轉(zhuǎn)基因作物對土壤微生物多樣性影響的研究方法

梁晉剛 張秀杰

（農(nóng)業(yè)部科技發(fā)展中心，北京 100122）

轉(zhuǎn)基因作物對土壤微生物多樣性影響的研究方法

梁晉剛 張秀杰

（農(nóng)業(yè)部科技發(fā)展中心，北京 100122）

土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的一個(gè)重要組成部分，對土壤中的生物化學(xué)循環(huán)起著不可替代的驅(qū)動(dòng)作用。轉(zhuǎn)基因作物在生長過程中會(huì)不可避免地與土壤微生物發(fā)生交流，開展轉(zhuǎn)基因作物對土壤微生物群落影響的研究對于科學(xué)評價(jià)轉(zhuǎn)基因作物的潛在風(fēng)險(xiǎn)具有重要意義。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的不斷發(fā)展，土壤微生物多樣性及其分析方法已經(jīng)從傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)發(fā)展到從種群角度去研究整個(gè)土壤微生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)的微生物。但是由于土壤微生物的各種特性（如大部分不可培養(yǎng)、體積微小及群體效應(yīng)等）和儀器設(shè)備檢測性能的局限性，單一的研究方法會(huì)存在一些弊端，還需要結(jié)合其他的手段共同研究土壤生態(tài)系統(tǒng)中的微生物多樣性。目前，人們對土壤微生物多樣性的研究主要包括物種多樣性、功能多樣性、結(jié)構(gòu)多樣性及遺傳多樣性等4個(gè)方面，國內(nèi)外關(guān)于轉(zhuǎn)基因作物對土壤微生物多樣性及其群落結(jié)構(gòu)影響的研究方法很多，對常見的研究方法進(jìn)行了總結(jié)，并提出了今后轉(zhuǎn)基因作物對土壤微生物多樣性及群落結(jié)構(gòu)影響的研究策略。

轉(zhuǎn)基因作物；土壤微生物；多樣性；研究策略

土壤微生物多樣性是指土壤生態(tài)系統(tǒng)中所包含的微生物的種類、這些微生物所攜帶的基因及其與環(huán)境之間相互關(guān)聯(lián)的多樣化程度等。目前，對土壤微生物多樣性影響的研究方法大致可歸為3類，即基于傳統(tǒng)的培養(yǎng)分離法、基于生物化學(xué)成分分析法和基于現(xiàn)代分子水平的分析法［3］。在本文中，分析了幾種常用于轉(zhuǎn)基因作物對土壤微生物多樣性影響的研究方法，可望通過綜合使用多種方法以得到更加真實(shí)準(zhǔn)確的研究數(shù)據(jù)。

1 微生物培養(yǎng)計(jì)數(shù)法

土壤微生物的物種多樣性是指土壤中微生物的物種豐富度以及均一度等指標(biāo)的多樣性，目前主要通過傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)法來研究土壤中可培養(yǎng)微生物的物種多樣性。微生物平板培養(yǎng)法是一種傳統(tǒng)的方法，它根據(jù)靶標(biāo)微生物特性，采用相應(yīng)的特定培養(yǎng)基對土壤中的微生物進(jìn)行培養(yǎng)分離［4］。但由于培養(yǎng)技術(shù)和方法的局限性，使得能夠被培養(yǎng)的土壤微生物物種的數(shù)量只占實(shí)際微生物總數(shù)的0.1%-1%，因此不能提供反映微生物群落結(jié)構(gòu)與物種多樣性的絕大部分信息［5-6］。但這種傳統(tǒng)培養(yǎng)方法所發(fā)揮的作用不容忽視。

