環(huán)境因子對(duì)三峽庫區(qū)銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa)群體形成影響及其形態(tài)特征*

安 強(qiáng),李雪琴,王 沙,黃曉龍,蔣韻秋

(重慶大學(xué)三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400045)

環(huán)境因子對(duì)三峽庫區(qū)銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa)群體形成影響及其形態(tài)特征*

安 強(qiáng),李雪琴,王 沙,黃曉龍,蔣韻秋

(重慶大學(xué)三峽庫區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400045)

為揭示微囊藻群體形成機(jī)理，為有效防治水華暴發(fā)提供依據(jù)，以三峽庫區(qū)銅綠微囊藻(Microcystisaeruginosa)為研究對(duì)象，研究N、P濃度，Ca2+濃度，光強(qiáng)，溫度對(duì)銅綠微囊藻生長、胞外多糖(EPS)合成和群體微囊藻形成的影響，并對(duì)比分析了單細(xì)胞和群體微囊藻的形態(tài)特征. 研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)N≤100 mg/L、P≤5 mg/L時(shí)，銅綠微囊藻生物量和EPS合成量隨著N、P濃度增加而增加；適宜濃度的Ca2+(65 mg/L)有利于藻生長，EPS產(chǎn)量隨著Ca2+濃度增加而降低，過高濃度的Ca2+在刺激微囊藻細(xì)胞分泌EPS的同時(shí)可能會(huì)促進(jìn)其溶解， Ca2+和EPS均對(duì)微囊藻群體形成起橋架粘結(jié)作用；光照和溫度對(duì)EPS合成有一定促進(jìn)作用，且其促進(jìn)效果均高于N、P和Ca2+作用，20℃是同時(shí)滿足微囊藻生長及EPS合成的最有利條件. 群體細(xì)胞比單細(xì)胞周圍的膠質(zhì)鞘更加明顯和清晰，多糖膠鞘表面有許多Ca2+晶體，從微觀角度可以確定Ca2+在EPS合成及群體形成中起著重要作用.

三峽庫區(qū)； 環(huán)境因子；銅綠微囊藻； 形態(tài)特征

水華暴發(fā)是水體富營養(yǎng)化常見特征之一，三峽水庫蓄水后，水動(dòng)力條件時(shí)常改變，營養(yǎng)鹽不斷積累，導(dǎo)致庫區(qū)部分支流庫灣水華現(xiàn)象嚴(yán)重[1]，銅綠微囊藻是三峽庫區(qū)藍(lán)藻水華暴發(fā)常見的優(yōu)勢(shì)藻種之一，藻群體的形成和增長是水華暴發(fā)的前提，銅綠微囊藻在適宜環(huán)境下，大量增殖形成群體上浮于水面，并分泌微囊藻毒素，嚴(yán)重破壞水域生態(tài)系統(tǒng)，直接影響工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及生活用水的供水水質(zhì)，從而對(duì)人類健康產(chǎn)生極大危害[2-3]. 影響藻群體形成的非生物因子主要有營養(yǎng)鹽、光強(qiáng)、溫度、pH以及金屬離子等[4-5]，Cu2+、Fe3+、Zn2+和Pb2+等已有相關(guān)報(bào)道[4, 6-7]，Sharma等[8]研究證實(shí)金屬離子可顯著促進(jìn)藻細(xì)胞分泌胞外多糖(EPS)，Wang等[9]發(fā)現(xiàn)一定濃度的Ca2+能促進(jìn)微囊藻多糖的合成并有利于藻群體形成，從而可知金屬離子在微囊藻群體形成中起著非常重要的作用，但將金屬離子與其他環(huán)境因子進(jìn)行對(duì)比分析少有報(bào)道. 國內(nèi)外學(xué)者已對(duì)銅綠微囊藻的生長及生理特性等進(jìn)行了多方面研究，但單細(xì)胞狀態(tài)的微囊藻怎樣集結(jié)聚集形成群體尚無明確定論[10]. 部分研究發(fā)現(xiàn)微囊藻水華形成過程中，往往伴隨著EPS合成， Wallace[11]發(fā)現(xiàn)EPS能調(diào)節(jié)微囊藻垂直移動(dòng)，目前對(duì)EPS的研究主要集中在提取和結(jié)構(gòu)分類上，對(duì)于環(huán)境因子如何影響其合成，其與藻群體形成的具體關(guān)系的研究甚少.

