血清白蛋白與抗腫瘤藥物莪術(shù)醇的相互作用關(guān)系

齊燕姣,陸會寧,金能智

(1.西北民族大學(xué)榆中校區(qū)化工學(xué)院， 蘭州 730124;2. 西北民族大學(xué)榆中校區(qū)生命科學(xué)與工程學(xué)院， 蘭州 730124;3. 甘肅省計算中心， 蘭州 730000)

血清白蛋白與抗腫瘤藥物莪術(shù)醇的相互作用關(guān)系

齊燕姣1*,陸會寧2,金能智3

(1.西北民族大學(xué)榆中校區(qū)化工學(xué)院， 蘭州 730124;2. 西北民族大學(xué)榆中校區(qū)生命科學(xué)與工程學(xué)院， 蘭州 730124;3. 甘肅省計算中心， 蘭州 730000)

莪術(shù)醇是近年來發(fā)現(xiàn)的重要的新的抗腫瘤中藥單體之一。分析莪術(shù)醇與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白—血清白蛋白之間的相互作用能夠幫助研究者更好的理解藥物的作用機(jī)制。本文通過用多序列分析、進(jìn)化關(guān)系和分子對接技術(shù)等分析莪術(shù)醇與人血清白蛋白相互作用位點及其在其他親緣關(guān)系較近的物種中的特點。結(jié)果表明,莪術(shù)醇與人血清白蛋白相互作用的結(jié)合位點II和III處周圍幾乎都是疏水性的氨基酸，分子間的疏水作用起著很重要的作用，其最低結(jié)合能分別是-7.22 Kcal/mol和-8.34 Kcal/mol。莪術(shù)醇與人血清白蛋白之間的作用位點在其他親緣關(guān)系較近的狼(Canislupus)、綿羊(Ovine)、牦牛(Bosmutus)、家牛(BosTaurus)物種中都較為保守，少數(shù)有變化的氨基酸基本是在極性相同的氨基酸之間發(fā)生的。與分子相互作用前的結(jié)構(gòu)相比，莪術(shù)醇中的羥基的結(jié)構(gòu)在活性位點處發(fā)生了最明顯的變化。

莪術(shù)醇； 血清白蛋白； 相互作用； 序列比對； 親緣關(guān)系

血清白蛋白(Serum albumin，SA)是一種球狀蛋白質(zhì)，是機(jī)體循環(huán)系統(tǒng)中含量最豐富的儲存與運(yùn)輸?shù)鞍?有許多重要的生理學(xué)與藥理學(xué)功能，能與許多內(nèi)源和外源性物質(zhì)如脂肪酸、氨基酸、荷爾蒙，陰陽離子和藥物等結(jié)合[1]。血清白蛋白對藥物的藥代動力學(xué)特別是其在人體中的分布有著重要的作用，大部分藥物成分在生物體中的運(yùn)轉(zhuǎn)首先通過與血清白蛋白的結(jié)合，然后到達(dá)靶標(biāo)組織起到存儲和轉(zhuǎn)運(yùn)作用。因此血清白蛋白已成為研究最廣泛的目標(biāo)蛋白之一。血清白蛋白來源廣泛，其中由于人血清白蛋白(HSA)與牛血清白蛋白(BSA)分子被相關(guān)研究人員廣泛采用為模型生物大分子。