由于方法簡單方便，至今仍然是一種不可替代的研究手段。Zeng等［7］通過平板培養(yǎng)試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)BcWRKY1基因耐鹽玉米對土壤細(xì)菌、真菌和放線菌數(shù)量均沒有顯著性影響。Wu等［8］通過平板培養(yǎng)試驗(yàn)，結(jié)果也表明添加轉(zhuǎn)CryIAb基因水稻品系稻桿的土壤中可培養(yǎng)細(xì)菌、放線菌和真菌的數(shù)量，與添加非轉(zhuǎn)基因水稻品系稻桿的土壤中的相比，沒有顯著差異；而氨氧化細(xì)菌、固氮細(xì)菌和纖維素降解細(xì)菌的種群數(shù)量在試驗(yàn)中期出現(xiàn)暫時(shí)的顯著性差異。周琳等［9］對轉(zhuǎn)chi+rip雙價(jià)抗真菌基因大豆G0431及其親本非轉(zhuǎn)基因大豆黑農(nóng)35種植后的根部土壤可培養(yǎng)微生物進(jìn)行平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)，發(fā)現(xiàn)二者根部土壤中的可培養(yǎng)細(xì)菌、真菌和放線菌的數(shù)量并無顯著差異。Zhang等［10］采用平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)方法研究發(fā)現(xiàn)，與受體品種相比，轉(zhuǎn)CrylAc和CpTI基因棉花SGK321對根際細(xì)菌、真菌和放線菌群落數(shù)量沒有顯著性影響。燕麗萍等［11］采用平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)法，以轉(zhuǎn)BADH基因苜蓿和非轉(zhuǎn)基因苜蓿為材料，連續(xù)2年測定這兩種苜蓿根際可培養(yǎng)細(xì)菌、放線菌和真菌數(shù)量的變化，結(jié)果表明，不同年份和不同月份轉(zhuǎn)基因苜蓿與非轉(zhuǎn)基因苜蓿根際土壤3大類可培養(yǎng)微生物數(shù)量變化的趨勢一致。

由于微生物群落及其生存環(huán)境的復(fù)雜多變，在進(jìn)行新培養(yǎng)技術(shù)的研發(fā)和實(shí)際應(yīng)用的同時(shí)，還應(yīng)結(jié)合現(xiàn)代生物技術(shù)方法，才能更客觀、全面地反映出微生物群落結(jié)構(gòu)與物種多樣性的真實(shí)信息。

2 生物標(biāo)記物法——磷脂脂肪酸圖譜分析

土壤微生物的結(jié)構(gòu)多樣性是指土壤生態(tài)系統(tǒng)中微生物的細(xì)胞結(jié)構(gòu)組分等方面的多樣化程度，這是導(dǎo)致微生物代謝方式和生理功能多樣化等的直接原因。目前一般采用生物標(biāo)記法來研究土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的組成。生物標(biāo)記物通常是細(xì)胞外分泌產(chǎn)物或微生物細(xì)胞的生化組成成分，它的總量一般與對應(yīng)的生物量呈正相關(guān)。因此，對特異的生物標(biāo)記物種類及豐度進(jìn)行檢測可間接反映出樣本中的微生物種類、豐度及群落結(jié)構(gòu)，最主要的生物標(biāo)記物分析法是磷脂脂肪酸法［3，12］。磷脂脂肪酸（Phospholipid fatty acid，PLFA）是細(xì)胞膜的重要組成成分之一，不同類群的微生物可形成特定的PLFA。該方法通過直接提取根際微生物的脂肪酸，能夠直觀地反映出根際微生物群落的組成［13］。

Nam等［14］采用PFLA方法，研究了高水平表達(dá)細(xì)胞分裂素的轉(zhuǎn)基因楊樹品系T1403、T1410和T1413對土壤微生物的影響發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因楊樹與受體楊樹相比，對根際微生物存在暫時(shí)的影響。桂恒等［15］利用PLFA方法分析了富含硫氨基酸轉(zhuǎn)基因大豆對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果表明，與非轉(zhuǎn)基因大豆相比，轉(zhuǎn)基因大豆品系根際微生物群落的結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的變化。李永山等［16］利用PLFA方法研究了轉(zhuǎn)Bt基因棉花對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化的影響發(fā)現(xiàn)，與受體棉花相比，轉(zhuǎn)基因棉花的種植增加了土壤微生物PLFA的含量。

PLFA分析法主要表現(xiàn)在不需要對土壤微生物進(jìn)行分離培養(yǎng)，避免了人為分離培養(yǎng)過程中的誤差，同時(shí)也可涵蓋土壤中大部分不能被培養(yǎng)的微生物。但是，PLFA分析法不能將土壤中存在的某些脂肪酸與特定微生物對應(yīng)起來，不能從物種的水平上對微生物進(jìn)行描述，不同種類微生物的特征脂肪酸也可能發(fā)生重疊［17］。因此，在采用PLFA方法對土壤微生物群落多樣性分析時(shí)，還需結(jié)合其他研究方法，才能得到更客觀真實(shí)的結(jié)果。

3 Biolog ECO微平板法

土壤微生物群落功能多樣性是指土壤微生物能夠執(zhí)行的功能范圍及過程，包括氧化還原、分解轉(zhuǎn)化、營養(yǎng)傳遞等功能，是描述土壤微生物群落特征的一個(gè)重要指標(biāo)。對土壤生態(tài)系統(tǒng)中微生物功能多樣性的研究最為常用的方法是Biolog微平板分析法。Biolog ECO微平板是特別為群落分析和微生態(tài)研究設(shè)計(jì)的，包含用于土壤群落分析最常用的31種碳源，通過測定并分析不同微生物群落對Biolog ECO微平板中各種單一碳源底物的利用能力的差異，從而獲得微生物群落功能多樣性方面的信息［1］。將Biolog ECO微平板應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因作物對根際微生物群落功能影響的分析，為評價(jià)轉(zhuǎn)基因作物對土壤微生物的影響提供了新的思路。

