考馬斯亮藍(lán)法對煙草薄片涂布液中蛋白質(zhì)含量的測定

楊靜++白冰++王寧++張改紅

摘要：采用考馬斯亮藍(lán)法對煙草薄片涂布液中的蛋白質(zhì)含量進(jìn)行了測定，建立了快速、靈敏的蛋白質(zhì)檢測方法。結(jié)果表明，蛋白質(zhì)含量在14～140 μg/mL與吸光度呈良好的線性關(guān)系（R2=0.999 5），樣品平均回收率為101.5%，RSD為1.4%。該方法簡便、快速、準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好，可以作為煙草薄片涂布液及煙草料液中蛋白質(zhì)測定的有效方法。

關(guān)鍵詞：薄片涂布液；蛋白質(zhì)；考馬斯亮藍(lán)法

中圖分類號：Q51；S572 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）05-0946-02

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.05.039

Determination of Protein Content in Reconstituted Tobacco Coating Liquid by Coomassie Brilliant Blue Method

YANG Jing1，BAI Bing1，WANG Ning2，ZHANG Gai-hong1

（1.School of Food and Bioengineering， Zhengzhou University of Light Industry， Zhengzhou 450000， China； 2.Henan Cigarette Industry Tobacco Sheet Co. Ltd.， Xuchang 461000， Henan，China）

Abstract： A rapid and sensitive Coomassie brilliant blue method was developed for protein determination in reconstituted tobacco coating liquid. The results showed that，the protein content had a good linear relationship with the absorbance in the range of 14～140 μg/mL（R2=0.999 5）. The average recovery was 101.5% and RSD was 1.4%. The method was simple，rapid，accurate and have high reproducibility，which could be used to determine the protein content in reconstituted tobacco coating liquid and tobacco sauce as an efficient method.

Key words： reconstituted tobacco coating liquid； protein； coomassie brilliant blue method

蛋白質(zhì)對于煙葉的吸味品質(zhì)有不利的影響，燃吸時煙葉中的蛋白質(zhì)會使煙氣苦味增加并有燒羽毛的氣味，因此準(zhǔn)確測定煙草中的蛋白質(zhì)含量有著重要意義。國內(nèi)煙草行業(yè)主要采用克達(dá)爾法及其改進(jìn)方法[1，2]。

近年來，連續(xù)流動法測定蛋白質(zhì)也得到了較多的應(yīng)用[3-5]。為了消除可溶性氮如氨基酸、生物堿的干擾，這些方法在操作時須使用酸性溶劑將可溶性氮去除，其主要研究對象是煙草及固態(tài)煙草制品。然而對于煙草水浸提得到的產(chǎn)品如煙草料液、煙草薄片涂布液，其中的生物堿、氨基酸難以有效的與可溶性蛋白質(zhì)分離，因此在使用上述方法測定蛋白質(zhì)時，會造成嚴(yán)重干擾。針對這種情況，必須建立一種簡便快速、選擇性好、干擾小的煙草料液、煙草薄片涂布液中蛋白質(zhì)含量的檢測方法。

考馬斯亮藍(lán)法又稱Bradford法，廣泛用于食品中可溶性蛋白質(zhì)的快速測定[6，7]。其基本原理是在酸性條件下考馬斯亮藍(lán)G-250選擇性與蛋白質(zhì)疏水基團(tuán)結(jié)合，形成藍(lán)色的蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物，在595 nm處有最大光吸收，而氨基酸、生物堿對此并無干擾[8-10]。因此本研究采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測定煙草薄片涂布液中蛋白質(zhì)含量，并對該方法的線性關(guān)系、精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、回收率進(jìn)行考察，旨在探索建立一種準(zhǔn)確快速、選擇性好、成本低廉的測定煙草薄片涂布液及煙草料液中蛋白質(zhì)含量的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

T-6新世紀(jì)紫外-可見分光光度計（北京普析通用），考馬斯亮藍(lán)G-250（阿拉?。?，牛血清白蛋白BSA（西安國安生物科技），其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液配置 精密稱取牛血清白蛋白14.2 mg，用去離子水溶解，定容于100 mL容量瓶，制得142 μg/mL蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于4 ℃冰箱中保存。

1.2.2 考馬斯亮藍(lán)G-250溶液配制 稱取100 mg考馬斯亮藍(lán)G-250，溶于50 mL 95%乙醇，加入85%磷酸100 mL，用去離子水定容于1 L棕色容量瓶中，制得考馬斯亮藍(lán)G-250溶液（呈棕紅色），備用。

1.2.3 供試樣品溶液制備 精密稱取300 mg煙草薄片涂布液定容于25 mL容量瓶，制得供試樣品溶液，備用。

1.2.4 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 取7支10 mL具塞試管，分別精密吸取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液于試管中，各管補(bǔ)加去離子水至1 mL，加入考馬斯亮藍(lán)G-250溶液5 mL，混勻，室溫放置5 min后在595 nm處測定溶液吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 樣品中蛋白質(zhì)含量測定 取供試樣品溶液 1 mL，按照“1.2.4”方法測定其595 nm處吸光度，計算供試樣品中蛋白質(zhì)含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和回歸方程的建立

以體系中蛋白質(zhì)質(zhì)量（μg）為橫坐標(biāo)x，595 nm處吸光度為縱坐標(biāo)y（表1），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1，得回歸方程為，y=0.013 39+0.005 39x，R2=0.999 5，由此表明，蛋白質(zhì)在14～140 μg/mL與吸光度之間符合Lamber-Beer定律。

2.2 精密度試驗

精密吸取標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，按照“1.2.4”方法連續(xù)測定6次吸光度，計算RSD為0.4%，表明該方法精密度良好。

2.3 重復(fù)性試驗

精密吸取標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液6份，按照“1.2.4”方法分別測定其吸光度，計算RSD為3.3%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4 穩(wěn)定性試驗

精密吸取標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，按照“1.2.4”方法每隔20 min測定一次吸光度，表明2 h之內(nèi)吸光度無明顯變化，RSD為0.7%。

2.5 回收率試驗

精密吸取已知含量的樣品溶液，分別加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，按照“1.2.4”方法測定其吸光度，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，樣品加標(biāo)回收率范圍為99.5%～103.2%，平均回收率為101.5%，RSD<5%，該方法準(zhǔn)確度較高。

2.6 樣品含量測定

對3個不同樣品煙草薄片涂布液進(jìn)行蛋白質(zhì)含量測定，每個樣品3次重復(fù)，3次測定結(jié)果平均值作為實測值，結(jié)果見表3。

3 結(jié)論

建立了煙草薄片涂布液中蛋白質(zhì)含量測定的考馬斯亮藍(lán)G-250染色法，該方法精密度高、穩(wěn)定性和重復(fù)性好，對儀器精度要求較低。結(jié)果表明，蛋白質(zhì)濃度在14～142 μg/mL時，與吸光度呈良好的線性關(guān)系。可見，該方法是一種煙草薄片涂布液中蛋白質(zhì)含量測定的有效方法，同時該方法也適用于煙草料液中蛋白質(zhì)含量的測定。

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