HSA的三維晶體結(jié)構(gòu)顯示，人血清蛋白球狀高級結(jié)構(gòu)可分為三個結(jié)構(gòu)域，從N端開始依次為區(qū)域I (殘基1-195)，區(qū)域II (殘基196-383) 和區(qū)域III (殘基394-585)，它們均是由α-螺旋體反向平行而成，每個結(jié)構(gòu)域有槽口相對的兩個疏水性空腔。亞域 (Sub domain A和Sub domain B) 形成圓筒狀結(jié)構(gòu)，幾乎所有的疏水性氨基酸都包埋在此圓筒腔內(nèi)部，構(gòu)成疏水性腔。大多數(shù)藥物在血清白蛋白上的結(jié)合部位為亞結(jié)構(gòu)域IIA和IIIA，其中IIIA的活性最高[2]。除此之外，HSA分子內(nèi)還有諸如β-折疊、回轉(zhuǎn)以及無規(guī)卷曲等二級結(jié)構(gòu)類型。晶體衍射實驗表明血清白蛋白呈心臟形構(gòu)象[3]。然而，到目前為止，其他物種特別是一些與人類親緣關(guān)系較近的哺乳動物上的血清白蛋白的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)等的了解都還比較少。

隨著人們對人工合成藥物的毒副作用認(rèn)識水平越來越深入，人們更傾向于使用天然藥物。近年來關(guān)于天然植物的藥用成分[4-6]，特別是傳統(tǒng)中藥的有效成分與SA的相互作用已經(jīng)初步引起了國內(nèi)外學(xué)術(shù)界的普遍關(guān)注[7-12]。而基于中藥小分子與生物大分子的相互作用也是中藥現(xiàn)代化研究中藥藥理機(jī)制的主要內(nèi)容之一。莪術(shù)醇(Curcumol)又名姜黃環(huán)奧醇，為具有半縮酮的氫化奧類化合物，由五元環(huán)和六元環(huán)并合而成(見圖1)。其中的七元環(huán)通過半縮酮的氧橋，又形成了一個五元環(huán)和六元環(huán)，使得三個環(huán)的張力變小，形成了具有剛性結(jié)構(gòu)的較穩(wěn)定的化合物。莪術(shù)醇主要有抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗炎，抗血栓等藥理作用，是新的抗腫瘤中藥單體之一。與許多傳統(tǒng)藥物相比，它還具有無致突變性、低毒、安全可靠，對多種疾病有效的優(yōu)點。莪術(shù)醇能明顯抑制CASKI細(xì)胞的體外增殖，且可阻滯CASKI細(xì)胞周期于G2M期并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13]，同時對胃癌[14]、卵巢癌[15]、肺癌[16]、肝癌[17]等細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用。近年來，藥物與血清白蛋白的相互作用的研究越來越多。但是到目前為止，天然產(chǎn)物和人工合成類藥物與血清白蛋白的相互作用大部分都基于人和牛[18-24]的，由于各種限制條件，例如晶體結(jié)構(gòu)還未獲得、物種資源稀缺等，所以在其他物種上研究較少。通過用生物信息學(xué)的方法分析不同物種的血清白蛋白的特點和進(jìn)化關(guān)系，分析莪術(shù)醇與人血清白蛋白相互作用位點及其在其他親緣關(guān)系較近的物種中相應(yīng)的氨基酸變化特點，通過分析血清白蛋白的疏水性及其與莪術(shù)醇結(jié)合位點處的氨基酸特征，進(jìn)一步了解其他物種的血清白蛋白的結(jié)構(gòu)特點，以及為分析莪術(shù)醇在其他物種中的相互作用等提供理論依據(jù)。

圖1 莪術(shù)醇的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of curcumol

1 材料和方法

1.1 蛋白質(zhì)序列來源

蛋白質(zhì)的氨基酸序列從NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed)上下載，人血清白蛋白與莪術(shù)醇的復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)是從PDB數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)中下載(PDB：1BM0)。

1.2 蛋白質(zhì)序列分析

通過ClustalX軟件[25]進(jìn)行了多序列比對的分析；利用Lasergene軟件[26]來執(zhí)行蛋白質(zhì)的氨基酸序列長度和組成以及等電點的分析；利用MegAlign軟件中Lipman-Pearson方法[27]進(jìn)行了序列的相似性分析；采用DNAMAN (version 4.0, Lynnon Biosoft, Quebec, Canada) 和ExPAsy的ProtScale程序分析蛋白質(zhì)的疏水性(http://web.expasy.org/protscale/)[28]?；贘ones-Taylor-Thornton (JTT)模型，采取缺失序列刪除的方式，用MEGA的Neighbor-Joining (NJ)方法構(gòu)建進(jìn)化樹[29]，Bootstrap Replications 設(shè)置為1 000。