不同水域理化性質(zhì)、生物背景不一，導(dǎo)致水華暴發(fā)的環(huán)境因素和生態(tài)機(jī)制也有差異. 為進(jìn)一步探究三峽水庫成庫后支流回水區(qū)富營養(yǎng)化問題，本實(shí)驗(yàn)以三峽庫區(qū)小江流域回水區(qū)銅綠微囊藻為研究對(duì)象，在環(huán)境因子(N、P濃度，Ca2+濃度，光照強(qiáng)度，溫度)對(duì)其生長影響分析的基礎(chǔ)之上，與環(huán)境因子對(duì)EPS合成影響分析相結(jié)合，揭示不同環(huán)境條件下EPS對(duì)銅綠微囊藻群體形成的作用. 并對(duì)前期實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)成熟的銅綠微囊藻群體和純培養(yǎng)的單細(xì)胞作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)材料，在激光共聚焦顯微鏡和掃描電子顯微鏡下觀察了兩組實(shí)驗(yàn)材料中細(xì)胞的存在狀態(tài)及Ca2+和EPS分布情況，以期更深入了解微囊藻水華的發(fā)生過程與Ca2+和EPS分布之間的關(guān)系，并從微觀角度解釋銅綠微囊藻群體的形成過程，為闡明銅綠微囊藻水華的形成機(jī)理提供相關(guān)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)藻種 在三峽庫區(qū)小江流域回水區(qū)采集浮游藻類，現(xiàn)場(chǎng)用甲醛固定，經(jīng)顯微鏡觀察、鑒定，進(jìn)行短期預(yù)培養(yǎng)、稀釋法結(jié)合平板分離法以及滅菌等步驟[12]得到純化的實(shí)驗(yàn)藻種銅綠微囊藻(M.aeruginosa)，并采用BG-11培養(yǎng)液對(duì)藻進(jìn)行馴化和擴(kuò)大培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長期的藻進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn).

1.1.2 實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)液 BG-11培養(yǎng)液[13]：NaNO31.5 g/L，K2HPO40.04 g/L，MgSO4·7H2O 0.075 g/L，CaCl2·2H2O 0.036 g/L，C6H8O70.006 g/L，F(xiàn)eC6H5O7·NH4OH 0.006 g/L， EDTANa20.001 g/L，Na2CO30.02 g/L，H3BO32.86 g/L，MnCl2·4H2O 1.81 g/L，ZnSO4·7H2O 0.222 g/L，CuSO4·5H2O 0.079 g/L，Na2MoO4·2H2O 0.39 g/L， Co(NO3)2·6H2O 0.049 g/L. 培養(yǎng)基液pH調(diào)至7.5，并經(jīng)高壓滅菌(121℃，105 kPa，30 min).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

本實(shí)驗(yàn)采用單因素分析方法，在500 ml三角瓶中加入300 ml 經(jīng)過滅菌消毒的BG-11培養(yǎng)液，銅綠微囊藻的初始接種量為3.0×106cells/ml，探討N、P濃度；Ca2+濃度；光強(qiáng)；溫度對(duì)銅綠微囊藻生長、EPS合成及藻群體形成的影響. 以三峽庫區(qū)小江流域環(huán)境背景值及相關(guān)研究[14-18]為參考，N、P濃度設(shè)置梯度:N=1 mg/L、P=0.05 mg/L(NP1組)；N=5 mg/L、P=0.25 mg/L(NP2組)；N=10 mg/L、P=0.5 mg/L(NP3組)；N=50 mg/L、P=2.5 mg/L(NP4組)；N=100 mg/L、P=5 mg/L(NP5組)；其余因子光強(qiáng)2000 lux，光暗比12 h∶12 h，溫度25℃. Ca2+濃度梯度為0.13、13、65、130和260 mg/L(Ca2+1組～ Ca2+5組)；其余因子光強(qiáng)2000 lux，光暗比12 h∶12 h，溫度25℃. 銅綠微囊藻在光強(qiáng)梯度設(shè)置為1000、2000、4000、8000和12000 lux的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，光源為白熾燈，光暗比12 h∶12 h，溫度25℃. 溫度梯度設(shè)置為15、20、25、30和35℃，光強(qiáng)2000 lux，光暗比12 h∶12 h. 每項(xiàng)因子的每個(gè)水平分別做3個(gè)平行，自接種當(dāng)日起每天定時(shí)搖動(dòng)3次，分別間隔3 d在同一時(shí)間取樣測(cè)定藻密度及EPS含量.

1.3 分析方法

1.3.1 藻細(xì)胞計(jì)數(shù) 細(xì)胞計(jì)數(shù)采用血球計(jì)數(shù)板法，計(jì)數(shù)板規(guī)格選用25×16，根據(jù)對(duì)角線法依次對(duì)5個(gè)大格的藻細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù). 藻細(xì)胞密度(106cells/ml)=5×(N1+N2+N3+N4+N5)×10-2×B，式中：N1～N5指5個(gè)大格中的藻細(xì)胞數(shù)，B指稀釋倍數(shù).

