三黃益腎方的純化工藝研究Δ

吳小斌，王洛臨，李潔環(huán)，鐘如帆，袁柳萍，郭 鳴（.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣州 50405；2.廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院/廣東省中醫(yī)藥研究開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 50095）

三黃益腎方的純化工藝研究Δ

吳小斌1＊，王洛臨2#，李潔環(huán)1，鐘如帆1，袁柳萍1，郭 鳴1（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣州 510405；2.廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院/廣東省中醫(yī)藥研究開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510095）

目的：研究三黃益腎方的純化工藝。方法：以純化后澄清液中總多糖、黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷保留率和除雜率為指標(biāo)，分別考察水提醇沉法（50%、60%、70%乙醇）和澄清劑法（101果汁澄清劑、ZTC天然澄清劑、殼聚糖澄清劑）的純化效果，以篩選三黃益腎方純化方法；設(shè)計正交試驗(yàn)對最優(yōu)純化方法的工藝參數(shù)（藥液質(zhì)量濃度、澄清劑用量和藥液pH）進(jìn)行優(yōu)化，并進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果：純化方法中以殼聚糖為澄清劑時純化效果較優(yōu)，綜合評分為98.62；優(yōu)化后工藝參數(shù)為藥液質(zhì)量濃度1 g/mL、1%殼聚糖溶液用量2 mL/g、pH 5.1；驗(yàn)證試驗(yàn)中總多糖、黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷保留率和除雜率平均值分別為79.56%、78.11%、79.46%、32.18%（RSD分別為1.24%、0.97%、1.03%、1.16%，n＝3）。結(jié)論：采用殼聚糖為澄清劑對三黃益腎方純化效果較好，且操作簡單，優(yōu)化后工藝穩(wěn)定、可行。

三黃益腎方；純化工藝；正交試驗(yàn)；黃芪甲苷；總多糖；毛蕊異黃酮葡萄糖苷；殼聚糖；澄清劑

三黃益腎方是廣東省第二中醫(yī)院臨床用方劑，由熟地黃、黃芪、大黃、茯苓等藥材組成，具有補(bǔ)益氣血、活血化瘀、瀉下祛濁等功效，主要用于慢性腎病的早期治療，原劑型是煎劑，現(xiàn)計劃開發(fā)成服用方便的顆粒劑。方中主要活性成分為多糖，如黃芪多糖、熟地黃多糖和茯苓多糖等。現(xiàn)代中藥藥理研究表明，中藥多糖具有補(bǔ)益氣血、增強(qiáng)免疫的作用[1]，能改善腎病所致氣血虧虛等癥狀；同時黃芪中的皂苷類成分也具有改善腎功能作用[2]，黃芪中的黃酮類成分（指標(biāo)性成分為毛蕊異黃酮葡萄糖苷等）具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力及改善腎相關(guān)功能等作用[3]；大黃中蒽醌類等成分具有瀉下通便作用，還可防治慢性腎病的并發(fā)癥[4]。

本方現(xiàn)采用水提工藝，得膏率約為35.42%，日服生藥量較大；同時提取液中鞣質(zhì)類（大黃含有鞣質(zhì)）、蛋白質(zhì)、果膠等成分較多，會影響后續(xù)制劑的穩(wěn)定性，故需要對提取液進(jìn)行純化研究。本課題組考察了傳統(tǒng)的水提醇沉工藝與澄清劑絮凝澄清工藝的純化效果[5]，并設(shè)定醇沉工藝中乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為50%、60%、70%，絮凝澄清工藝中澄清劑分別為101果汁澄清劑、ZTC天然澄清劑、殼聚糖澄清劑，以方中總多糖、黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷的保留率和除雜率為評價指標(biāo)，篩選純化工藝，為后續(xù)制劑工藝的建立提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

DC-NSG-30多功能提取濃縮機(jī)組（上海達(dá)程實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；1200高效液相色譜儀（HPLC）（美國安捷倫公司）；電子天平（上海貴虎實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司）；XS205DU分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；UV-2550紫外分光光度計（日本島津公司）。