1.3 小分子的準(zhǔn)備

在Pubchem上下載小分子米格列醇的結(jié)構(gòu)，然后通過軟件Chem3D的MM2法做構(gòu)型優(yōu)化[30]，精確度為0.001。通過Gaussian軟件的密度泛函理論B3LYP的方法和6-31G (D)的基組做進(jìn)一步的幾何優(yōu)化。通過AutoDock4.2來進(jìn)行分子的半柔性對接，采用Lamarckian遺傳算法(LGA)，能量評估次數(shù)使用最大次數(shù)25 000 000，突變率設(shè)置為0.02，交叉率為0.80，最大迭代次數(shù)是300。以藥物小分子為中心的格子尺寸定義為6 nm× 6 nm× 6 nm，間隔為0.037 5 nm，最終得到的50個對接的構(gòu)象中能量最小的作為穩(wěn)定構(gòu)象作進(jìn)一步的分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)序列基本情況分析

不同物種的血清白蛋白序列名稱及其不同類型氨基酸組成等性質(zhì)如表1所示。其中大部分物種的血清白蛋白的氨基酸序列長度比較接近，其中疏水性的氨基酸和極性的氨基酸占有較大的比例。蛋白質(zhì)等電點是指由于蛋白質(zhì)表面離子化側(cè)鏈的存在，使其帶有凈電荷。由于這些側(cè)鏈都是可以滴定的，對于每個蛋白都存在一個pH使它的表面凈電荷為零，即等電點。蛋白質(zhì)在等電點時，其溶解度最小，最易形成沉淀物，表1中的不同物種血清白蛋白的等電點都在5～9之間，但是不同的蛋白質(zhì)其等電點的值也不相同，說明了不同的性質(zhì)，如黏度、膨脹性、滲透壓等[31-32]。

2.2 莪術(shù)醇與血清白蛋白相互作用的關(guān)鍵位點分析

莪術(shù)醇與人血清白蛋白相互作用研究表明，莪術(shù)醇與人血清白蛋白相互作用的結(jié)合位點II深深位于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中的一個疏水性口袋中，其最低結(jié)合能是-7.22 Kcal/mol，周圍的氨基酸殘基有：Leu-219, Phe223, Arg-222, Leu234, Leu238, Val-241, His-242, Arg-257, Leu-260, Ala-261, Ile264, Ser-287, Ala-291, 如圖2(a)所示。

表1 血清白蛋白的序列名稱及氨基酸組成Table 1 Name and composition of serum albumin amino acid sequences from different sources

圖2 莪術(shù)醇與人血清白蛋白相互作用位點Fig.2 Active sites between the curcumol and homo sapiens serum albumin

為了分析莪術(shù)醇與血清白蛋白相互作用的周圍氨基酸是否在其他物種中是保守的，本文選取了與人(Homosapiens)親緣關(guān)系較近的狼(Canislupus)、牦牛(Bosmutus)、家牛(Bostaurus)和綿羊(Ovine)的血清白蛋白序列進(jìn)行了多序列比對。其中人與親緣關(guān)系較近的家牛、狼、綿羊和牦牛的序列相似性分別是 79.3%、76.2%、74.7%和76.0%，系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系(見圖3)表明，家牛、狼、綿羊和牦牛與人類的親緣關(guān)系較近，序列的相似性均在74%以上。

圖3 血清白蛋白序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of serum albumin sequences

