水體微生物污染指示菌在不同營養(yǎng)水平下的穩(wěn)定性

張 楊,賈樂華,吳仁人,陳中穎,李開明,張一敏(1.武漢理工大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院,湖北 武漢 30070；2.環(huán)境保護(hù)部華南環(huán)境科學(xué)研究所,廣東 廣州 510655；3.武漢科技大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院,湖北 武漢 30081；.華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,廣東 廣州 510006；5.廣東省水與大氣污染防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東廣州 510655)

水體微生物污染指示菌在不同營養(yǎng)水平下的穩(wěn)定性

張 楊1,2,賈樂華4,吳仁人2,5*,陳中穎2,5,李開明2,5,張一敏1,3(1.武漢理工大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院,湖北 武漢 430070；2.環(huán)境保護(hù)部華南環(huán)境科學(xué)研究所,廣東 廣州 510655；3.武漢科技大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院,湖北 武漢 430081；4.華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,廣東 廣州 510006；5.廣東省水與大氣污染防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東廣州 510655)

微生物污染指示菌在水體中的穩(wěn)定性直接影響到定量的準(zhǔn)確性及應(yīng)用的適應(yīng)性.通過建立水環(huán)境模擬反應(yīng)器,以實(shí)時(shí)熒光定量 PCR方法探究雞糞中大腸埃希氏菌(EC)、擬桿菌(GB)及雞源特異性基因(CB)等指示微生物在不同營養(yǎng)水平的水環(huán)境的穩(wěn)定性及衰減特征.結(jié)果表明:所選微生物衰減較好的符合一級動力學(xué)模型.對照組和含有營養(yǎng)物質(zhì)實(shí)驗(yàn)體系中指示微生物的衰減系數(shù) k分別為 EC(0.135,0.134;前者為對照組,下同),GB(0.415,0.457),CB(0.425,0.437),說明營養(yǎng)物質(zhì)對EC、GB、CB的衰減未有顯著影響.有氧水環(huán)境中,GB、CB呈現(xiàn)快速衰減趨勢,EC則變化相對緩慢.不同營養(yǎng)水平下3種微生物的衰減具有顯著正相關(guān)性(P＜0.05),均可作為良好指示菌以評價(jià)水體的微生物污染程度,但特征各異.

微生物污染源解析；指示微生物；衰減；營養(yǎng)；溶解氧

近年來,因畜禽糞便和生活污水引起的水源性傳染疾病頻發(fā)[1].糞便中的致病菌往往是水源傳染性疾病的根源.世界各國通常將糞大腸菌群或大腸埃希氏菌作為指示微生物(indicator),以反映水體微生物污染狀況,但這些傳統(tǒng)指標(biāo)僅能反映出糞便污染的程度,不能識別污染的確切來源,更不能評價(jià)不同污染源的各自貢獻(xiàn)率[2].水體微生物污染源解析技術(shù)通過檢測擬桿菌[3]等宿主特異性標(biāo)記來區(qū)分不同的糞便污染源,及時(shí)提供糞便污染來源的準(zhǔn)確信息以及時(shí)有效的進(jìn)行針對性源頭控制[4].

靈敏度和特異性是水體微生物污染源解析的重要指標(biāo)[5],但宿主特異性標(biāo)記物的穩(wěn)定性卻一直被忽視,應(yīng)同樣將其作為關(guān)鍵性指標(biāo)[6].由于與腸道環(huán)境有巨大差異,擬桿菌等腸道微生物進(jìn)入水體后可能有不同程度的衰減[7],宿主特異性標(biāo)記物的穩(wěn)定性直接關(guān)系到源解析定量的準(zhǔn)確性, 其與大腸埃希氏菌等常規(guī)指示微生物的相對穩(wěn)定性也直接影響到不同指標(biāo)的可比性.已有學(xué)者對腸道微生物衰減規(guī)律開展了相關(guān)研究,如Liang等[8]發(fā)現(xiàn)擬桿菌作為專性厭氧菌在進(jìn)入自然水環(huán)境后僅能存活 1～2d甚至幾個(gè)小時(shí), Fogarty等[9]的研究表明,擬桿菌的 DNA在水體中存在數(shù)天乃至數(shù)周仍然可以被檢測到.水體營養(yǎng)程度、溶解氧含量、溫度等環(huán)境因素均可能對宿主特異性標(biāo)記物的穩(wěn)定性造成明顯影響,但現(xiàn)有研究對其闡述仍非常有限.本研究搭建了水體微生物自然變化的模擬反應(yīng)器,探究水體營養(yǎng)水平對指示微生物及宿主特異性標(biāo)記物的變化影響,以揭示宿主特異性標(biāo)記物的穩(wěn)定性及擬桿菌作為水體微生物污染定量源解析中宿主特異性標(biāo)記物來源的可行性.