1.3.2 EPS測(cè)定分析 EPS的提取及測(cè)定采用Del Gallo 等[19]經(jīng)過修改和量化的蒽酮-硫酸法. 取藻液10 ml，調(diào)節(jié)pH至10，搖勻后置于恒溫水浴震蕩器中，45℃震蕩4 h(60 轉(zhuǎn)/min)，于10500 轉(zhuǎn)/min離心15 min使藻液分離，將上清液以0.45 μm膜過濾后用于測(cè)定EPS濃度.

1.3.3 銅綠微囊藻形態(tài)特征分析 將純培養(yǎng)的單細(xì)胞微囊藻和三峽庫區(qū)小江流域回水區(qū)分離提純并擴(kuò)大培養(yǎng)的銅綠微囊藻群體，以BG-11培養(yǎng)液，光照為1000 lux，室溫(25℃)條件培養(yǎng)成熟后，分別制成玻片，在激光共聚焦顯微鏡和掃描電子顯微鏡下觀察其形態(tài)，根據(jù)文獻(xiàn)[20-21]，激光共聚焦顯微鏡觀察需對(duì)EPS和Ca2+進(jìn)行熒光標(biāo)記，EPS的熒光標(biāo)記方法[22]:取一小滴用蒸餾水沖洗過的藻液滴在洗凈的載玻片上，并滴加適量的Calcofluor White Stain(美國Sigma多聚糖熒光染料)和1滴10%的KOH溶液，放置1 min. Ca2+的熒光標(biāo)記方法:取一小滴藻液于載玻片上，并滴加適量2 μmol/L的 Fluo-3, pentasodium salt稀釋液(美國AAT Bioquest Inc. 胞外Ca2+熒光探針)，然后在37℃下恒溫孵育1 h.

2 結(jié)果與討論

2.1 環(huán)境因子對(duì)銅綠微囊藻生長的影響

當(dāng)N、P濃度較低(N≤5 mg/L、P≤0.25 mg/L)時(shí)，在前9 d，銅綠微囊藻保持指數(shù)增長，9 d后，銅綠微囊藻生長無顯著變化(P>0.05)(圖1a)；這與許海等[23]研究銅綠微囊藻對(duì)氮、磷饑餓耐受能力結(jié)果相符. 當(dāng)初始N、P濃度相對(duì)較高(N≥10 mg/L、P≥0.5 mg/L)時(shí)，銅綠微囊藻隨著培養(yǎng)時(shí)間的推移逐漸增長，在前24 d，不同N、P濃度梯度間，藻細(xì)胞密度無顯著性差異(P>0.05)，這與羅東等[24]的研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)P≥0.5 mg/L時(shí)，不同P濃度條件下的藻增長速度基本相近的結(jié)果一致. 培養(yǎng)后期， N、P逐漸被藻生長利用從而濃度降低，高濃度N、P逐漸降低到最優(yōu)值進(jìn)一步利于藻類生長，故當(dāng)N=10 mg/L、P=0.5 mg/L時(shí)，就能使銅綠微囊藻呈優(yōu)勢(shì)增長.

在5組不同的Ca2+濃度水平下，銅綠微囊藻均呈一定趨勢(shì)增長，且當(dāng)Ca2+=65 mg/L時(shí)，銅綠微囊藻的生長量最大且增長速率最突出，隨著Ca2+濃度繼續(xù)增加，銅綠微囊藻的生長量和增長速率反而減??；低濃度Ca2+(<65 mg/L)比高濃度Ca2+(>65 mg/L)條件下的藻生長量及增長速率大但差異并不顯著(P>0.05)(圖1b). 適宜濃度的Ca2+有利于藻生長，濃度過高(>65 mg/L)則會(huì)一定程度抑制藻細(xì)胞增殖，這與郭麗麗等[17]及Shi等[25]研究中Ca2+對(duì)微囊藻生長的影響結(jié)論相近. 其可能的原因是Ca2+是藻生長所需離子，適宜濃度的Ca2+有利于藻細(xì)胞壁的構(gòu)成，對(duì)藻細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)起穩(wěn)定作用，從而利于藻生長；濃度過高的Ca2+可能會(huì)抑制藻體內(nèi)一些保護(hù)酶的活性，從而不利于藻生長[26].