從多序列比對圖4中可以看到，其中紅色框中的氨基酸代表莪術(shù)醇與人血清白蛋白相互結(jié)合點處的氨基酸，黃色背景的氨基酸表示其他物種中與人不同的氨基酸位點。結(jié)果表明人血清白蛋白與莪術(shù)醇相互作用關(guān)鍵位點II(見圖4(a))在其他親緣關(guān)系較近的物種中來說比較保守，只有3處位置是不同的。例如在人血清白蛋白的Arg222處是親水性氨基酸，而在牦牛、家牛和綿羊中對應(yīng)是賴氨酸，不過也是親水性氨基酸。Ile264處的疏水性氨基酸對應(yīng)在狼血清白蛋白上的是疏水性蛋氨酸，其他物種上仍然是與人血清白蛋白是相同的。

圖4 莪術(shù)醇與人血清白蛋白結(jié)合位點的同源序列比對Fig.4 Mutiple-alignment of homo sapiens serum albumin sequences at the active sites

*注：彩圖見電子版(http://swxxx.alljournals.cn/ch/index.aspx)(2007年第1期DOI:10.3969/j.issn.1672-5565.2017.01.201608002)

莪術(shù)醇與人血清白蛋白結(jié)合的位點III處包含有12個氨基酸殘基，它們是Phe507, Phe509, Ala528, Leu529, Leu532, Val547, Phe551, Phe554, Leu575, Val576 , Ser579，它們之間的最低結(jié)合能是 -8.34 Kcal/mol。分析莪術(shù)醇與人血清白蛋白結(jié)合位點周圍的氨基酸殘基的同源序列發(fā)現(xiàn)，這些結(jié)合位點處的氨基酸大部分都是保守的，只有1個是不同的(見圖4(b))。其中人血清白蛋白上的親水性氨基酸Ser579所對應(yīng)的牦牛和家牛的是親水性的Thr 577，狼對應(yīng)的是疏水性的Ala578，綿羊的是親水性的Thr556，由上可知，莪術(shù)醇與其他四個物種的相互作用與人血清白蛋白的非常相似。

2.3 作用前后的分子構(gòu)象

從莪術(shù)醇分子與人血清白蛋白作用前后的構(gòu)象來看(見圖5)，分子的結(jié)構(gòu)并沒有發(fā)生明顯的變化。從結(jié)構(gòu)參數(shù)(見表2)來看，變化較為明顯的是羥基。其中在結(jié)合位點II處二面角C22-C21-O30-H31是139.8°，而在結(jié)合位點III處卻是102.9°。當(dāng)莪術(shù)醇分子位于結(jié)合位點II時，羥基位于一個由Ile290，Ala291，Arg222和Phe223構(gòu)成的一個疏水空腔中，羥基氫原子與對接前相比發(fā)生了較為明顯的旋轉(zhuǎn)。當(dāng)此分子位于對接位點III時，羥基周圍的氨基酸是疏水性的Phe507，Phe509，Ala528，Leu529和Leu532。羥基氫原子與對接前相比較也發(fā)生了與結(jié)合位點II相同方向的旋轉(zhuǎn)。正是由于該化合物具有五元環(huán)、六元環(huán)和七元環(huán)的剛性結(jié)構(gòu)，使得它具有較為穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)[33]。

圖5 與人血清白蛋白作用前后莪術(shù)醇的分子構(gòu)象Fig.5 The molecular conformations of thecurcumol before (a) and after interacting with the homo sapiens serum albumin

