸提過(guò)程中的乳清排放，料液比宜控制在1∶6左右.

圖4 料液比對(duì)芋艿分離蛋白得率與純度的影響

2.2 響應(yīng)曲面法優(yōu)化提取工藝條件

2.2.1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)值

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，綜合相關(guān)分析，確定以浸提溫度、料液比、堿溶pH值和酸沉pH值為自變量，以芋艿分離蛋白得率和純度為響應(yīng)值，進(jìn)行四因素三水平Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1.在29個(gè)試驗(yàn)組合條件下，試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及數(shù)據(jù)處理結(jié)果如表2所示.

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及其響應(yīng)值

接表2

2.2.2 模型的建立及顯著性分析

基于參數(shù)評(píng)估，運(yùn)用Design-Expert V 6.0軟件可得出響應(yīng)值和被檢變量之間的邏輯關(guān)系.對(duì)這些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，獲得編碼應(yīng)變量（芋艿蛋白得率Y1和純度Y2）對(duì)編碼自變量的關(guān)系為：

為檢驗(yàn)方程有效性，利用分析軟件進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行分析，其中芋艿分離蛋白得率和純度的系數(shù)顯著性結(jié)果見(jiàn)表3，多元回歸模型的方差分析結(jié)果見(jiàn)表4.

由表3可知，方程的一次項(xiàng)中X1，X3，交互項(xiàng)X1X4和二次項(xiàng)中X22，X32，X42對(duì)響應(yīng)值Y1（芋艿分離蛋白得率）的影響極顯著（P<0.01），一次項(xiàng)中X2，X4，交互項(xiàng)X2X3對(duì)響應(yīng)值Y1的影響顯著（P<0.05）.交互項(xiàng)X1X2，X1X3，X2X4，X3X4和二次項(xiàng)X12對(duì)響應(yīng)值Y1影響不顯著（P>0.05）.而方程的一次項(xiàng)中X2和二次項(xiàng)中X12對(duì)響應(yīng)值Y2（芋艿分離蛋白純度）的影響極顯著（P<0.01），一次項(xiàng)X1，X3，交互項(xiàng)X1X2和二次項(xiàng)中X22，對(duì)響應(yīng)值Y2的影響顯著（P<0.05）.一次項(xiàng)X4，交互項(xiàng)X1X3，X1X4，X2X4，X2X3，X3X4和二次項(xiàng)X32，X42對(duì)響應(yīng)值Y2的影響不顯著（P>0.05）.可見(jiàn)，各試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值Y1和Y2的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系.

表3 芋艿分離蛋白得率和純度擬合多元二次方程模型的方差分析

由表4可知，經(jīng)顯著性檢驗(yàn)，回歸模型高度顯著，響應(yīng)值Y1和Y2的相關(guān)系數(shù)R2分別為0.944 7和0.936 1，說(shuō)明模型的擬合度好，表明芋艿分離蛋白得率和純度的實(shí)驗(yàn)值和預(yù)測(cè)值有極高的一致性；校正決定系數(shù)adj-R2分別為0.889 3和0.8722，說(shuō)明芋艿分離蛋白得率和純度模型分別能夠解釋88.93%和87.22%，僅分別有11.07%和12.78%不能用這兩個(gè)回歸模型表示.本試驗(yàn)中Y1和Y2模型失擬項(xiàng)的P值分別為0.256 5和0.7001都大于0.05，模型失擬項(xiàng)不顯著，進(jìn)一步說(shuō)明此模型的擬合度良好.變異系數(shù)（CV%）表示試驗(yàn)的精確度，數(shù)值越大，表明試驗(yàn)的可靠性越差［9］，本試驗(yàn)中Y1和Y2模型的CV%值分別為4.78%和4.83%，說(shuō)明模型方程能夠較好地反映真實(shí)值.綜上所述，回歸模型擬合程度良好，實(shí)驗(yàn)誤差小，能夠準(zhǔn)確地分析和預(yù)測(cè)芋艿分離蛋白的得率和純度.可用回歸線性方程替代實(shí)驗(yàn)對(duì)結(jié)果進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析.