圖1 不同初始N、P濃度(a)、Ca2+濃度(b)、光強(qiáng)(c)和溫度(d)條件下銅綠微囊藻生長情況

在培養(yǎng)期的前15 d，不同光照強(qiáng)度下的藻生長無顯著差異(P>0.05)，在高光照強(qiáng)度(12000 lux)下的藻生長量相對(duì)較低，表現(xiàn)出光抑制(圖1c). 培養(yǎng)后期(>15 d)，當(dāng)光照強(qiáng)度為1000 lux時(shí)，銅綠微囊藻呈現(xiàn)最優(yōu)生長，這與劉世明等[27]總結(jié)較低的光強(qiáng)有利于銅綠微囊藻生長結(jié)論一致. 整個(gè)培養(yǎng)期間，不同光強(qiáng)下的藻生長均存在波動(dòng)，光照周期一定(12 h)時(shí)，光強(qiáng)在一定范圍(2000～4000 lux)內(nèi)變化對(duì)銅綠微囊藻生長影響無明顯差異(P>0.05)，推測(cè)銅綠微囊藻對(duì)高光照強(qiáng)度的耐受能力較強(qiáng).

溫度分別為15、25和35℃時(shí)，對(duì)銅綠微囊藻類生長的影響差異較明顯(P<0.05)，當(dāng)溫度較低(15℃)和較高(35℃)時(shí)，銅綠微囊藻的生長趨勢(shì)均較緩，且在培養(yǎng)后期藻生長有略微下降(圖1d). 其可能原因是低溫條件下微囊藻胞內(nèi)酶活性較低，生長受到抑制，溫度過高則出現(xiàn)高溫脅迫現(xiàn)象. 付保榮等[28]研究表明,銅綠微囊藻的最佳生長溫度在25℃以上，本研究表明30℃是銅綠微囊藻生長最佳溫度，其生長量高達(dá) 3.15×107cells/ml；培養(yǎng)初期，銅綠微囊藻在飽和溫度范圍內(nèi)呈線性增長，在培養(yǎng)后期(第24 d)達(dá)到生長飽和.

2.2 環(huán)境因子對(duì)銅綠微囊藻EPS合成的影響

不同環(huán)境因子條件下，銅綠微囊藻EPS合成情況可知，銅綠微囊藻EPS合成隨著N、P濃度的增加而增加(圖2a). 低N、P濃度(N≤10 mg/L、P≤0.5 mg/L)抑制銅綠微囊藻EPS合成，N、P濃度越低EPS合成量越低;高N、P濃度(N≥50 mg/L、P≥2.5 mg/L)促進(jìn)EPS合成. 一些研究表明N、P濃度缺乏能刺激藍(lán)桿藻(Cyanothece)[29]、筒柱藻(Cylindrotheca)[30]等藻類的EPS合成，本研究表明N、P濃度對(duì)微囊藻的影響與上述藻類不同，而與雷臘梅等[31]研究營養(yǎng)條件對(duì)銅綠微囊藻胞外多糖產(chǎn)生影響的結(jié)果一致.其可能的原因是銅綠微囊藻在N、P豐富條件下的碳固定效率較高，故營養(yǎng)條件對(duì)不同藻類EPS合成影響不同. 與圖1a對(duì)比可知，N、P濃度對(duì)銅綠微囊藻EPS的合成與藻生長的影響具有一致性，高濃度的N、P為銅綠微囊藻提供了豐富的營養(yǎng)鹽，在一定程度上有利于微囊藻生長，并利于EPS的合成和分泌，故調(diào)節(jié)N、P濃度是控制微囊藻生物量增長的有效途徑.

低濃度Ca2+(0.13 mg/L)與高濃度Ca2+(260 mg/L)相比對(duì)EPS合成影響有顯著差異(P<0.05)，0.13 mg/L Ca2+條件下EPS合成量最大能達(dá)到77 μg/ml，而其他3組處理對(duì)EPS合成影響無顯著差異(P>0.05)(圖2b). 與圖1b對(duì)比可知，0.13 mg/L Ca2+不是最有利于微囊藻生長的條件，但仍對(duì)藻生長有一定促進(jìn)作用，即微量的Ca2+就能同時(shí)滿足微囊藻的生長及EPS合成. Ca2+濃度過高(260 mg/L)，微囊藻生長受到抑制，EPS濃度同樣較低，其可能的原因是Ca2+不僅會(huì)影響藻細(xì)胞膜的通透性，從而影響EPS向細(xì)胞外分泌的過程，過高濃度的Ca2+還會(huì)在刺激微囊藻細(xì)胞分泌EPS的同時(shí)會(huì)促進(jìn)其溶解[17].

