ML-超微量磁珠法和Chelex-100法提取脫落細(xì)胞的比較研究

王珂，蘇曉偉，潘澄，唐柯，李興業(yè)，彭誠，姚雪，尚雷鵬

（北京市公安局海淀分局刑偵支隊(duì)，北京 100142）

ML-超微量磁珠法和Chelex-100法提取脫落細(xì)胞的比較研究

王珂，蘇曉偉，潘澄，唐柯，李興業(yè)，彭誠，姚雪，尚雷鵬

（北京市公安局海淀分局刑偵支隊(duì)，北京 100142）

目的對ML-超微量磁珠法（KingFisher Flex）和Chelex-100法提取脫落細(xì)胞DNA的檢驗(yàn)效果進(jìn)行比較，為優(yōu)化案件里脫落細(xì)胞檢材的提取方法提供方向。方法對同一份檢材（紡織品或作案工具）利用兩種提取方法進(jìn)行DNA的平行提取，常規(guī)STR檢測，經(jīng)卡方檢驗(yàn)比較差異。結(jié)果112份紡織品檢材中ML-超微量磁珠法檢出率為58.0%，Chelex-100檢出率則為45.5%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝7.00，P＜0.05）。130份作案工具檢材中ML-超微量磁珠法檢出率為41.5%，Chelex-100檢出率則為33.8%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝4.55，P＝0.03）。結(jié)論ML-超微量磁珠法（KingFisher Flex）提取脫落細(xì)胞更具有優(yōu)勢。

法醫(yī)遺傳學(xué)；超微量磁珠法（KingFisher Flex）；Chelex-100；STR檢驗(yàn)；脫落細(xì)胞

脫落細(xì)胞的檢驗(yàn)是法醫(yī)DNA檢驗(yàn)的熱點(diǎn)和難點(diǎn)之一，脫落細(xì)胞檢材包括口腔脫落細(xì)胞檢材、體表脫落細(xì)胞檢材、人體排泄物和分泌物等。對于這些潛在的微量物證，一旦成功獲得了DNA分型結(jié)果，往往為案件偵破提供了方向，并為案件定性和法庭量刑提供科學(xué)依據(jù)[1]。因此，如何從微量脫落細(xì)胞檢材中提取足夠的DNA以滿足法醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)的需要，選擇合適的提取方法顯得尤其重要。本文以紡織用品（主要為衣物）和作案工具（刀柄、老虎鉗）為研究對象，分別用ML-超微量磁珠法（KingFisher Flex）和Chelex-100法對脫落細(xì)胞進(jìn)行提取，采用平行比對的方法，以比較檢出差異。

1 材料與方法

1.1 材料

KingFisher專用磁珠DNA提取試劑盒；Chelex-100懸浮液，脫落細(xì)胞粘取器，DNA提取專用棉簽（上海博坤信息技術(shù)有限公司）

本文分析的112份紡織品和130份作案工具類檢材均來自實(shí)驗(yàn)室日常收檢。每個紡織品檢材使用脫落細(xì)胞粘取器平行提取兩份，作案工具使用DNA專用提取棉簽平行提取兩份，進(jìn)行常規(guī)STR檢測。

1.2 方法

1.2.1 Chelex-100法

剪取適量檢材，放置于1.5m L離心管中，加入5%的Chelex-100懸浮液60 uL，放置于56℃保溫30min，震蕩，再放置于100℃煮沸8min，13000 r/min離心3min。

1.2.2 ML-超微量磁珠法（KingFisher Flex）

剪取適量檢材，放入1.5mL離心管中，加入300uL消化液與PK的混合液（按照12.5∶1的比例向消化液ML中加入10mg/mL的蛋白酶K）；56℃溫浴1 h，消化后，將離心管放入離心機(jī)中，13000 r/min離心3min，使載體與消化產(chǎn)物完全分離；將試劑盒中2號板打開，將消化產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到試劑板中；將1號板和塑料磁套外包裝打開，輕微顛倒1號板幾次，將磁珠懸浮到溶液中，并將溶液甩至孔底后，撕去密封塑料膜，將塑料磁套放置于1號板中；將洗脫板外包裝打開，用8道排槍向洗脫板孔內(nèi)加40 uL高純水；將3、4、5號板外包裝打開，撕掉密封膜；打開Flex電源，開始運(yùn)行程序進(jìn)行提取。

1.2.3 STR復(fù)合擴(kuò)增及分型

使用AmpFlSTR Identifiler PCR擴(kuò)增試劑盒（美國AB公司），9700型PCR擴(kuò)增儀（美國AB公司）擴(kuò)增。反應(yīng)總體積25uL，其中模板DNA 10uL，反應(yīng)混合液10 uL，引物混合液5 uL。3130XL遺傳分析儀（美國AB公司）對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離。

2 結(jié)果與討論

112例紡織樣本和130例作案工具采用兩種方法進(jìn)行提取，以檢出15個STR基因座和性別基因座作為檢出標(biāo)準(zhǔn)，其余作為未檢出標(biāo)準(zhǔn)。