1.2 藥材、藥品、對照品與試劑

黃芪（批號：140101）、熟地黃（批號：150201）、大黃（批號：150101）、茯苓（批號：150301）等藥材均購自廣州中芝源中藥飲片有限公司，經(jīng)廣東省第二中醫(yī)院中藥信息研究室劉法錦主任中藥師鑒定，均符合現(xiàn)行2015年版《中國藥典》（一部）各藥材項(xiàng)下規(guī)定，測得黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量為0.021 5 g/g、黃芪甲苷含量為0.042 1 g/g[6]；葡萄糖對照品（批號：110833-201205，純度：99.5%）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品（批號：11920-201303，純度：96.7%）、黃芪甲苷對照品（批號：110781-201314，純度：95.6%）均來源于中國食品藥品檢定研究院；殼聚糖（北京正天成澄清技術(shù)有限公司，批號：150729）；101果汁澄清劑（主要成分為變性淀粉，上海沃遜生物工程有限公司，批號：150216）；ZTC1+1Ⅱ型天然澄清劑（北京正天成澄清技術(shù)有限公司，批號：150629）；液相色譜分析用水為蒸餾水，乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 三黃益腎顆粒濃縮液的制備

按處方比例稱取藥材4 kg，加8倍量水，煎煮2次，每次2.5 h，濾過，合并濾液，濃縮至藥液與藥材質(zhì)量比約為1∶1，即藥液質(zhì)量濃度以生藥量計為1 g/mL，備用。

2.2 多糖含量的測定

采用苯酚-硫酸法[7]測定。

2.2.1 葡萄糖對照品溶液的制備 精密稱取105℃干燥至恒質(zhì)量的葡萄糖對照品10.20 mg，置于100 mL量瓶中，加水溶解稀釋至刻度，搖勻，即得0.102 mg/mL的葡萄糖對照品溶液。

2.2.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及方法學(xué)考察 分別量取葡萄糖對照品溶液1、2、3、4、5 mL置于10 mL量瓶中，以水定容。各取2 mL置于具塞玻璃瓶中，分別加入5%苯酚溶液1 mL，搖勻，再緩緩加入濃硫酸5.0 mL，避光放置20 min，在95℃水浴中保溫20 min，取出后冷卻至室溫；以水為空白對照。在490 nm波長處測定吸光度，以質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)、吸光度（y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為 y＝1.772 9x+0.005 6（r＝0.999 3）。得葡萄糖檢測質(zhì)量濃度線性范圍為2.550～12.750 μg/ mL。按要求進(jìn)行精密度與回收率試驗(yàn)，結(jié)果精密度試驗(yàn)中吸光度的RSD值為1.57%（n＝6）；低、中、高水平（50%、100%、150%）回收率平均值為101.58%（RSD＝2.05%，n＝3）。上述結(jié)果表明方法學(xué)考察結(jié)果符合要求。

2.3 固形物質(zhì)量的測定

精密吸取濃縮液50 mL，置于105℃干燥至恒質(zhì)量的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，按2015年版《中國藥典》（四部）0831通則中干燥失重測定法[8]測定，計算固形物質(zhì)量和除雜率（H）[H＝（純化前固形物質(zhì)量－純化后上清液固形物質(zhì)量）/純化前固形物質(zhì)量×100%]。

