反相高效液相色譜法測(cè)定藥材臘梅花中蘆丁含量

黃 瑋，肖新月，吳秀清，姚強(qiáng)文

(1．四川省資陽市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，四川 資陽 641399； 2．中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 100003；3．四川金輝藥業(yè)有限公司，四川 資陽 641300）

·檢驗(yàn)檢測(cè)·

反相高效液相色譜法測(cè)定藥材臘梅花中蘆丁含量

黃 瑋1，肖新月2，吳秀清2，姚強(qiáng)文3

(1．四川省資陽市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，四川 資陽 641399； 2．中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 100003；3．四川金輝藥業(yè)有限公司，四川 資陽 641300）

目的建立測(cè)定藥材臘梅花中蘆丁含量的反相高效液相色譜（RP-HPLC）法。方法色譜柱采用AgilentC18柱（250mm×4．6mm，5 m），以甲醇-0．05%磷酸水溶液（35∶65）為流動(dòng)相，流速為0．8 mL／min，柱溫為30℃。結(jié)果以蘆丁峰面積的常用對(duì)數(shù)(Y)對(duì)進(jìn)樣量的常用對(duì)數(shù)（X）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 Y＝1 643 977．49X+34 610．54，線性范圍為0．005 19～1．557 0 g（r2＝1．00），加樣回收率為98．91%，RSD為1．55%（n＝6）。結(jié)論該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，重復(fù)性好，可用于臘梅花的質(zhì)量控制。

蘆??；臘梅花；反相高效液相色譜法

臘梅為臘梅科（Calycanthaceae）臘梅屬植物臘梅Chimonanthus praecox(L．)Link．、素心臘梅 Chimonanthus praecox（L．）Link var．concolor Makino、紅心臘梅 Chimonanthus praecox（L．）Link var．grandiflorus Rehd．vtW ils、狗爪臘梅 Chimonanthus praecox（L．）Link var．typicus Makino的干燥花蕾[1]。臘梅屬于落葉灌木，冬臘月開花，有濃香[2]，始見于《本草綱目》中“與梅同時(shí)，色似蜜蠟”，《貴陽民間藥草》又稱“臘梅花作茶飲治久咳”，是我國(guó)特有的傳統(tǒng)觀賞花木，具有較高的觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[3]，且藥用價(jià)值不可小覷。文獻(xiàn)多采用紫外分光光度法進(jìn)行總黃酮的含量測(cè)定[4]。本研究中參考文獻(xiàn)[5-9]，采用反相高效液相色譜（RP-HPLC）法測(cè)定臘梅花中蘆丁的含量，重復(fù)性好，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1．1 儀器

LC2010A型高效液相色譜儀（日本島津公司），包括SPD-10AVP型紫外檢測(cè)器，CBM-102型工作站；MS205DU型精密電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；KQ-100B型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）。

1．2 試藥

蘆丁對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為10080-201409，純度為91．9%）。色譜用甲醇（TEDIA）、甲醇（分析純）、磷酸（分析純）、滅菌注射用水（四川科倫藥業(yè)股份有限公司）。臘梅來源為四川省萬源市青龍溝野生臘梅基地，經(jīng)資陽市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心主任中藥師吳秀清鑒定為素心臘梅 Chimonanthus praecox（L．）Link var．concolorMakino[10]。

2 方法與結(jié)果

2．1 色譜條件

色譜柱：AgilentC18柱（250mm×4．6mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇-0．05%磷酸水溶液（35∶65）；流速：0．8m L／min；檢測(cè)波長(zhǎng)：358 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL。在此色譜條件下的色譜圖見圖1。

2．2 溶液制備

對(duì)照品溶液：稱取蘆丁對(duì)照品10．22 mg，精密稱定，置100mL容量瓶中，加甲醇定容，制成每1mL含0．102 2mg的溶液，即得。

供試品溶液：取本品粗粉約0．25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25m L，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率250W，頻率50 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過，取續(xù)濾液，即得。

圖1 高效液相色譜圖

空白溶液：置具塞錐形瓶中精密加入甲醇25 mL，取濾液即得。

2．3 方法學(xué)考察

測(cè)定波長(zhǎng)選擇：黃酮類采用多溶性甲醇或乙醇，本研究中采用甲醇作為溶劑，在280～430 nm波長(zhǎng)掃描光譜。結(jié)果于358 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，故選擇358 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。詳見圖2。

圖2 波長(zhǎng)掃描光譜圖

提取方法考察：取本品粉末約0．2 g，共6份，精密稱定，精密加入甲醇25 m L，稱定質(zhì)量，分別超聲提取10，20，30min，或回流提取30，60，90min，放冷，補(bǔ)足減失的質(zhì)量。過濾，取續(xù)濾液，即得。試驗(yàn)結(jié)果表明，采用超聲處理30min與加熱回流2 h峰面積相差不大，故采用超聲提取30min。

線性關(guān)系考察：稱取蘆丁對(duì)照品10．38mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成質(zhì)量濃度為0．103 8 g／L的對(duì)照品溶液，分別取0．5，1．0，2．0，5．0，10．0，20．0μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，測(cè)定峰面積，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)、蘆丁含量（X，μg）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y＝1 643 977．49X+34 610．54，r2＝1．00(n＝6)。結(jié)果見表1。結(jié)果表明，蘆丁進(jìn)樣量在0．005 19～1．557 0μg與峰面積線性關(guān)系良好。