陳豐等［18］利用Biolog ECO系統(tǒng)分析了富含硫氨基酸轉(zhuǎn)基因大豆對土壤微生物群落功能多樣性的影響，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因大豆根際微生物群落功能多樣性與受體大豆的相比，二者之間沒有顯著性差異。Liang等［19］通過Biolog ECO微孔板分析了轉(zhuǎn)基因高蛋氨酸大豆對根際微生物群落碳代謝功能的影響，結(jié)果表明，與受體大豆相比，轉(zhuǎn)基因大豆對根際微生物功能多樣性無顯著性影響。Wei等［20］利用Biolog ECO系統(tǒng)分析了轉(zhuǎn)Bt基因水稻SHK601對根際微生物群落功能的影響，結(jié)果表明，與受體水稻相比，轉(zhuǎn)基因水稻對根際微生物群落功能有短暫影響。

Biolog ECO微孔板試驗(yàn)成本較高，檢測的主要是代謝能力較強(qiáng)的微生物，且外部培養(yǎng)環(huán)境的改變有可能引起微生物對底物利用的改變［21］。此外，Biolog ECO微孔板所表征的代謝多樣性并不能完全代表原位生態(tài)系統(tǒng)中微生物代謝的多樣性［22］。所以，Biolog ECO微孔板在準(zhǔn)確性方面仍有一定的局限性，使用Biolog ECO微孔板法時(shí)，如能結(jié)合其他研究方法，依然可獲得較全面的結(jié)果。

4 現(xiàn)代分子生物學(xué)方法

土壤微生物的遺傳多樣性是指土壤生態(tài)系統(tǒng)中的微生物在基因水平上所攜帶的遺傳物質(zhì)和遺傳信息的總和。土壤微生物遺傳多樣性的分析方法主要是基于PCR的分析方法。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，直接提取土壤微生物總DNA并進(jìn)行分子生物學(xué)分析，可有效避免傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)過程中不可培養(yǎng)微生物的丟失，達(dá)到更直接、可靠、全面的了解土壤微生物群落原始組成的目的。這些分子生物學(xué)方法主要包括變性梯度凝膠電泳（Denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR和16S rRNA基因（16S rDNA）可變區(qū)擴(kuò)增子高通量測序、宏基因組高通量測序及生物信息學(xué)分析等方法。

4.1 變性梯度凝膠電泳（DGGE）圖譜技術(shù)

DGGE的原理是長度相同但序列不同的DNA片段在含有變性劑并呈梯度分布的聚丙烯酰胺凝膠上，因解鏈行為不同而導(dǎo)致遷移速率不同［23］。該技術(shù)已經(jīng)發(fā)展成為研究微生物群落結(jié)構(gòu)的主要分子生物學(xué)方法之一。目前，國內(nèi)外很多學(xué)者運(yùn)用DGGE技術(shù)進(jìn)行了轉(zhuǎn)基因作物對根際微生物影響的研究。

浦傳亮等［24］采用該技術(shù)對轉(zhuǎn)基因高蛋氨酸大豆根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，結(jié)果表明，與受體大豆相比，轉(zhuǎn)基因高蛋氨酸大豆對根際細(xì)菌群落多樣性有一定的降低作用，但這一作用隨大豆的生長而逐漸減弱，到成熟期已完全消失。Wu等［25］運(yùn)用該技術(shù)分析了抗小麥黃花葉病毒轉(zhuǎn)基因小麥對根際細(xì)菌、真菌群落結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果表明，與受體小麥相比，轉(zhuǎn)基因抗病小麥對根際細(xì)菌、真菌群落結(jié)構(gòu)沒有顯著影響。Wei等［20］利用該技術(shù)分析了轉(zhuǎn)Bt基因水稻SHK601對根際細(xì)菌、真菌和放線菌群落結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果表明，與受體水稻相比，轉(zhuǎn)基因水稻對根際微生物群落結(jié)構(gòu)無顯著性影響。Weinert等［26］利用該技術(shù)分析產(chǎn)玉米黃質(zhì)轉(zhuǎn)基因馬鈴薯根際微生物的變化，發(fā)現(xiàn)馬鈴薯不同品種對植物根際細(xì)菌和真菌種群的影響要遠(yuǎn)大于轉(zhuǎn)基因因素。Zhang和Xie等［27-28］分別利用該技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，與受體棉花相比，轉(zhuǎn)Cry1Ab/Ac基因棉花對根際真菌、放線菌群落結(jié)構(gòu)沒有顯著性影響。