1 材料與方法

1.1 樣品及試劑

樣品采集:雞糞樣品取自廣東省某農(nóng)科院畜牧養(yǎng)殖試驗(yàn)場.取新鮮雞糞于滅菌塑料取樣瓶中,置于低溫冰盒,6h內(nèi)進(jìn)行樣品處理.

主要儀器:磁力攪拌器(上海司樂儀器公司),核酸蛋白分析儀(DU730,BeckMan Coulter公司),紫外可見分光光度計(jì)(DR2800,HACH公司),冷凍離心機(jī)(Sigma公司),熒光定量 PCR儀(Light Cycler 480Ⅱ,Roche公司),溶解氧測定儀(Pro20, YSI公司).

主要試劑:水體DNA提取試劑盒(D3145-02, Magen公司),熒光染料SYBR TaqⅡ(TaKaRa公司),瓊脂糖(Biowest,電泳級),LB肉湯培養(yǎng)基(環(huán)凱生物公司),COD高量程預(yù)制試劑(HACH公司).

1.2 水環(huán)境模擬反應(yīng)器

水環(huán)境模擬反應(yīng)器的設(shè)計(jì):為模擬微生物在流動水體中的變化,將配制的10L雞糞混合液裝入直徑30cm,高為25cm的有機(jī)玻璃中,保持室內(nèi)溫度25℃,通過磁力攪拌的方式使得混合液中的微生物及微小顆粒充分混合均勻并起到復(fù)氧作用.攪拌器轉(zhuǎn)子長8cm,轉(zhuǎn)速約為170～220r/min.

水環(huán)境模擬反應(yīng)器的建立:試驗(yàn)設(shè)置2組反應(yīng)器(對照組和營養(yǎng)添加組),每組 2個(gè)平行,共 4個(gè)反應(yīng)器.稱量40g雞糞置于燒杯中,加入4L滅菌的去離子水,用玻璃棒攪拌 10min,將大顆粒糞便搗碎,再用磁力攪拌器攪拌 90min,使糞便充分混勻.為防止顆粒物隨時(shí)間溶解造成實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)波動,將雞糞混合液通過4層滅菌醫(yī)用脫脂紗布過濾2次,以去除大顆粒物,再分別用400目和500目濾網(wǎng)各過濾1次以濾去小顆粒物.將濾液均分4份后分別轉(zhuǎn)入各反應(yīng)器,并在營養(yǎng)添加組的 2個(gè)反應(yīng)器中分別加入 50mL濃度約為 20g/L的LB肉湯培養(yǎng)基,最后各反應(yīng)器加滅菌的去離子水至 10L,通過磁力攪拌器攪拌使反應(yīng)器內(nèi)水體保持混勻.

1.3 分析方法

1.3.1 水體中溶解氧的測定 將溶解氧儀的電極探頭用滅菌的去離子水洗凈,放入各反應(yīng)器的中部,保持磁力攪拌器正常攪拌,使罐內(nèi)水體混合均勻,待溶解氧儀計(jì)數(shù)穩(wěn)定后記錄數(shù)值.在磁力攪拌器的復(fù)氧作用下,添加組與對照組的溶解氧均維持在6～8.5mg/L.