表1 蘆丁線性關(guān)系考察結(jié)果

精密度試驗(yàn)：精密量取對(duì)照品溶液10μL，注入液相色譜儀，平行測(cè)定5次，記錄峰面積。結(jié)果峰面積分別為 853 297，856 104，851 317，845 847，848 846，平均 851 082．2，RSD為 0．46%（n＝5），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，于0，2，4，6，8，12，16，20，24 h時(shí)注入液相色譜儀測(cè)定。結(jié)果峰面積分別為574 496，579 119，565 172，575 832，578 786，581 209，583 082，582 088，584 477，平均為 578183．2，RSD為0．96%（n＝9），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：精密稱取本品(L1)0．25 g，共6份，按擬定方法進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，并計(jì)算含量。結(jié)果蘆丁含量分別為2．333 4，2．330 6，2．330 6，2．288 2，2．310 6，2．370 1 mg／g，平均為 2．327 3 mg／g，RSD為 1．17%（n＝6），表明方法的重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：精密量取對(duì)照品9．11mg加甲醇稀釋至200mL容量瓶中，配成質(zhì)量濃度為0．045 55 g／L的對(duì)照品溶液。同時(shí)，精密稱取6份同一樣品（L1）0．125 g，分別置100mL具塞錐形瓶中，精密加入配好的對(duì)照品溶液25 m L，精密稱定。照擬訂方法進(jìn)行供試品溶液制備和測(cè)定，記錄色譜圖，并計(jì)算回收率。結(jié)果見表2。

2．4 樣品含量測(cè)定

取藥店、衛(wèi)生院等購(gòu)置樣品10批，照擬訂方法測(cè)定含量。結(jié)果10批含量平均值為2．373 mg／g，詳見表3。測(cè)定結(jié)果表明，不同變種、不同批次臘梅花中蘆丁含量波動(dòng)范圍不大。

表2 蘆丁加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果(n＝6)

3 討論

3．1 流動(dòng)相選擇

考察流動(dòng)相甲醇-0．3%磷酸溶液（35∶65），峰形對(duì)稱，理論板數(shù)高，分離度符合要求，但磷酸酸性太強(qiáng)，對(duì)色譜柱損耗太大，改用甲醇-0．05%磷酸溶液（35∶65），峰形無明顯變化，曾考察甲醇-水（40∶60），峰形有拖尾，因此選擇甲醇-0．05%磷酸溶液（35∶65）作為測(cè)定流動(dòng)相。

3．2 提取溶劑選擇

取本品粉末約0．2 g，共4份，精密稱定，分別精密加入50%甲醇、甲醇、乙醇10m L，稱定質(zhì)量，超聲處理10 min，放冷，再稱定質(zhì)量，分別用溶劑補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過，取續(xù)濾液，用微孔濾膜（0．45μm）濾過。分別進(jìn)樣10μL，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果表明，50%甲醇有拖尾，乙醇有肩峰；采用甲醇作溶劑時(shí)，蘆丁的提取效率最高，峰形較好。因此，選擇甲醇為提取溶劑。

3．3 黃酮類化合物

臘梅花中含多種揮發(fā)油、生物堿及黃酮等化合物，主要含黃酮類化合物。現(xiàn)代研究證明，天然黃酮類化合物是植物體多酚類的內(nèi)信號(hào)分子及中間體或代謝物，是重要的氧化劑和自由基消除劑，具有顯著的生理藥理活性。其能降低血管的脆性，改善血管的通透性，調(diào)節(jié)血脂和膽固醇，防治老年高血壓和腦溢血，在護(hù)肝，解肝毒，抗真菌，治療急、慢性肝炎，抗肝硬化等疾病臨床都有應(yīng)用[10-14]。

3．4 不足

本試驗(yàn)中通過反相高效液相色譜方法對(duì)臘梅花的化學(xué)成分進(jìn)行分離鑒定，操作簡(jiǎn)便、快捷、準(zhǔn)確，為臘梅花的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量控制提供參考。本研究中僅對(duì)臘梅花中素心臘梅黃酮類成分里的一種物質(zhì)進(jìn)行了初步研究，故存在一定不足。以后的研究中，應(yīng)涉及臘梅花藥材的多個(gè)品種及不同變種，并進(jìn)一步擴(kuò)大研究范圍。

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Content Determ ination of M edicinal Flowers Rutin Chimonanthus by RP-HPLC

Huang Wei1,Xiao Xinyue2,Wu Xiuqing2,Yao Qiangwen3
(1．Ziyang Food and Drug Inspection and Testing Center,Ziyang,Sichuan,China 641399; 2．China Food and Drug Administration Research Institute, Beijing,China 100003; 3．Sichuan Jinhui Pharmaceutical Co．,Ltd．,Ziyang,Sichuan,China 641300)

Ob jective To establish an RP-HPLC method for the content determination of medicinal flowers Lamei Rutin．M ethods Agilent C18column(250 mm×4．6 mm,5μm)was used,the column temperature was 30℃,Methanol-0．05% phosphoric acid aqueous solution (35∶65),the flow rate was 0．8 mL／min．Results In the selected chromatographic conditions,the peak area of the common logarithm(Y) of the commonly used sample size to number of(X)for linear regression,the regression equation was Y＝1 643 977．49X+34 610．54,the linear range was 0．005 19-1．557 0μg(r2＝1．00),the recovery rate was 98．91%,RSD was 1．55%(n＝6)．Conclusion This method is simple,accurate,reproducible,which can be used for the quality control of Rutin Chimonanthus flowers．

Rutin;chimonanthus flowers;RP-HPLC

R284.1；R282.71

A

1006-4931(2017)03-0030-03

2016-11-07)

10．3969／j．issn．1006-4931．2017．03．010

黃瑋（1982-），大學(xué)本科，主管中藥師，研究方向?yàn)橹兴庤b定、中成藥檢驗(yàn)及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，（電子信箱）37752458＠qq．com。