光強(qiáng)對(duì)藻類EPS合成的影響少有報(bào)道. 光照對(duì)銅綠微囊藻EPS合成有一定促進(jìn)作用，且其促進(jìn)效果高于N、P和Ca2+的作用(R光照>RCa2+>RN、P，其中R值代表顯著水平的高低)(圖2c)，說明微囊藻的EPS合成和釋放依賴光照. 在前21 d，不同光照處理對(duì)銅綠微囊藻EPS合成影響無明顯差異(P>0.05)；不同光照強(qiáng)度下EPS合成呈先增后降再增再降的不穩(wěn)定變化趨勢(shì)，2000～4000 lux條件有利于EPS合成,在第9～18 d表現(xiàn)最為突出，在第27 d 1000 lux條件下EPS合成量出現(xiàn)峰值114 μg/ml，對(duì)應(yīng)圖1c,此時(shí)的微囊藻同樣處于優(yōu)勢(shì)生長. 整個(gè)培養(yǎng)周期來看，在第15和30 d， EPS合成量均有回落現(xiàn)象，這可能是微囊藻群體形成過程中EPS被利用的結(jié)果.

適宜的溫度能夠促進(jìn)銅綠微囊藻EPS的合成，其促進(jìn)效果同樣高于N、P和Ca2+的作用(R溫度>RCa2+>RN、P)，EPS的合成量隨著溫度的升高呈先增加后降低的趨勢(shì)，20℃時(shí)其合成量最大， 25℃次之，35℃條件下最低，與施軍瓊等[32]的研究結(jié)論相似(圖2d). 結(jié)合圖1d，微囊藻在20℃時(shí)也能較好地增長，20℃是微囊藻生長及EPS合成相對(duì)最有利的條件.

綜合圖2分析，環(huán)境因子對(duì)銅綠微囊藻EPS合成的影響大小主要表現(xiàn)為光照>溫度> Ca2+>N、P，進(jìn)一步表明季節(jié)性變化對(duì)藻群體聚集有重要影響.

圖2 不同初始N、P濃度(a)、Ca2+濃度(b)、光強(qiáng)(c)和溫度(d)條件下銅綠微囊藻EPS的合成情況

2.3 環(huán)境因子對(duì)銅綠微囊藻群體形成的影響

2.3.1 N、P濃度對(duì)銅綠微囊藻群體形成的影響 不同N、P濃度條件下，銅綠微囊藻藻群體形成情況可知，細(xì)胞個(gè)數(shù)為3～10的銅綠微囊藻群體比重最大，即在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的微囊藻以細(xì)胞數(shù)較小的群體形態(tài)為主(圖3). 在前12 d，N=50 mg/L、P=2.5 mg/L(NP4組)條件下形成的藻群體最大；在18 d后N=100 mg/L、P=5 mg/L(NP5組)條件下形成的藻群體最大，其可能原因是隨著時(shí)間的推移，初始高濃度的N、P被消耗后逐漸降低，從而利于群體形成，這與培養(yǎng)前期在適中濃度(NP4組)條件下群體形成最大的結(jié)果一致. 即初始N、P濃度較低和較高均不利于藻群體形成，高N、P濃度比低N、P濃度條件下群體形態(tài)的藻細(xì)胞所占比例高，N=50 mg/L、P=2.5 mg/L是藻群體形成的最佳條件，此時(shí)EPS的合成量也較大，故進(jìn)一步驗(yàn)證具有黏性的EPS有助于藻群體的進(jìn)一步形成. 大的微囊藻群體只在部分時(shí)間段出現(xiàn)，第6 d和第15 d是銅綠微囊藻群體形成的集中時(shí)間段，其中N=10 mg/L、P=0.5 mg/L(NP3組)條件對(duì)細(xì)胞數(shù)10～100的藻群體最有利，而細(xì)胞數(shù)>100的藻群體在高初始N、P濃度(NP5組)條件下較易形成，表明銅綠微囊藻藻群體大小隨著營養(yǎng)鹽濃度的升高而增大，即降低N、P濃度在一定程度上能夠控制藻群體增長.

