米邦塔仙人掌多糖提取工藝的研究

徐叢玥++林款++茹琴++梁征++李超英

摘要：對熱水提取米邦塔仙人掌（Opuntia milpa alta Haw）粗多糖的提取工藝進(jìn)行研究。以新鮮米邦塔仙人掌為原料，采用單因素試驗(yàn)考察料液比、提取溫度、提取時間和提取次數(shù)對米邦塔仙人掌粗多糖得率的影響，并通過響應(yīng)面法優(yōu)化工藝參數(shù)。結(jié)果表明，影響粗多糖得率的因素主次順序?yàn)樘崛囟?料液比>提取時間。確定最佳提取工藝參數(shù)為提取溫度83 ℃，料液比1∶28（g∶mL），提取時間為3 h，在此條件下，仙人掌粗多糖的得率為2.05%。

關(guān)鍵詞：米邦塔仙人掌（Opuntia milpa alta Haw）；粗多糖；提取；響應(yīng)面法

中圖分類號：S682.33；TS201.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）05-0927-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.05.034

Studies of Extraction Technique of Polysaccharide from Opuntia milpa alta Haw

XU Cong-yue1， LIN Kuan1， RU Qin1， LIANG Zheng1， LI Chao-ying1，2

（1. Wuhan Institutes of Biomedical Sciences， Jianghan University， Wuhan 430056， China；

2. Hanjea Biological Technology （Wuhan） Limited Liability Company， Wuhan 430075，China）

Abstract：Polysaccharide in fresh Opuntia milpa alta Haw was extracted with hot water. The effects of the ratio of material to water，extraction temperature，extraction time and extraction times on the yield of polysaccharide were investigated by single factor experiments. Subsequently，a quadratic regression rotational combinational design was employed，and data obtained were analyzed with response surface methodology. Polysaccharide yield was most significantly affected by extraction temperature，followed by water to material ratio，and extraction time. An optimum polysaccharide yield of 2.05% was obtained when opuntia milpa alta was treated at 83 ℃ for 3 h in a material-to-water ratio of 1∶28（g∶mL）.

Key words：Opuntia milpa alta Haw； polysaccharide； extraction； response surface methodology

由于仙人掌（Opuntia stricta）悠久的藥用歷史、豐富的營養(yǎng)活性成分及易于栽培等因素，在農(nóng)學(xué)、食品及醫(yī)學(xué)等方面已經(jīng)受到廣泛關(guān)注[1]。米邦塔仙人掌是1997年中國農(nóng)業(yè)部從墨西哥米邦塔地區(qū)引進(jìn)的食用仙人掌，富含多種營養(yǎng)成分，如鈣、鉀、鋅、鐵等礦物質(zhì)、蛋白質(zhì)、維生素，還含有多種活性功能成分，如多糖類、黃酮類、生物堿類等[2]。黏液質(zhì)細(xì)胞和黏液質(zhì)是仙人掌植物的特征之一，其中含有大量糖類物質(zhì)，而多糖是仙人掌重要的功能成分。目前，對仙人掌多糖的提取純化、藥理功能及應(yīng)用開發(fā)等方面研究較多，因此仙人掌多糖的提取工藝及其應(yīng)用已具備了實(shí)際價值[3]。

米邦塔仙人掌多糖的提取方法有很多種，如熱水提取、酶法提取、稀酸或稀堿提取以及微波或超聲波輔助提取法[4]，但研究最廣泛的是熱水提取法。采用熱水提取法提取多糖受許多因素影響，如料液比、提取溫度、提取時間及提取次數(shù)等，需經(jīng)過合理設(shè)計(jì)和試驗(yàn)才能得到最佳工藝。蔡為榮等[5]采用水提法提取仙人掌多糖，用響應(yīng)面分析法得到最佳提取條件為提取溫度86.1 ℃，提取時間3.61 h，料液比 1∶3.72，多糖得率為0.694%；劉洋等[6]用相同的響應(yīng)面分析法提取仙人掌多糖，得到最佳工藝條件為料液比1∶5.5，提取溫度75 ℃，提取時間2.2 h，浸提1次，在此條件下，仙人掌粗多糖的實(shí)際得率為0.81%。

響應(yīng)面法（RSM）是利用合理的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用多元二次回歸方程擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過回歸分析優(yōu)化工藝參數(shù)，可以形象、直觀地解決工藝優(yōu)化問題[7]。因此，本試驗(yàn)通過響應(yīng)面法優(yōu)化熱水法提取米邦塔仙人掌粗多糖工藝參數(shù)，旨在提高仙人掌粗多糖提取率，為仙人掌多糖進(jìn)一步的功能活性研究及開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

新鮮米邦塔仙人掌，購自江蘇宿遷繁星花卉園藝中心；無水乙醇、95%乙醇、丙酮、無水乙醚、濃硫酸、苯酚、三氯乙酸、阿拉伯糖等均為分析純；考馬斯亮藍(lán)G250試劑盒，購自武漢博士德生物有限公司。