2.4 毛蕊異黃酮葡萄糖苷、黃芪甲苷含量的測定

2.4.1 對照品溶液的制備 取毛蕊異黃酮葡萄糖苷、黃芪甲苷對照品適量，分別加甲醇制成0.150 9、0.504 9 mg/mL的對照品溶液。

2.4.2 供試品溶液的制備 （1）測黃芪甲苷的供試品溶液。精密量取濃縮液/澄清液18 mL，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次30 mL，合并正丁醇，用40%氨水洗滌2次，每次30 mL；洗滌后將正丁醇層水浴蒸干，殘?jiān)? mL水溶解，過D101大孔樹脂（內(nèi)徑為1.5 cm、柱高為14 cm），以水50 mL洗脫；棄洗脫液，以30 mL 40%乙醇洗脫，棄去洗脫液；以80 mL 70%乙醇洗脫，收集洗脫液，95℃水浴蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，定容? mL，過0.45 μm微孔濾膜濾過，即得[6]。（2）測毛蕊異黃酮葡萄糖苷的供試品溶液。精密量取濃縮液/澄清液1.5 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，超聲15 min（頻率為40 kHz、功率為250 W），過濾，取續(xù)濾液過0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.4.3 陰性樣品溶液的制備 按處方比例稱取除黃芪以外的藥材200 g，加8倍水，煎煮2次，每次2.5 h，合并濾液并濃縮至100 mL，分別按“2.4.2”項(xiàng)下方法制備毛蕊異酮葡萄糖苷和黃芪甲苷的陰性樣品溶液。

2.4.4 色譜條件 （1）毛蕊異黃酮葡萄糖苷。色譜柱為Kromasil-C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相為乙腈-0.1%甲酸（16∶84）；流速為1.0 mL/min；檢測波長為260 nm；柱溫為35℃；進(jìn)樣量為10 μL。理論板數(shù)以毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰計應(yīng)不低于3 000。（2）黃芪甲苷。色譜柱為AichromBond-SB C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相為乙腈-水（32∶68）；流速為1.0 mL/min；檢測波長為260 nm；柱溫為30℃；進(jìn)樣量為20 μL；蒸發(fā)光散射檢測器檢測，氮?dú)饬魉贋?.5 L/min；漂移管溫度為45℃。理論板數(shù)以黃芪甲苷計應(yīng)不低于4 000。

2.4.5 方法學(xué)考察 按照文獻(xiàn)[9]方法測定。以峰面積為縱坐標(biāo)（y）、進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（x）進(jìn)行線性回歸，得毛蕊異黃酮葡萄糖苷、黃芪甲苷的回歸方程分別為y＝3.251 7x+30.147 2（r＝0.999 6）、lny＝1.427 7lnx+4.941（r＝0.999 8），線性范圍分別為0.150 9～2.414 4、0.504 9～10.090 μg；精密度試驗(yàn)中RSD分別為1.04%（n＝3）、1.17%（n＝3）；重復(fù)性試驗(yàn)中RSD分別為1.31%（n＝3）、0.97%（n＝3）；穩(wěn)定性試驗(yàn)（室溫放置16 h）中RSD分別為1.42%（n＝3）、1.25%（n＝3）；加樣回收率試驗(yàn)中回收率平均值分別為99.43%（RSD＝1.36%，n＝3）、101.02%（RSD＝1.15%，n＝3）。

2.4.6 專屬性試驗(yàn) 分別吸取對照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液適量，按“2.4.4”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測定。結(jié)果，2個主成分峰與鄰峰分離度均符合要求，陰性樣品溶液在2個主成分峰相應(yīng)位置處無色譜峰出現(xiàn)，詳見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.5 純化樣品的制備與測定