1.3.2 樣品處理和 DNA的提取 用滅菌注射器分別從各反應(yīng)器中部取 200mL水樣用于COD、氨氮及分子生物學(xué)測試.COD的監(jiān)測使用HACH公司高量程(HR)重鉻酸鉀法預(yù)制試劑,氨氮的監(jiān)測采用納氏試劑分光光度法(HJ 535-2009).DNA的提取采用Magen試劑盒,用0.45μm的微孔濾膜抽濾 50mL水樣使菌體留在濾膜上,按照說明書提取留在濾膜上的菌體 DNA,放入-20℃冰箱儲存.各反應(yīng)器每天每次提取2份水樣的DNA開展平行監(jiān)測.

1.3.3 引物的選取和qPCR分析 以總細(xì)菌、大腸埃希氏菌、擬桿菌以及雞源特異性基因16S rRNA為靶序列,根據(jù)4種細(xì)菌的16S rRNA基因高度保守性,選取4對引物.引物序列如表1所示.

表1 特征生物標(biāo)記引物Table 1 Primers used in qPCR assay

圖1 四對引物擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplification of 4pairs Premiers in this study條帶1: E. coli premier; 條帶2: General Bacteroides premier; 條帶3:Total Bacteria premier; 條帶4: Chicken-specific marker premier;條帶5: DNA marker

不同引物的特異性驗(yàn)證:將雞糞混合液中提取的DNA稀釋為10ng/μL并依此為模板,對實(shí)驗(yàn)所用 4對引物進(jìn)行擴(kuò)增.擴(kuò)增體系: DNA模板(10ng/μL)1.8μL;引物(10μmol/L)各3.6μL; 2×PCR DSMix 45μL;超純水 36μL.擴(kuò)增程序: ①預(yù)變性,95℃,5min;②變性,95℃,30s;③退火,60℃,30s;④延伸,72℃,30s,35個(gè)循環(huán);⑤終延伸,72℃,5min.擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示.結(jié)果表明,條帶1、2、3、4均出現(xiàn)了目的條帶,片段大小與文獻(xiàn)[10-13]所述一致.說明4種引物都能對雞源糞便中的目的基因組進(jìn)行擴(kuò)增.將4種引物的擴(kuò)增基因序列提交至 GenBank進(jìn)行同源性比對,BLAST結(jié)果顯示(未列出),CB、GB及EC與通用引物互補(bǔ)的序列為3種目標(biāo)菌株不同株系的16S rRNA基因片段,說明這3種引物有較高的特異性.TB含有變形菌屬、不動桿菌等其它多種菌株的核酸序列.

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作:通過表1中的4對引物對提取的基因組 DNA擴(kuò)增,擴(kuò)增后的目標(biāo)產(chǎn)物進(jìn)行純化回收,連接到pMD 18-T Vector載體上,轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,用含有氨芐抗生素的平板培養(yǎng)基挑取陽性克隆,提取質(zhì)粒 DNA.測定所提取的質(zhì)粒DNA濃度,計(jì)算目的片段的拷貝數(shù).將質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋,稀釋10-1,10-2,10-3,10-4, 10-5,10-66個(gè)梯度,并依此為模板,每個(gè)梯度作為標(biāo)準(zhǔn)品設(shè)3個(gè)重復(fù),進(jìn)行熒光定量PCR.反應(yīng)結(jié)束后,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.一般認(rèn)為相關(guān)系數(shù)(R2)大于0.98,結(jié)果可信.擴(kuò)增效率(E)通過標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率來確定,兩者符合 E=10(-1/Slope)-1,如果一個(gè)反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率為-3.32,則該反應(yīng)的擴(kuò)增效率 E=100%[14].一般認(rèn)為擴(kuò)增效率(E)在 80%～120%之間是可接受的. 4對引物標(biāo)準(zhǔn)曲線如表2所示.