雖然DGGE技術(shù)在分析土壤微生物多樣性方面有很多優(yōu)勢，也已經(jīng)普遍應(yīng)用到土壤微生物群落多樣性分析的研究中，但是DGGE技術(shù)也存在一些不足之處。例如，只能分離較小的片段，不易鑒定到種的水平，PCR產(chǎn)物的突變和DGGE電泳時(shí)出現(xiàn)的共遷移都可能影響結(jié)果的準(zhǔn)確性，耗時(shí)耗力，而且只能檢測土壤中很小一部分微生物等［29］。

4.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)

實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)基本原理是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)度，并通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對待測樣品進(jìn)行定量分析。目前，該技術(shù)已廣泛應(yīng)用到轉(zhuǎn)基因作物對土壤微生物影響的研究中。

該方法可以定量檢測土壤中目的菌種的含量以及分布等信息。Liang等［30］利用該技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，與受體大豆相比，轉(zhuǎn)基因高蛋氨酸大豆ZD91對根際固氮細(xì)菌、氨氧化細(xì)菌和反硝化細(xì)菌數(shù)量無顯著性影響。杜娟等［31］運(yùn)用該技術(shù)分析了轉(zhuǎn)TaDREB4基因抗旱小麥根際中熒光假單胞菌數(shù)量的變化，結(jié)果表明各生育期轉(zhuǎn)基因小麥和非轉(zhuǎn)基因小麥的根際中熒光假單胞菌的拷貝數(shù)之間無顯著差異。Zhang和Xie等［27-28］分別利用該技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，與受體棉花相比，轉(zhuǎn)Cry1Ab/Ac基因棉花對根際真菌、放線菌數(shù)量沒有顯著性影響。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR具有高靈敏度、高精度、高特異性、實(shí)時(shí)性等優(yōu)點(diǎn)，但是，該技術(shù)也有一些不足之處，如成本比較高，操作時(shí)還要考慮同源和異源DNA的背景、寡核苷酸雜交的特異性、熒光染料或特異性探針的濃度，以及PCR產(chǎn)物的大小等因素，這些因素都會(huì)引起結(jié)果的偏差。

4.3 高通量測序及生物信息學(xué)方法

高通量測序技術(shù)能夠?qū)?shù)以百萬計(jì)的DNA分子進(jìn)行同時(shí)測序，不需要對各單一種類的微生物個(gè)體進(jìn)行分離和培養(yǎng)，已廣泛應(yīng)用于土壤微生物遺傳多樣性的研究領(lǐng)域中［32］。

4.3.1 土壤樣品中微生物可變區(qū)擴(kuò)增子高通量測序 首先提取樣品中微生物總DNA，然后運(yùn)用PCR技術(shù)擴(kuò)增細(xì)菌基因組中的16S rDNA、真菌基因組中的18S rDNA或ITS區(qū)域，獲得絕大部分微生物16S rDNA、18S rDNA或ITS高可變區(qū)的擴(kuò)增產(chǎn)物，并構(gòu)建擴(kuò)增產(chǎn)物的文庫，利用第二代測序平臺進(jìn)行大規(guī)模高通量測序，然后比較分析測序數(shù)據(jù)，該方法最近幾年已廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因作物對土壤微生物群落多樣性影響的研究。

4.3.2 土壤樣品中微生物宏基因組測序 土壤的宏基因組測序也稱全基因組測序，首先提取土壤中的微生物群體基因組DNA，然后把這些微生物的基因組DNA用鳥槍法建庫，檢測合格后，利用高通量測序平臺，原始數(shù)據(jù)經(jīng)過數(shù)據(jù)處理分析，研究土壤中微生物的群體的多樣性等指標(biāo)，相比16S rDNA可變區(qū)擴(kuò)增子高通量測序，該測序方法能夠更全面的分析微生物的物種及基因等方面的多樣性。