DFY-1000V型高速萬能粉碎機(jī)，上海比朗儀器有限公司；RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，SHZ-Ⅲ型循環(huán)水式真空泵，上海亞榮生化儀器廠；FD-1A-50型冷凍干燥機(jī)，上海豫明儀器有限公司；高速落地冷凍離心機(jī)，德國BECKMAN公司；全波長酶標(biāo)儀，美國Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 米邦塔仙人掌粗多糖提取工藝流程 新鮮米邦塔仙人掌→預(yù)處理→仙人掌干粉→熱水提取→離心→取上清液，加4倍體積95%乙醇靜置12 h→離心→沉淀加500 mL去離子水復(fù)溶→濃縮→三氯乙酸法除蛋白質(zhì)→透析除雜→取上清液，加4倍體積95%乙醇靜置12 h→離心→分別用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌沉淀3次→冷凍干燥→得到米邦塔仙人掌粗多糖。

1.2.2 操作要點(diǎn) 預(yù)處理[8]：取新鮮米邦塔仙人掌洗凈、去皮、切片，置于80 ℃烘箱內(nèi)烘干，然后粉碎成粉末，過60目篩，以1∶2的料液比添加石油醚，脫脂脫色素后晾干，密封保存。

熱水提取：精確稱取10.0 g米邦塔仙人掌干粉，按設(shè)定水提條件（料液比、提取溫度、提取時間）進(jìn)行提取試驗(yàn)，得到粗多糖浸提液。

采用三氯乙酸法除去蛋白質(zhì)[9]：等體積加入3%三氯乙酸溶液，攪拌均勻后于4 ℃靜置12 h，10 000 r/min離心10 min，上清液用NaOH調(diào)pH至中性，重復(fù)操作3次。

1.2.3 米邦塔仙人掌粗多糖含量測定 采用苯酚-硫酸法測定粗多糖含量[10]，以阿拉伯糖為標(biāo)準(zhǔn)品測定粗多糖中多糖含量。粗多糖得率=粗多糖重量/仙人掌干粉重量×100%。

1.2.4 單因素和響應(yīng)面試驗(yàn) 通過單因素試驗(yàn)，分別考察料液比、提取溫度、提取時間、提取次數(shù)對米邦塔仙人掌粗多糖得率的影響。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以料液比、提取溫度和提取時間為參數(shù)，以粗多糖得率為響應(yīng)值，按照Design-Expert 10.0分析軟件中的Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)法，設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，并對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到響應(yīng)面回歸方程，進(jìn)一步尋找最優(yōu)工藝參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱水提取仙人掌粗多糖工藝單因素試驗(yàn)

2.1.1 料液比對仙人掌粗多糖得率的影響 固定提取溫度為75 ℃，提取3 h，提取1次，調(diào)節(jié)料液比分別為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g∶mL，下同），考察不同料液比對粗多糖得率的影響，結(jié)果如圖1所示。由于多糖等大分子物質(zhì)的溶解度不高，因此提取過程中用水量是一個重要因素。由圖1可知，隨著料液比的增加，仙人掌粗多糖得率明顯增加，當(dāng)料液比為1∶30時粗多糖得率最大。仙人掌中水分較高，黏性強(qiáng)，烘干后加水提取依然黏稠，當(dāng)料液比較低時，溶液呈糜狀，需要較強(qiáng)的攪拌力度，不容易分離多糖，且損失較大；增加料液比，有利于粗多糖的提取。

2.1.2 提取溫度對仙人掌粗多糖得率的影響 固定料液比為1∶20，提取3 h，提取1次，提取溫度分別設(shè)定為65、70、75、80、85、90 ℃，分析不同提取溫度對仙人掌粗多糖得率的影響，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，在65～85 ℃，仙人掌粗多糖得率隨著溫度的升高而增加，但85 ℃后，溫度升高粗多糖得率反而下降?？赡苁且?yàn)闇囟冗^高，粗多糖穩(wěn)定性降低，高溫條件下部分粗多糖降解，因此提取溫度不宜太高。

2.1.3 提取時間對仙人掌粗多糖得率的影響 固定料液比為1∶20，提取溫度75 ℃，提取1次，設(shè)計(jì)提取時間為1、2、3、4、5 h，考察不同提取時間對仙人掌粗多糖得率的影響，結(jié)果見圖3。由圖3可知，提取時間在2 h以內(nèi)，仙人掌粗多糖得率增加，時間過長粗多糖得率反而下降。在粗多糖提取過程中，粗多糖浸出程度與時間有關(guān)，時間過短，提取不充分，但時間過長，可能會引起粗多糖結(jié)構(gòu)的變化從而降低得率。