表2 各特征引物qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 2 Real-Time PCR standard curve of specific primers

1.3.4 qPCR分析 通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對每天從水樣中提取的DNA進(jìn)行總細(xì)菌、大腸埃希氏菌、通用性擬桿菌以及雞源特異性擬桿菌的定量檢測.qPCR擴(kuò)增體系為 20uL:SYBR?Premix Ex TaqTMII(2×)(購自TaKaRa公司)10uL;滅菌超純水6.4μL;上下游引物分別為0.8μL(表1所示4種引物);DNA模板2μL.qPCR擴(kuò)增程序:①預(yù)變性,95℃,30s;②變性,95℃,5s;③退火延伸, 60℃,1min.40個(gè)循環(huán).擴(kuò)增體系與程序參照TaKaRa公司SYBR Premix Ex TaqⅡ RR820A說明書.

2 結(jié)果與討論

2.1 營養(yǎng)水平對COD和氨氮的影響

由圖2可知,營養(yǎng)添加組中COD和氨氮的初始值為 146,6mg/L.分別比對照組高 108, 3.56mg/L.LB培養(yǎng)基內(nèi)所含物質(zhì)為細(xì)菌的生長提供了豐富的碳源、氮源、微量元素及維生素等營養(yǎng)物質(zhì),可有效促進(jìn)細(xì)菌的生長[15].細(xì)菌的降解作用造成有機(jī)物質(zhì)的降解,以致在添加初期COD快速下降,而對照組中COD下降速度較慢(圖 2a).同時(shí),兩個(gè)體系中氨氮濃度均隨著時(shí)間而逐步上升(圖2b).

研究表明,環(huán)境水體中氨氮濃度可在有氧條件下快速降低[16],而本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的趨勢與之明顯相反.本試驗(yàn)中微生物均源自新鮮雞糞,雞的腸道微生物以專性厭氧菌為主,且缺少硝化細(xì)菌等好氧細(xì)菌[17],且在 2個(gè)體系內(nèi)均檢測到 NO3--N＜ 0.3mg/L,含量較低,說明體系未發(fā)生明顯的硝化反應(yīng),從而造成氨氮的不斷積累.同時(shí),LB培養(yǎng)基的添加也給水體帶來大量的氮源,故有營養(yǎng)添加水體中氨氮的濃度相對較高.

圖2 不同營養(yǎng)水平條件下COD和氨氮濃度隨時(shí)間的變化Fig.2 Variation of concentration of COD and NH3-N as function of time under different levels of nutrition

2.2 營養(yǎng)水平對特征微生物的影響

2.2.1 特征微生物的總體變化 對不同時(shí)段的水體進(jìn)行 qPCR檢測,分析總細(xì)菌、大腸埃希氏菌、擬桿菌及雞源特異性基因的拷貝數(shù),結(jié)果如圖 3所示.在 2組試驗(yàn)中,初始拷貝數(shù)均為 TB＞GB＞EC＞CB.初期階段兩個(gè)體系的擬桿菌都出現(xiàn)了快速衰減,總細(xì)菌數(shù)和大腸埃希氏菌則波動較小.雖然LB培養(yǎng)基的添加造成2個(gè)體系營養(yǎng)水平有較大差異,但同種微生物(或基因)在不同條件下的衰減趨勢大致相同,說明水體中的營養(yǎng)物質(zhì)并未對擬桿菌、大腸埃希氏菌等指示微生物的衰減趨勢帶來顯著變化.衰減程度方面,將與初始拷貝數(shù)相比,總細(xì)菌數(shù)和大腸埃希氏菌的最終衰減倍數(shù)約為 20～40,擬桿菌和雞源特異性基因最終衰減倍數(shù)約為3000～7000.

圖3 不同營養(yǎng)水平條件下4種微生物量的變化Fig.3 Change of four microorganisms under different levels of nutrition

2.2.2 大腸埃希氏菌和擬桿菌的變化 利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對比不同微生物的衰減規(guī)律.表3數(shù)據(jù)表明,微生物衰減規(guī)律較好的符合一級動力學(xué)模型,擬合度 R2除添加組擬桿菌(0.765)外,其它均高于0.85.在95%的置信區(qū)間上對指示微生物的衰減進(jìn)行分析,兩組試驗(yàn)中衰減系數(shù)k分別為大腸埃希氏菌(0.135,0.134,前者為對照組,下同)、擬桿菌(0.415,0.457)及雞源特異性基因(0.425, 0.437),說明營養(yǎng)水平對指示微生物衰減系數(shù)的影響不顯著.