按文獻(xiàn)[10]方法制備與測定。

2.5.1 101果汁澄清劑溶液的制備 取101果汁澄清劑適量，加入蒸餾水，勻速攪拌，溶脹36 h，制備成5%粘膠液，即得。

2.5.2 ZTC澄清劑A、B組分溶液的制備 分別取適量ZTC1+1Ⅱ型天然澄清劑A、B組分，置于2個燒杯中，分別加入蒸餾水和1%乙酸溶液，勻速攪拌，溶脹36 h，分別制備成2種1%粘膠液，即得。

2.5.3 殼聚糖溶液的制備 取殼聚糖適量，加入1%乙酸適量，勻速攪拌，溶脹36 h，制備成1%粘膠液，即得。2.5.4 純化樣品的制備 （1）水提醇沉法除雜樣品。取“2.1”項(xiàng)相當(dāng)于250 g生藥質(zhì)量的濃縮液3份，分別加95%乙醇至藥液含醇量為50%、60%、70%，勻速攪拌，放置24 h；離心（2 500 r/min，離心半徑為130 mm，下同）15 min，收集上清液，上清液加熱濃縮并定容至200 mL，備用。（2）澄清劑法中101果汁澄清劑或殼聚糖純化樣品。取“2.1”項(xiàng)相當(dāng)于250 g生藥質(zhì)量的濃縮液，每1 g生藥加入0.05 mL 101果汁澄清劑溶液或1.5 mL殼聚糖溶液。（3）澄清劑法中ZTC澄清劑純化樣品。取“2.1”項(xiàng)相當(dāng)于250 g生藥質(zhì)量的濃縮液，按每1 g生藥加入0.04 mL ZTC澄清劑B組分溶液；再按每1 g生藥加入0.02 mL ZTC澄清劑A組分溶液。上述“（2）、（3）”項(xiàng)下3種混合溶液均勻速攪拌0.5 h，放置24 h，離心，收集上清液，并于90℃水浴濃縮定容至200 mL，即得。

2.5.5 2種純化方法純化效果比較 取上述6種樣品，分別測定其中總多糖、黃芪甲苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量，計算保留率（純化后含量/純化前含量×100%）、除雜率及綜合得分[總多糖、黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷的保留率（E、F、G）和H各指標(biāo)與其最大值之比的加和，各指標(biāo)的權(quán)重分別為0.4、0.2、0.2、0.2]，結(jié)果見表1。

表1 6種純化后樣品各指標(biāo)比較Tab 1 Comparison of each index in 6 purified samples

由表1可見，澄清劑法對有效成分總多糖和黃芪甲苷的保留效果優(yōu)于水提醇沉法，前者中尤以殼聚糖為澄清劑時綜合評分最高。故選擇殼聚糖為澄清劑，采用正交試驗(yàn)法進(jìn)一步優(yōu)化其純化工藝參數(shù)。

2.6 殼聚糖純化工藝的優(yōu)化

殼聚糖的純化效果與藥液質(zhì)量濃度和殼聚糖用量有關(guān)，純化藥液pH以4～6為宜[11]，故以E、F、G和H為指標(biāo)，對藥液質(zhì)量濃度（g/mL，以生藥計）、1%殼聚糖溶液用量（每1 g生藥所需殼聚糖溶液體積，mL/g）及藥液pH（分別采用稀鹽酸與20%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)）進(jìn)行優(yōu)化。參考文獻(xiàn)[12-13]并在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上設(shè)計3因素3水平正交試驗(yàn)表，并對數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表2、表3、表4。

表2 因素與水平Tab 2 Factors and levels

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果Tab 3 Design and results of orthogonal test

表4 方差分析結(jié)果Tab 4 Results of variance analysis

由直觀分析可知各因素主次影響為B＞A＞C；方差分析結(jié)果表明，因素B對試驗(yàn)結(jié)果影響顯著，因素A對試驗(yàn)結(jié)果有一定的影響，而因素C對試驗(yàn)結(jié)果幾乎無影響。從可操作性考慮選擇純化工藝條件為A3B3C2，即藥液濃縮至質(zhì)量濃度為1 g/mL，1%殼聚糖溶液用量為2 mL/g，pH為5.1（無需調(diào)節(jié)）。

2.7 驗(yàn)證試驗(yàn)

按正交試驗(yàn)優(yōu)化的工藝條件進(jìn)行3次試驗(yàn)。取“2.4”項(xiàng)下相當(dāng)于250 g生藥質(zhì)量的濃縮液，每1 g生藥加入2 mL 1%殼聚糖溶液，勻速攪拌0.5 h，靜置24 h，離心，收集上清液，并于90℃水浴濃縮定容至200 mL，測定。分別計算E、F、G、H，結(jié)果分別為79.56%、78.11%、79.46%、32.18%（RSD分別為1.24%、0.97%、1.03%、1.16%，n＝3），表明該純化工藝穩(wěn)定、可行。