2.2.3 響應(yīng)面交互作用分析

表4 多元回歸模型方差分析表

運(yùn)用Design-Expert軟件所獲得的三維響應(yīng)曲面圖如圖5和圖6所示.通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在提取過(guò)程中參數(shù)變化對(duì)芋艿分離蛋白得率和純度會(huì)產(chǎn)生不同的影響.圖5和圖6中顯示溫度和料液比對(duì)芋艿分離蛋白得率（Y1）影響的交互作用不明顯，對(duì)純度（Y2）交互作用也不顯著；料液比和堿溶pH值對(duì)芋艿分離蛋白得率（Y1）存在交互作用，隨著料液比和堿溶pH值的增加，芋艿分離蛋白的得率逐漸升高，但當(dāng)提取料液比和堿溶pH值增加到一定值后，芋艿分離蛋白的得率卻隨著提取料液比和堿溶pH值的增加而降低.但料液比和堿溶pH值對(duì)Y2的相應(yīng)曲面圖的影響則較為平緩，說(shuō)明料液比和堿溶pH值對(duì)Y2交互作用不顯著.同理，由圖可以看出，堿溶pH值和酸沉pH值、料液比和酸沉pH值對(duì)Y1的相應(yīng)曲面圖坡度陡峭，等高線排列緊密且趨于橢圓形，表明提取料液比與酸沉pH值、堿溶pH值與酸沉pH值對(duì)芋艿分離蛋白得率的交互影響相對(duì)較大，而溫度與酸沉pH值、溫度與堿溶pH值對(duì)Y1的響應(yīng)曲面和溫度與酸沉pH值、溫度與堿溶pH值、料液比與酸沉pH值、堿溶pH值與酸沉pH值對(duì)Y2的相應(yīng)曲面圖坡度相對(duì)平緩，等高線排列稀疏，表明溫度與堿溶pH值、溫度與酸沉pH值對(duì)芋艿分離蛋白得率，以及提取溫度與酸沉pH值、溫度與堿溶pH值、料液比與酸沉pH值、堿溶pH值與酸沉pH值對(duì)芋艿分離蛋白純度的交互影響相對(duì)較弱.

2.2.4 提取參數(shù)優(yōu)化及模型驗(yàn)證

圖5 提取條件對(duì)芋艿分離蛋白得率影響的響應(yīng)曲面圖

圖6 提取條件對(duì)芋艿分離蛋白純度影響的響應(yīng)曲面圖

通過(guò)最優(yōu)化分析，得到被檢變量的最優(yōu)值，即浸提溫度為40℃、料液比為1∶5.84、堿溶pH值為10.05、酸沉pH值為4.92，是模型最優(yōu)提取工藝.此條件下，芋艿蛋白得率為1.36%，純度為85.23%.考慮到操作的局限性，最優(yōu)提取參數(shù)調(diào)整為提取溫度40℃、料液比1∶6、堿溶pH值10.00、酸沉pH值4.90.在此條件下提取芋艿分離蛋白，3次平行試驗(yàn)得出芋艿分離蛋白實(shí)際得率為1.33±0.020%，實(shí)際純度為84.67±0.011%，與理論值非常接近，證實(shí)了該方程的準(zhǔn)確性和實(shí)用性.因此，該多元二次回歸方程能夠準(zhǔn)確且適合于對(duì)芋艿分離蛋白得率和純度的預(yù)測(cè).與常銀子等［5］酶法提取芋艿蛋白質(zhì)工藝相比，堿溶酸沉法結(jié)合響應(yīng)面優(yōu)化工藝使蛋白得率提高了1.5倍.

2.2.5 優(yōu)化后的芋艿分離蛋白制備工藝流程見(jiàn)圖7.

圖7 優(yōu)化后的芋艿分離蛋白制備工藝流程

3 結(jié)論

以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，首次采用響應(yīng)面法建立了芋艿分離蛋白提取工藝參數(shù)的二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型，通過(guò)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)所得實(shí)際值接近模型預(yù)測(cè)值，能較好地預(yù)測(cè)芋艿蛋白的得率與純度.該模型分析認(rèn)為芋艿分離蛋白的最佳提取工藝條件為：提取溫度40℃、料液比1∶6、堿溶pH值10.00、酸沉pH值4.90.經(jīng)3次重復(fù)試驗(yàn)，證明應(yīng)用響應(yīng)面優(yōu)化法提取芋艿分離蛋白是準(zhǔn)確可行的，回歸模型具有良好的預(yù)測(cè)性，能用于指導(dǎo)芋艿分離蛋白的提取，為芋艿蛋白質(zhì)商業(yè)化生產(chǎn)提供一定的依據(jù).

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Preparation and Process Condition Optimization of Taro Protein Isolates

HUANG Youru,WANG Jiaofei,LI Xinbei,XU Tiantian
(School of Biology and Food Engineering,Changshu Institute of Technology,Changshu 215500,China)

Based on single factor tests,the optimum preparation conditions of taro protein isolates were obtained through Box-Benhnken central combination design and RSM.The results showed that the optimum preparation conditions of taro protein isolates were as follows:extraction pH was 10.00,extraction temperature was 40℃, the ratio of material to solvent was 1∶6,and acid precipitation pH was 4.90.Under such conditions,the yield of taro protein isolates was 1.33±0.020%,and the purity was 84.67±0.011%.

taro protein isolates;preparation;response surface methodology

TS201.2+1；TQ645.9+9

A

1008-2794（2017）02-0097-07

2016-03-11

“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國(guó)家科技計(jì)劃項(xiàng)目“大宗低值蛋白增值加工關(guān)鍵技術(shù)研究與示范”（2012BAD34B04-1）；“高生物利用度蛋白制備關(guān)鍵技術(shù)研究與開發(fā)”（2013AA102203-03）

黃友如，副教授，博士，研究方向：糧食、油脂及植物蛋白工程，E-mail:huangyouru@aliyun.com.