糞大腸菌群(FC)是我國唯一的微生物污染監(jiān)測指標(biāo)[18],也是目前國際上通行的監(jiān)測水質(zhì)受糞便污染的指示菌[19],由于在環(huán)境水體中存在自然增值等特征,其對病原微生物的指示存在一定的局限性[20-21].美國等部分發(fā)達(dá)國家經(jīng)過大量的流行病學(xué)研究后,摒棄了應(yīng)用已久的糞大腸菌群指標(biāo),將大腸埃希氏菌和腸球菌作為淡水的指示微生物[22].本試驗(yàn)結(jié)果表明大腸埃希氏菌在水體中衰減較慢且不受水體中營養(yǎng)物質(zhì)的影響,從可測性和穩(wěn)定性方面進(jìn)一步說明其適合作為水體微生物污染的指示菌.也有研究得到不同結(jié)論,如Byamukama等[20]在沒有已知污染源的熱帶水體中檢測到大腸埃希氏菌,但該研究沒有發(fā)現(xiàn)其自然增值的直接證據(jù),不排除該區(qū)域有野生動物等未知污染源的可能.大腸埃希氏菌作為水體微生物污染指示菌的優(yōu)劣性仍有待深入研究.

表3 特征微生物一級動力學(xué)衰減的線性回歸分析Table 3 Decay of first-order kinetics analysis of specific indicator

擬桿菌是腸道厭氧微生物中的主要代表,其在腸道環(huán)境中的數(shù)量要高于大腸埃希氏菌,作為指示微生物通常比大腸埃希氏菌更靈敏,可以更早的檢測出水體受糞便污染情況[23].但擬桿菌作為專性厭氧菌在有氧水體中呈指數(shù)級衰減(表3),且衰減系數(shù)明顯大于兼性厭氧菌大腸埃希氏菌(對照組 0.415,0.135;添加組 0.457,0.134).從圖 2還可觀察到,擬桿菌在初期衰減最為明顯,對照組及添加組中擬桿菌和大腸埃希氏菌拷貝數(shù)比例第1d分別為2.06,1.49;而第4d則分別為0.068,0.006,說明擬桿菌在有氧水體中的穩(wěn)定性較差,僅適合糞便污染的初期監(jiān)測.同時(shí),對照組及添加組中雞源特異性基因的拷貝數(shù)分別為擬桿菌的1.74%和1.15%,說明只有部分?jǐn)M桿菌在雞的腸道環(huán)境中產(chǎn)生特異性基因.從拷貝數(shù)方面分析,雞源特異性基因在試驗(yàn)初期約為大腸埃希氏菌的1.72%,而在后期甚至不到 0.01%,拷貝數(shù)僅為3000～4000,可知基于特異性基因的微生物污染源解析技術(shù)對樣品前處理及 qPCR等分析方法要求較高,環(huán)境干擾因素也可能對結(jié)果產(chǎn)生不可預(yù)期的影響.

2.3 不同指示微生物的特征

由表4可見,在不同營養(yǎng)水平的環(huán)境條件下,大腸埃希氏菌、擬桿菌及雞源特異性基因之間都具有很好的相關(guān)性(P＜0.05),均可作為良好指示菌以評價(jià)水體的微生物污染程度,但各自具有不同的特征.大腸埃希氏菌在水環(huán)境中較為穩(wěn)定,可較持久的反映出水體微生物污染水平,由于沒有特異性基因而不能識別污染來源.擬桿菌在糞便微生物中豐度較高,在有氧水體中呈現(xiàn)快速衰減趨勢,可應(yīng)用于水體微生物污染事件的時(shí)間斷定.雞源特異性基因豐度較低且衰減較快,但因可以準(zhǔn)確識別污染來源的特征使其具有不可替代性.