圖3 不同初始N、P濃度條件下銅綠微囊藻群體形成情況

2.3.2 Ca2+濃度對(duì)銅綠微囊藻群體形成的影響 不同Ca2+濃度條件下，銅綠微囊藻藻群體形成情況表明,整個(gè)培養(yǎng)期間細(xì)胞數(shù)>100的藻群體只在第9 d 260 mg/L(Ca2+5組)條件下出現(xiàn)，且密度極小，相比N、P濃度條件下，形成的藻群體密度成倍增長，且Ca2+對(duì)藻群體形成的影響比N、P要顯著(P<0.05). 培養(yǎng)前15 d，銅綠微囊藻在130 mg/L Ca2+濃度下(Ca2+4組)形成的群體最大，其次是高濃度260 mg/L Ca2+濃度下(Ca2+5組)條件下，結(jié)合圖1b和圖2b，此條件均不是藻生長及EPS合成的最佳值.其可能的原因是，當(dāng)藻形成群體時(shí)更容易適應(yīng)外界惡劣的環(huán)境，以及Ca2+在微囊藻群體形成的過程中起橋架作用[9]；15 d后，適中Ca2+濃度下(65 mg/L,Ca2+3組)形成的藻群體最大，此時(shí)藻生長量同樣處于優(yōu)勢(shì)，進(jìn)一步表明藻群體的形成是藻生長及聚集的一個(gè)過程. 在整個(gè)培養(yǎng)期間，低Ca2+濃度條件下的藻群體形成密度較小且穩(wěn)定；高Ca2+濃度條件下，藻群體密度在3.0×105cells/ml范圍內(nèi)波動(dòng). 細(xì)胞數(shù)為10～100和>100的藻群體均在培養(yǎng)前段時(shí)間(12 d前)集中形成，且均易在較高Ca2+濃度條件下聚集，可進(jìn)一步推測(cè)Ca2+對(duì)銅綠微囊藻群體聚集的影響大于EPS對(duì)藻群體的粘結(jié)作用(圖4).

圖4 不同初始Ca2+濃度條件下銅綠微囊藻群體形成情況

2.3.3 光強(qiáng)對(duì)銅綠微囊藻群體形成的影響 低光照強(qiáng)度不利于藻群體形成，在培養(yǎng)前期，藻群體形成密度很小，光照強(qiáng)度的影響并不明顯(P>0.05);在培養(yǎng)后期，高光照強(qiáng)度條件下，藻群體密度急劇增加，其可能的原因是藻群體形成對(duì)光照的接收需要一定時(shí)間(圖5)，這與李小龍等[33]的研究發(fā)現(xiàn)銅綠微囊藻能抗強(qiáng)光傷害結(jié)論一致. 調(diào)節(jié)光強(qiáng)對(duì)細(xì)胞數(shù)較大的藻群體形成無明顯促進(jìn)作用，培養(yǎng)過程中細(xì)胞個(gè)數(shù)為10～100的藻群體只在培養(yǎng)后期的高光照強(qiáng)度(8000 lux)條件下檢測(cè)到，其數(shù)量并不多，此條件下的EPS合成量較高，對(duì)藻群體形成有一定促進(jìn)作用，而細(xì)胞個(gè)數(shù)>100的藻群體并未檢測(cè)到. 故高光照強(qiáng)度對(duì)銅綠微囊藻群體的形成相對(duì)有利，因此，適當(dāng)調(diào)節(jié)光照強(qiáng)度能有效控制藻群體形成. 對(duì)比圖3可知，不同光照條件下的藻群體密度比不同N、P濃度條件下的藻群體數(shù)大，N、P濃度下的藻群體增長主要在培養(yǎng)前期，而光照條件下的藻群體形成主要在培養(yǎng)后期，即微囊藻在只滿足光照條件時(shí)需要長時(shí)間才能實(shí)現(xiàn)生物量的積累和增長.

圖5 不同光強(qiáng)條件下銅綠微囊藻群體形成情況

2.3.4 溫度對(duì)銅綠微囊藻群體形成的影響 不同溫度條件下的藻群體形成大小低于控制Ca2+和光強(qiáng)條件下形成的藻群體大小，但在培養(yǎng)過程中有細(xì)胞數(shù)>100的藻群體形成(圖6). 結(jié)合圖3，控制N、P濃度條件下總的藻群體形成密度也較小，但會(huì)有>100的藻群體出現(xiàn)，這可能是不同N、P濃度和溫度條件下總的藻群體密度較低的原因之一. 25℃是能形成大群體的最佳溫度，結(jié)合圖1d和圖2d，30℃最有利于單細(xì)胞藻生長，同樣在培養(yǎng)后期有利于細(xì)胞數(shù)為3～10的藻群體形成，20℃最有利于EPS合成，但此條件并非藻群體形成的最優(yōu)溫度，故溫度和EPS濃度對(duì)藻群體形成是獨(dú)立又相互影響的因子. 低溫(15℃)在培養(yǎng)后期對(duì)小群體藻形成較有利，高溫對(duì)藻群體密度的影響表現(xiàn)為先下降然后又回升的趨勢(shì)，進(jìn)一步表明銅綠微囊藻適應(yīng)的溫度范圍寬，對(duì)高溫具有良好的適應(yīng)性.