Liang等［30，33］通過 Pyrosequencing測序和克隆文庫構(gòu)建的方法，研究了轉(zhuǎn)基因高蛋氨酸大豆ZD91對根際細(xì)菌和叢枝菌根真菌群落結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因大豆ZD91對根際細(xì)菌和叢枝菌根真菌群落結(jié)構(gòu)沒有顯著性影響，且發(fā)現(xiàn)大豆生長時(shí)期和年份是主要的影響因素。Lu等［34］利用Illumina Miseq測序平臺研究了轉(zhuǎn)基因耐草甘膦大豆NZL06-698對根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因大豆NZL06-698對細(xì)菌alpha多樣性指數(shù)沒有顯著性影響，然而對beta多樣性指數(shù)有影響，且對包括固氮菌在內(nèi)的部分細(xì)菌門和屬有顯著性影響。Lu等［35］利用Metagenome Sequencing分析了轉(zhuǎn)基因耐草甘膦大豆ZUTS31在鼓粒期對根際微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果表明，與清水處理對照相比，噴施草甘膦的轉(zhuǎn)基因大豆ZUTS31對根際細(xì)菌alpha和beta多樣性指數(shù)沒有顯著性影響，然而氮固定相關(guān)基因相對豐度顯著性降低，產(chǎn)生的原因和機(jī)制目前還不清楚。

此類方法可準(zhǔn)確檢測不同基因型植物的根際微生物群落組成、結(jié)構(gòu)、多樣性及相對豐度差異，是判斷和評價(jià)不同基因型植物對土壤微生物影響的重要方法之一，也是評估轉(zhuǎn)基因作物對土壤微生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)的重要手段。

5 展望

轉(zhuǎn)基因作物被引入到農(nóng)田后對包含土壤微生物在內(nèi)的土壤生態(tài)系統(tǒng)的潛在風(fēng)險(xiǎn)已受到人們的廣泛關(guān)注。目前，隨著DNA高通量測序技術(shù)飛速發(fā)展，測序成本明顯下降，16S rDNA測序等高通量方法為研究微生物群落結(jié)構(gòu)與功能等提供了一種新的選擇，同時(shí)為研究轉(zhuǎn)基因作物種植對土壤微生物多樣性的影響提供了一種重要的評價(jià)手段。另外，由于土壤微生物群落組成復(fù)雜，將各種技術(shù)方法有機(jī)結(jié)合起來全面反映根際微生物群落結(jié)構(gòu)組成與多樣性已成為研究的必然趨勢。

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Strategies for Evaluating the Effects of Transgenic Crops on Soil Microbial Diversity

LIANG Jin-gang ZHANG Xiu-jie
（Development Center of Science and Technology，Ministry of Agriculture，Beijing 100122）

Microorganisms are the important components of the soil ecosystem. Soil microbial diversity is crucial to the maintenance of ecosystem functioning as soil microorganisms influence many ecosystem processes and drive biogeochemical cycles. Thus，it becomes a hot topic about the potential risks of transgenic crops to soil microorganisms and their effects on soil ecosystem. With the development of modern biotechnologies，the analysis methods for soil microbial diversity have been developed from the traditional separation culture to study microorganisms in the whole soil microecosystem. However，due to the various characteristics of soil microorganisms（such as majority being non-cultivable，tiny bulk，community quorum sensing，etc.）and the detection limitations of instruments and equipment，there are some disadvantages while only using single research method，and other methods should be combined to study microbial diversity in soil ecosystem.So far，the study on soil microbial diversity mainly includes species diversity，functional diversity，structural diversity and genetic diversity，there are a lot of methods used to study the effects of transgenic crops on the diversity of soil microorganisms. In this review，we summarize these methods，and finally the strategies for the future study are proposed.

transgenic crops；soil microorganisms；diversity；strategies

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0491

土壤是生物與環(huán)境之間物質(zhì)循環(huán)和能量轉(zhuǎn)化的重要場所之一，其中蘊(yùn)含著豐富的微生物資源。土壤微生物參與土壤中諸多的生物化學(xué)過程，包括土壤有機(jī)質(zhì)的分解、腐殖質(zhì)的形成、氮磷鉀碳等營養(yǎng)元素的轉(zhuǎn)化和循環(huán)、菌根的形成等，是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分［1］。轉(zhuǎn)基因作物及其外源基因表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)入土壤后，可能與土壤微生物相互作用而影響微生物的活動(dòng)過程［2］。因此，轉(zhuǎn)基因作物對土壤微生物數(shù)量、群落功能、結(jié)構(gòu)多樣性的影響是評價(jià)轉(zhuǎn)基因作物環(huán)境安全性的重要指標(biāo)之一。

2017-06-11

轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專項(xiàng)（2016ZX08012003，2016ZX08011-003）

梁晉剛，男，博士，農(nóng)藝師，研究方向：轉(zhuǎn)基因生物安全評價(jià)與檢測；E-mail：382408162@qq.com

張秀杰，女，副研究員，研究方向：轉(zhuǎn)基因生物安全評價(jià)與檢測；E-mail：zhxj7410@sina.com

（責(zé)任編輯 狄艷紅）