結(jié)果顯示，ML-超微量磁珠法在紡織品上檢出率為58.0%，Chelex-100檢出率則為45.5%，兩種提取方法在紡織品上檢出情況，經(jīng)卡方檢驗(yàn)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。ML-超微量磁珠法在作案工具上檢出率為41.5%，Chelex-100檢出率則為33.8%，經(jīng)卡方檢驗(yàn)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表2）。

表1 兩種提取方法在112例紡織品上的檢出情況比較（n＝112）

表2 兩種提取方法在130例作案工具上的檢出情況比較（n＝130）

現(xiàn)場遺留的紡織品和作案工具用兩種提取方法的檢出率不同，采用ML-超微量磁珠法提取檢出率高于Chelex-100，且Chelex-100提取的DNA STR分型峰值在200以下，等位基因擴(kuò)增不均衡，小片段優(yōu)勢擴(kuò)增，大片段等位基因丟失。而ML-超微量磁珠法提取的DNA STR分型峰值一般在400左右，等位基因擴(kuò)增STR分型完整，圖譜峰高均衡，優(yōu)于Chelex-100提取的效果（圖1）。兩種提取方法對于粗糙、易滲透客體（紡織品）的檢出率高于作案工具的檢出率，可能與衣物等紡織類用品與人體表面的接觸面積大，接觸時間長，而硬質(zhì)的作案工具與人體接觸面積小，接觸部位不確定及犯罪嫌疑人有可能帶有手套有關(guān)。

Chelex-100是苯乙烯和二乙烯基苯的共聚體，它包含成對的亞氮基乙酰乙酸，可螯合多價金屬離子，如鎂離子，將鎂離子從反應(yīng)體系去除之后，降解DNA的核酸酶就會失活，從而保護(hù)DNA分子。這種提取方法適用范圍廣泛，易于操作，且價格低廉。整個操作過程在EP管中完成，沒有損失和消耗，因此回收率高，沒有二次污染。但是，Chelex-100法不能去除DNA溶液中的雜質(zhì)和降解的DNA片段，也容易出現(xiàn)等位基因擴(kuò)增不平衡，甚至小片段優(yōu)勢擴(kuò)增導(dǎo)致大片段等位基因缺失的現(xiàn)象[2]。對于污染少、雜質(zhì)少的檢材，可以選擇Chelex-100作為提取方法。

圖1 兩種不同提取方法在紡織品上的STR圖譜比較

ML-超微量磁珠法利用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，從細(xì)胞中游離出來的DNA分子被磁珠吸附，而蛋白質(zhì)分子不被吸附游離在溶液里。在磁場作用下，磁珠與溶液分離，然后回收顆粒，再用純水洗脫顆粒。ML-超微量磁珠法單次運(yùn)行可以純化1～96個樣本，減少操作人員的工作量；有效避免人工操作可能引起的差異，減少污染并提高結(jié)果的可重復(fù)性；它通過超強(qiáng)磁棒轉(zhuǎn)移樣品，液體零殘留，磁珠回收效率大于99%。

與Chelex-100法相比，ML-超微量磁珠法能有效的去除100 bp以下的雜質(zhì)，可以調(diào)整DNA洗脫液的量對樣本進(jìn)行濃縮，因此獲得的DNA分子純度高，峰高比較均衡，小片段優(yōu)勢擴(kuò)增不明顯。因此適合于微量、有污染的檢材的提取。

[1]陳松，李萬水，胡蘭，等.微量DNA：容易忽略的生物物證[J].刑事技術(shù)，2004（S）：19-22.

[2]楊電，張麗萍，劉超，等.Chelex-100和兩種磁珠法提取接觸性DNA效果的比較[J].刑事技術(shù)，2012，（1）：11-13.

（本文編輯：李成濤）

DNA Extraction from Exfoliated Cells:Comparison between ML-Super Micro Beads Method and Chelex-100 Method

WANG Ke,SU Xiao-wei,PAN Cheng,TANG Ke,LIXing-ye,PENG Cheng,YAO Xue,SHANG Lei-peng
（Haidian Branch Criminal Investigation Detachment,Beijing Municipal Public Security Bureau,Beijing 100142,China）

Objective To compare the extraction rate of DNA from exfoliated cells by ML-ultra micro beads method（KingFisher Flex）and Chelex-100 method,thus optimizing the extraction method in forensic practice.M ethod The parallel extraction of DNA from the same sample（textiles or tools）was carried out by two extraction methods,and the results were compared with common STR.Result Among 112 textile samples，the detection rate of ML-micro beadsmethod and Chelex-100method was 58%and 45.5%,respectively.The difference was statistically significant（χ2＝7.00,P＜0.05）.Among 130 pieces of crime tool samples,the detection rate of ML-micro beadsmethod and Chelex-100 method was 41.5% and 33.8%,respectively.The difference was also statistically significant（χ2＝4.55,P＝0.03）.Conclusion ML-micro beads method（KingFisher Flex）hasmore advantages in the extraction of DNA from exfoliated cells.

forensic genetics;ML-ultramicro beadsmethod（KingFisher Flex）;Chelex-100;STR test;exfoliated cell

DF795.2

A

10.3969/j.issn.1671-2072.2017.02.007

1671-2072-（2017）02-0052-03

2016-09-02

王珂（1986—），女，主檢法醫(yī)師，碩士，主要從事法醫(yī)物證學(xué)工作研究。E-mail:252810117@qq.com。