圖6 不同溫度條件下銅綠微囊藻群體形成情況

2.4 銅綠微囊藻形態(tài)特征分析

2.4.1 激光共聚焦顯微鏡下群體微囊藻的形態(tài)特征 圖7為激光共聚焦顯微鏡下群體微囊藻的形態(tài)，其中A表示過渡態(tài)，B表示分裂態(tài)，從A到B可看出，藻細(xì)胞逐漸變大和變多，有逐漸聚集集中的趨勢(shì)，即分裂態(tài)的微囊藻群體比過渡態(tài)的微囊藻群體龐大，結(jié)合更為緊密，細(xì)胞密集區(qū)處于群體結(jié)構(gòu)的中心部位. 進(jìn)一步證明銅綠微囊藻形成群體的方式之一是通過分裂增殖累計(jì)細(xì)胞數(shù)目形成，劉光濤[10]的研究也證實(shí)了此結(jié)論. 圖中藍(lán)色指示EPS，綠色指示Ca2+，EPS在過渡態(tài)群體的中心部位相對(duì)較少，主要分布在藻群體的外邊緣，起包裹作用，而Ca2+則主要分布在相對(duì)成熟的細(xì)胞中(圖7A). EPS主要分布在分裂態(tài)群體中細(xì)胞較為密集的部分，Ca2+也隨著細(xì)胞的分裂聚集逐漸增多(圖7B). 將A和B中的a、b、c三幅圖對(duì)應(yīng)來看，銅綠微囊藻群體形成過程中，EPS的合成主要是由過渡態(tài)的細(xì)胞分泌，先在即將形成群體的外周起粘結(jié)保護(hù)作用，隨著細(xì)胞的分裂增殖，藻群體的密集部位EPS濃度逐漸增加，藻群體逐漸增大；Ca2+則是隨著細(xì)胞的增長聚集而逐漸增加，從微觀角度可以確定Ca2+在群體形成過程中起著重要作用. 從A和B的復(fù)合圖觀察得藻群體的藍(lán)色范圍與綠色范圍幾乎相重合，且藍(lán)色更為明顯，說明Ca2+多集中分布在群體微囊藻的EPS內(nèi)部，進(jìn)一步表明Ca2+會(huì)影響藻細(xì)胞膜的通透性，從而影響EPS向細(xì)胞外分泌的過程.

圖7 激光共聚焦顯微鏡下過渡狀態(tài)(A)和分裂狀態(tài)(B)的微囊藻群體的形態(tài)特征

2.4.2 掃描電鏡下單細(xì)胞與群體微囊藻形態(tài)特征比較 掃描電子顯微鏡下單細(xì)胞與群體微囊藻的形態(tài)如圖8所示. a是純培養(yǎng)的單細(xì)胞銅綠微囊藻，呈分散排列，大多單個(gè)存在，也有個(gè)別細(xì)胞松散地連接在一起，細(xì)胞表面有少量的多糖，進(jìn)一步表明銅綠微囊藻形成群體的另一種方式是通過單細(xì)胞直接聚集形成. b是前期實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)成熟的銅綠微囊藻群體的存在形態(tài)，群體細(xì)胞由厚厚的多糖膠鞘粘結(jié)在一起，多糖膠鞘表面有許多顆粒小晶體，根據(jù)熒光標(biāo)記可知其為Ca2+晶體，進(jìn)一步表明Ca2+有助于EPS合成以及銅綠微囊藻群體形成. 膠鞘內(nèi)部有細(xì)胞間隙，為銅綠微囊藻上浮機(jī)制創(chuàng)造條件，并能調(diào)節(jié)微囊藻在水體中運(yùn)動(dòng)，同時(shí)會(huì)影響其對(duì)光照以及營養(yǎng)鹽的吸收. b中大部分細(xì)胞正處于分裂期，子母細(xì)胞在分裂完成后并沒完全分開，而是在一個(gè)公共的EPS膠質(zhì)鞘包圍下緊貼在一起，并且不斷進(jìn)行分裂進(jìn)而形成更大的細(xì)胞群體. 比較單細(xì)胞和群體細(xì)胞的形態(tài)特征可知，群體細(xì)胞周圍的膠質(zhì)鞘更加明顯和清晰，由多糖和果膠質(zhì)組成的膠質(zhì)層更厚，即具有粘性的EPS有助于藻群體的形成.