3 討論

處方中各藥材所含活性成分多為多糖類、黃酮類、皂苷類和蒽醌類成分，在水中溶解度較大[14]，故澄清劑法對總多糖和有效成分的保留，相對于水提醇沉法具有明顯優(yōu)勢；且前者還具有成本低、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)[15]，適用于純化藥液。

本試驗(yàn)中原藥液pH約為5.1，加入澄清劑后測得藥液pH約為5.0，故最終確定的優(yōu)化工藝中無需調(diào)節(jié)pH。

由于中藥復(fù)方制劑成分比較復(fù)雜，而本試驗(yàn)只考察了殼聚糖澄清劑法對三黃益腎方中臣藥黃芪的主要有效成分黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷，以及黃芪、大黃、熟地黃和茯苓等藥材中含有的總多糖含量的影響，而對其他有效成分如君藥大黃中的蒽醌類成分、臣藥熟地黃中的毛蕊花糖苷類的保留效果，還需進(jìn)一步研究。另外，本次試驗(yàn)反應(yīng)皆在常溫下操作，反應(yīng)后澄清液統(tǒng)一水浴濃縮至200 mL，故純化工藝中的反應(yīng)溫度還需進(jìn)一步考察，其他因素如靜置時間、攪拌速率等也有待進(jìn)一步的研究和優(yōu)化。

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Study on the Purification Technology of Sanhuang Yishen Formula

WU Xiaobin1，WANG Luolin2，LI Jiehuan1，ZHONG Rufan1，YUAN Liuping1，GUO Ming1（1.Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China；2.Guangdong Province Engineering and Technology Research Institute of Chinese Medicine/Guangdong Provincial Key Laboratory of Chinese Medicine Research and Development，Guangzhou 510095，China）

OBJECTIVE：To study the purification technology of Sanhuang yishen formula.METHODS：Using retention rate and impurity rate of purified total polysaccharide，astragaloside and calycosin glucoside as index，the purification effects of water extraction and alcohol precipitation method（50%，60%，70%ethanol）and clarifying agent method（101 juice clarifying agent，ZTC natural clarifying agent，chitosan clarifying agent）were respectively detected to screen the purification method；orthogonal test was used to optimize the technology parameters（mass concentration of liquid，amount of clarifying agent and pH of liquid）by the optimized purification method，and the verification test was conducted.RESULTS：The purification was better when using chitosan as clarifying agent with comprehensive score of 98.62；the purified technology parameters were mass concentration of liquid 1 g/mL，1%chitosan solution amount of 2 mL/g，pH 5.1；the average value of retention rate and impurity rate of purified total polysaccharide，astragaloside and calycosin glucoside in verification test were 79.56%（RSD＝1.24%，n＝3），78.11%（RSD＝0.97%，n＝3），79.46%（RSD＝1.03%，n＝3）and 32.18%（RSD＝1.16%，n＝3），respectively.CONCLUSIONS：Using chitosan as clarifying agent shows good purification effect for Sanhuang yishen formula，which is simple.The optimized technology is stable and feasible.

Sanhuang yishen formula；Purification technology；Orthogonal test；Astragaloside；Total polysaccharide；Calycosin glucoside；Chitosan；Clarifying agent

R95

A

1001-0408（2017）07-0957-04

2016-06-03

2016-08-12）

（編輯：劉 萍）

廣東省科技計劃項(xiàng)目（No.2014A020210017）

＊碩士研究生。研究方向：中藥制劑。電話：020-83501292。E-mail：wxbzhongyao@163.com

#通信作者：主任中藥師，碩士生導(dǎo)師。研究方向：中藥制劑。電話：020-83501292。E-mail：luolin_w@163.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.07.27