2.1.4 提取次數(shù)對仙人掌粗多糖得率的影響 在料液比1∶20，提取溫度75 ℃，提取時間3 h的條件下，考察提取次數(shù)對仙人掌粗多糖得率的影響，結(jié)果見圖4。由圖4可知，第1次粗多糖得率為1.5%，提取2次累計(jì)為1.7%，而第3次粗多糖得率僅為0.1%。重復(fù)提取3次，粗多糖得率增加不明顯，而且增加提取次數(shù)會使后續(xù)濃縮任務(wù)加重，延長提取時間，考慮到提取成本，因此選擇提取1次。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 為優(yōu)化單因素試驗(yàn)得到的工藝條件，根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇料液比（X1）、提取溫度（X2）和提取時間（X3）3個對仙人掌粗多糖得率影響較大的因素為自變量，以粗多糖得率為響應(yīng)值，進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面分析。結(jié)合前期單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)各因素水平（表1），具體試驗(yàn)方案和結(jié)果如表2所示。

響應(yīng)面分析試驗(yàn)共有15個試驗(yàn)，其中1～12號為析因試驗(yàn)，13～15號為中心試驗(yàn)。析因點(diǎn)是三個自變量構(gòu)成的三維頂點(diǎn)為區(qū)域的中心點(diǎn)，三個中心試驗(yàn)則用來估計(jì)試驗(yàn)誤差。

2.2.2 模型方差分析 通過Design-Expert 10.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到響應(yīng)面回歸方程，回歸模型方差分析結(jié)果見表3，回歸方程各系數(shù)顯著性分析結(jié)果見表4，回歸方程中各系數(shù)的估計(jì)值見表5。

從表3回歸方差分析可知，該模型P<0.01，方程模型達(dá)到極顯著，失擬檢驗(yàn)P=0.473 322>0.05，影響不顯著，說明無失擬因素存在。該回歸模型的總決定系數(shù)R2=0.996 7，調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.990 7，說明該模型的擬合程度較好，試驗(yàn)誤差小。故此回歸方程模型成立，可以用此模型對熱水提取米邦塔仙人掌粗多糖進(jìn)行分析和預(yù)測。

由表4可知，熱水提取米邦塔仙人掌粗多糖的工藝參數(shù)中，料液比、提取溫度、提取時間3個因素對仙人掌粗多糖的影響均極顯著。在所選取的各因素水平范圍內(nèi)，影響粗多糖得率的因素主次順序?yàn)樘崛囟龋╔2）>料液比（X1）>提取時間（X3）。料液比（X1）與提取時間（X3）存在交互作用，達(dá)到顯著水平。

對表4中的各項(xiàng)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到表5中各項(xiàng)系數(shù)的估計(jì)值，故自變量與米邦塔仙人掌粗多糖得率的二次多項(xiàng)回歸方程為Y=2.056 67+0.036 25X1+0.057 50X2+0.033 75X3-0.007 50X1X2-0.010 00X2X3+0.007 50X2X3-0.018 33X12-0.050 83X22-0.013 33X32。

2.2.3 響應(yīng)面分析 熱水提取米邦塔仙人掌粗多糖工藝中料液比、提取溫度和提取時間3個因素之間的交互作用對粗多糖得率的影響見圖5、圖6和圖7。

等高線的形狀可直觀地看出交互作用的強(qiáng)弱，橢圓形反映了兩因素的交互作用較強(qiáng)，呈圓形則相反，而響應(yīng)面曲線較陡也說明交互作用較強(qiáng)。由圖5可知，與料液比相比，提取溫度的響應(yīng)面曲線較陡，對仙人掌粗多糖得率的影響較大，說明提取溫度對粗多糖得率的影響較料液比明顯。由圖6可知，提取時間與料液比的交互作用對仙人掌粗多糖得率的影響顯著。由圖7可知，隨著提取溫度和提取時間的同時增加，仙人掌粗多糖得率也在增大。

根據(jù)Design-Expert 10.0軟件分析得到最優(yōu)提取工藝參數(shù)為料液比1∶27.96，提取溫度82.97 ℃，提取時間2.99 h，此時仙人掌粗多糖得率為2.10%。為檢驗(yàn)響應(yīng)面法優(yōu)化米邦塔仙人掌粗多糖提取工藝的可靠性，采用優(yōu)化后的提取條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。參考實(shí)際操作，將優(yōu)化的工藝參數(shù)調(diào)整為料液比1∶28，提取溫度為83 ℃，提取時間為3 h。在此條件下，仙人掌粗多糖得率為2.05%，與理論預(yù)測值基本吻合。因此，利用此模型優(yōu)化得到的工藝參數(shù)真實(shí)可靠，具有可行性和實(shí)用價值，測得該粗多糖中多糖含量為54.18%。

3 小結(jié)

本研究采用熱水法提取米邦塔仙人掌粗多糖，為進(jìn)一步優(yōu)化熱水法提取粗多糖的工藝條件，考察了料液比、提取溫度、提取時間和提取次數(shù)4個因素對仙人掌粗多糖得率的影響。

通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)，得到影響粗多糖得率的因素按主次順序排列：提取溫度（X2）>料液比（X1）>提取時間（X3）。確定最佳提取工藝參數(shù)為料液比1∶28，提取溫度83 ℃，提取時間3 h，在此條件下，仙人掌粗多糖的得率為2.05%，多糖含量為54.18%。

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