圖8 掃描電子顯微鏡下單細(xì)胞(a)和群體(b)銅綠微囊藻的形態(tài)特征比較

3 結(jié)論

1)當(dāng)N≤100 mg/L、P≤5 mg/L時(shí)，微囊藻生長和EPS合成隨著N、P濃度增加而增加，當(dāng)N≥10 mg/L、P≥0.5 mg/L時(shí)，不同N、P濃度條件下，藻生長量無顯著性差異(P>0.05)，即 N=10 mg/L、P=0.5 mg/L就能使銅綠微囊藻呈優(yōu)勢(shì)增長，大的藻群體在N=100 mg/L、P=5 mg/L時(shí)較易形成. 低濃度Ca2+對(duì)微囊藻生長無明顯促進(jìn)作用，適宜濃度的Ca2+(65 mg/L)有利于藻生長，濃度過高則會(huì)抑制藻細(xì)胞增殖；EPS合成量隨著Ca2+濃度的增加反而降低，過高濃度的Ca2+在刺激微囊藻細(xì)胞分泌EPS的同時(shí)可能會(huì)促進(jìn)其溶解，0.13 mg/L Ca2+條件下EPS合成量最大能達(dá)到77 μg/ml，Ca2+和EPS均對(duì)微囊藻群體形成起橋架粘結(jié)作用. 光照和溫度對(duì)EPS合成有一定促進(jìn)作用，且其促進(jìn)效果均高于N、P和Ca2+作用，EPS的合成隨著溫度升高先增加后降低；30℃最適宜銅綠微囊藻生長，最高細(xì)胞密度可達(dá)3.15×107cells/ml；25℃是能形成大群體的最佳溫度，20℃是同時(shí)滿足微囊藻生長及EPS合成相對(duì)最有利的溫度條件.

2)EPS的合成主要是由過渡態(tài)的細(xì)胞分泌，在即將形成群體的外周起粘結(jié)保護(hù)作用，隨著細(xì)胞的分裂增殖，藻群體密集部位的EPS濃度逐漸增加，藻群體逐漸增大；群體細(xì)胞周圍比單細(xì)胞的膠質(zhì)鞘更加明顯和清晰，膠質(zhì)層更厚，進(jìn)而表明具有粘性的EPS在藻群體形成過程中發(fā)揮著重要作用；Ca2+則是隨著細(xì)胞的增長聚集而逐漸增加，多糖膠鞘表面有許多Ca2+晶體，從微觀角度可以確定Ca2+在EPS合成及群體形成過程中起著重要作用.

致謝：李哲副研究員提供了部分野外觀測(cè)數(shù)據(jù)，趙彬副教授幫忙審閱和修改了有關(guān)內(nèi)容，於陽幫忙收集資料，謹(jǐn)致謝意.

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Effects of environmental factors onMicrocystisaeruginosacolony formation and morphological characteristics in Three Gorges Reservoir

AN Qiang, LI Xueqin, WANG Sha, HUANG Xiaolong & JIANG Yunqiu

(KeyLaboratoryofThreeGorgesReservoirRegion’sEco-Environment,MinistryofEducation,ChongqingUniversity,Chongqing400045,P.R.China)

To revealMicrocystisaeruginosacolony formation mechanism and provide the basis for effectively controlling the algae blooming in the Three Gorges Reservoir region, impacts of N, P concentrations, Ca2+concentration, light intensity and temperature on the growth, extracellular polysaccharides synthesis and colony formation of theM.aeruginosawere investigated, and the morphological characteristics of single cells andM.aeruginosagroups were compared. The results showed that the biomass ofM.aeruginosaand EPS concentration increased with the increasing of N, P concentrations. The optimal Ca2+concentration for the growth ofM.aeruginosawas 65 mg/L, and the EPS content decreased with the increasing of Ca2+concentration. High Ca2+concentrations might stimulate the cells to secrete the EPS and simultaneously promote the EPS to be dissolved. Both Ca2+and EPS took the responsibility for the colony formation ofM.aeruginosaas the bridge bond action. Light and temperature played a role on the synthesis of the EPS, which were stronger than the promoting effects of N, P and Ca2+concentrations. 20℃ was the most favorable temperature conditions for theMicrocystisgrowth and EPS synthesis. The surrounding gelatinous sheath of cells group was more obvious and clearer than the single cell. Many Ca2+crystals on the sheath surface of polysaccharide gums were observed. Thus, Ca2+played an important role in EPS synthesis and colony formation.

Environmental factors；Microcystisaeruginosa；morphological characteristics;Three Gorges Reservoir region

*中央高校基金項(xiàng)目(CDJZR14215501)資助.2016-04-19收稿；2016-06-14收修改稿.安強(qiáng)(1979～)，男，副教授； E-mail:anqiang@cqu.edu.cn.

J.LakeSci.(湖泊科學(xué))， 2017， 29(2)： 378-388

DOI 10.18307/2017.0214

?2017 byJournalofLakeSciences