此外,判斷指示菌可靠性的另一個(gè)重要指標(biāo)是與病源微生物的關(guān)聯(lián)性[24].已有研究表明,大腸埃希氏菌可較好反映病原微生物的特性[25].而本試驗(yàn)并未檢測到沙門氏菌、志賀菌等致病菌的存在,可能原因?yàn)橹虏【鷿舛认鄬^低,且由于存在個(gè)體差異使致病菌在健康狀態(tài)的動物糞便中含量更低[26],以致影響試驗(yàn)測定.該結(jié)果也從另外一方面證明了將大腸埃希氏菌、雞源特異性基因等作為水體微生物污染指示菌的優(yōu)勢與必要性.

表4 不同營養(yǎng)水平條件下指示微生物間的相關(guān)性分析Table 4 Correlations analysis of specific indicator in different levels of nutrition

3 結(jié)論

3.1 總細(xì)菌、大腸埃希氏菌、擬桿菌及雞源特異性基因衰減規(guī)律較好的符合一級動力學(xué)模型.與初始拷貝數(shù)相比,擬桿菌和雞源特異性基因最終衰減倍數(shù)約為 3000～7000,大腸埃希氏菌為20～40.擬桿菌和雞源特異性基因相比大腸埃希氏菌在有氧水體中穩(wěn)定性較差.

3.2 擬桿菌的衰減系數(shù)分別為 0.415,0.457(前者為對照組,下同);雞源特異性基因?yàn)?0.425, 0.437;大腸埃希氏菌為 0.135,0.134.營養(yǎng)水平對大腸埃希氏菌、擬桿菌及雞源特異性基因等指示微生物的衰減系數(shù)未產(chǎn)生顯著影響

3.3 不同營養(yǎng)水平下,大腸埃希氏菌與擬桿菌(P＜0.01)及雞源特異性基因(P＜0.005),擬桿菌與雞源特異性基因(P＜0.001)之間具有顯著的相關(guān)性,說明3種指示菌均可用于評價(jià)水體的微生物污染程度,但特征各異.

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Stability analysis of microbial pollution indicators in water under different nutrient levels.

ZHANG Yang1, JIA Le-hua4, WU Ren-ren2,5*, CHEN Zhong-ying2,5, LI Kai-ming2,5, ZHANG Yi-min1,3(1.College of Resources and Environment Engineering, Wuhan University of Technology, Wuhan 430070, China；2.South China Institute of Environmental Sciences, Ministry of Environmental Protection, Guangzhou 510640, China；3.College of Resources and Environment Engineering, Wuhan University of Science and Technology, Wuhan 430081, China；4.School of Bioscience and Bioengineering, South China University of Technology, Guangzhou 510006, China；5.The key Laboratory of Water and Air Pollution Control of Guangdong Province, Guangzhou 510655, China). China Environmental Science, 2017,37(3)：1130～1136

Sensitivity and specificity have been used to assess the performance of fecal indicator in microbial source tracking. However, it is also important to characterize the stability of fecal indicators in aquatic habitats. In this study, indicators decay microcosm in aerobic circumstance was deployed. Decay characteristics of Escherichia coli(EC), Bacteroides (GB) and Chicken-specific marker(CB) in different nutrition condition was evaluated based on real-time quantitative PCR assay. The results indicated that decay rate of three indicators was fit to first-order kinetics. In the control group and experimental system that contain high nutrients levels indicates the attenuation coefficient k of EC (0.135vs. 0.134, the former as the control group, below the same as above), GB (0.415vs. 0.457), CB (0.425vs. 0.437) respectively. The effect of nutrition level on the decay rate of EC, GB and CB was inconspicuous. EC decayed gradually when compared with the severe attenuation of BC and CB. Although significant mutual linear correlationship of different indicators was observed, different characteristics of each indicator related to decay rate should specially be taken into consideration for further application.

microbial source tracking；microbial indicator；decay；nutrition；dissolved oxygen

X172,X52

A

1000-6923(2017)03-1130-07

張 楊(1988-),男,寧夏銀川人,武漢理工大學(xué)與環(huán)境保護(hù)部華南環(huán)境科學(xué)研究所聯(lián)合培養(yǎng)碩士研究生,主要從事環(huán)境微生物研究.

2016-07-11

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(41303054);中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)專項(xiàng)

* 責(zé)任作者, 副研究員, wurenren@scies.org