參數(shù)對接前結(jié)合位點II結(jié)合位點III鍵長(?)C1-C21.3401.3401.341C21-O201.4311.4301.431O30-C211.4341.4351.434O30-H310.9510.9510.951C21-C251.5591.5601.559C25-C271.5621.5621.562C25-C321.5731.5741.574C13-C191.5501.5501.550C13-C151.5531.5531.552鍵角(°)C2-C1-C22122.3122.3122.3C22-C21-O30107.5107.5107.5C22-C21-O20109.6109.7109.6C21-O30-H31112.2112.2112.3C21-O20-C19105.2105.2105.2C21-C25-C27100.8100.8100.8C21-C25-C32116.9116.9116.9C25-C32-C38115.2115.2115.3O20-C19-C13115.3115.3115.3C19-C13-C15117.0117.0117.1二面角(°)C2-C1-C22-C21-143.90-143.90-143.90C1-C22-C21-O30-167.30-167.30-167.30C1-C22-C21-O20-47.72-47.72-47.75C1-C22-C21-C2563.4163.4063.34C22-C21-O30-H31-60.05139.80102.90C22-C21-C25-C27-75.90-75.94-75.86C22-C21-C25-C32165.10165.10165.10C21-C25-C27-C29-16.63-16.63-16.64C27-C25-C32-C38-165.80-146.80156.40C20-C19-C13-C15-70.56-70.57-70.48

2.4 血清白蛋白疏水性分析

疏水作用及疏水和親水的平衡在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的各個方面都起著重要的作用。疏水性是 20 種氨基酸均固有的特性，是決定蛋白質(zhì)最終三維空間構(gòu)象的重要因素之一。用 ExPASy 的 Protscale 程序計算Homosapiens、Canislupus、Ovine、BosTaurus和Bosmutus的血清白蛋白的疏水性圖譜(見圖6)?？v坐標(biāo)0值以上為疏水區(qū)，0 值以下為親水區(qū)?？v坐標(biāo)代表疏水性的分值，分值越高，疏水性越強(qiáng)，橫坐標(biāo)代表氨基酸的位置。從圖中可以看出，肽鏈的疏水性氨基酸分布在這五個物種中都比較相似，疏水性的氨基酸少于親水性的氨基酸，可以認(rèn)為該蛋白質(zhì)為親水性的蛋白。另外，用ExPASy提供的在線跨膜區(qū)預(yù)測的TMHMM和TMPRED軟件[35]對這五個物種的血清白蛋白的序列跨膜區(qū)分析發(fā)現(xiàn)，它們都沒有跨膜螺旋，位于膜外，處于膜內(nèi)的、跨膜的概率均為0。由此可以說明，血清白蛋白作為血液系統(tǒng)的重要組分，是親水性的蛋白，這在Canislupus、Ovine、BosTaurus和Bosmutus物種中類似的。它具有結(jié)合和運(yùn)輸內(nèi)源性及外源性物質(zhì)的特性，例如可逆性的結(jié)合藥物小分子，并將其運(yùn)輸?shù)桨悬c部位達(dá)到治療疾病的目的等[34]。其中莪術(shù)醇與人血清白蛋白的結(jié)合位點處的氨基酸中親水性的氨基酸較多，疏水性的氨基酸少。在其他四個親緣關(guān)系較近的物種中的同源序列中也具有同樣的現(xiàn)象。

圖6 血清白蛋白序列的疏水性分析Fig.6 The hydrophobieity profile of serum albumin sequences

3 討論

莪術(shù)醇作為抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗炎、抗血栓等的藥物，與許多傳統(tǒng)藥物相比，具有無致突變性、低毒、安全可靠、對多種疾病有效的優(yōu)點。本文詳細(xì)分析了莪術(shù)醇與人血清白蛋白之間的相互作用特點。然而由于各種限制條件，所以在其他物種上研究的還比較少。本文通過系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析表明，家牛、狼、綿羊和牦牛與人類的血清白蛋白親緣關(guān)系較近，序列的相似性均在74%以上。通過多序列比對分析表明人血清白蛋白與莪術(shù)醇相互作用關(guān)鍵位點II和III在其他親緣關(guān)系較近的物種中來說都非常保守。可以推測莪術(shù)醇與其他物種的血清白蛋白相互作用模式與人類的非常相似。從莪術(shù)醇分子與人血清白蛋白作用前后的構(gòu)象來看，分子的結(jié)構(gòu)并沒有發(fā)生明顯的變化。雖然與對接前的結(jié)構(gòu)相比，羥基的位置發(fā)生了明顯的變化，但是在兩個結(jié)合位點處的構(gòu)象還是非常相似的。正是由于該化合物具有五元環(huán)、六元環(huán)和七元環(huán)的剛性結(jié)構(gòu)，使得它具有較為穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)[35-36]。

人血清白蛋白作為血液系統(tǒng)的重要組分，是親水性的蛋白，這在狼、綿羊、家牛和牦牛中是類似的，在藥物的儲存、運(yùn)輸?shù)确矫嫫鹬匾淖饔?。親水性的蛋白對水有大的親和能力，可以吸引水分子，或溶解于水。莪術(shù)醇雖然具有非常好的生物活性，但是它卻幾乎不溶于水，在水中溶解度僅為 0.3%。莪術(shù)醇與人及親緣關(guān)系較近的物種中的血清白蛋白結(jié)合的位點周圍幾乎都是疏水性的氨基酸，分子間的疏水作用起著很重要的作用。這就要求有一種既能夠與血清白蛋白結(jié)合的親水性的物質(zhì)，同時也能夠與莪術(shù)醇結(jié)合的疏水性的物質(zhì)作為載體，以此來提高藥物的利用率，如脂質(zhì)體[37-38]。

4 結(jié)論

通過分析莪術(shù)醇與人血清白蛋白相互作用發(fā)現(xiàn)其結(jié)合位點II和III處周圍幾乎都是疏水性的氨基酸，分子間的疏水作用起著很重要的作用。莪術(shù)醇與人血清白蛋白之間的作用位點在其他親緣關(guān)系較近的物種中都較為保守，少數(shù)有變化的氨基酸基本是在極性相同的氨基酸之間發(fā)生的。與分子相互作用前的結(jié)構(gòu)相比，只有莪術(shù)醇中羥基的結(jié)構(gòu)在活性位點處發(fā)生了明顯的變化，其他的五元環(huán)、六元環(huán)和七元環(huán)都具有較為穩(wěn)定的剛性結(jié)構(gòu)。

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Interaction analysis of the curcumol and homo sapiens serum albumin

QI Yanjiao1*, LU Huining2, JIN Nengzhi3

(1.DepartmentofChemicalEngineering,NorthwestUniversityforNationalities,Lanzhou730124,China；2.DepartmentofLifeSciencesandBiologicalEngineering,NorthwestUniversityforNationalities,Lanzhou730124,China；3.GansuProvinceComputingCenter,Lanzhou730000,China)

Recently, curcumol is one of the important new anti-tumor traditional Chinese medicine monomer. It can help us to better understand the mechanism of drug’s action by analyzing the interaction between curcumol and transporter-serum albumin. In this paper, we analyzed the molecular interaction between curcumol and human serum albumin, as well as the characteristics in other closely related species by using multiple sequence analysis, evolutionary relationship and molecular docking technique. The results showed that the active sites II and III between curcumol and human serum albumins are surrounded by hydrophobic amino acids, which suggested that intermolecular hydrophobic interaction plays a very important role. Their lowest binding energies are -7.22 kcal/mol and -8.34 kcal/mol, respectively. Most of the amino acids in the active sites are conservative in other close genetic species, such asCanislupus,Ovine,BosmutusandBosTaurus. It is noticed that few changes occurred between the amino acids with identical polarity. The conformation of the hydroxyl group in curcumol has the most obvious variation in the active site compared with the optimal structure.

Curcumol; Serum albumin; Interaction; Sequence alignment; Phylogenetic relationships

2016-08-18；

2016-11-08.

國家民委科研項目(No.14XBZ021) 。

10.3969/j.issn.1672-5565.2017.01.201608002

R730.3

A

1672-5565(2017)01-059-10

*通信作者：齊燕姣, 女，副教授，研究方向：生物信息學(xué)；Email:qiajiao@163.com.