蛋白質(zhì)的提取、分離與純化研究進(jìn)展

金秋陽， 劉鑫宇， 胡晶紅

(山東中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院,山東 濟(jì)南 250355)

蛋白質(zhì)的提取、分離與純化研究進(jìn)展

金秋陽， 劉鑫宇， 胡晶紅

(山東中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院,山東 濟(jì)南 250355)

蛋白質(zhì)的提取、分離與純化技術(shù)是研究蛋白質(zhì)所必需的，其在生物工程、藥物研究、分子研究等領(lǐng)域扮演著越來越重要的角色。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，蛋白質(zhì)的提取、分離與純化技術(shù)也取得了重大發(fā)展，本文對(duì)蛋白的提取分離純化方法進(jìn)行綜述，并指出蛋白質(zhì)分離純化所面臨的問題、解決方法與未來的發(fā)展方向。

蛋白質(zhì)；提??；分離與純化；SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳

蛋白質(zhì)是一類復(fù)雜有機(jī)大分子總稱，作為生命物質(zhì)基礎(chǔ)，在生命活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用。因此，蛋白質(zhì)是解開人類對(duì)于生物體研究的一枚關(guān)鍵鑰匙。自1838年荷蘭科學(xué)家格麗特發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)，人們就未曾停下對(duì)蛋白質(zhì)研究的腳步。在對(duì)蛋白質(zhì)的研究進(jìn)程中，蛋白質(zhì)的提取、分離與純化是至關(guān)重要的一步，是當(dāng)代生物產(chǎn)業(yè)當(dāng)中的研究熱點(diǎn)。但該技術(shù)難度大、成本高，所以該技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用亟需改良和創(chuàng)新。本文對(duì)蛋白質(zhì)的提取、分離提純方法進(jìn)行了綜述，并闡述了該技術(shù)的前景與瓶頸。

1 蛋白質(zhì)的提取

蛋白質(zhì)自發(fā)現(xiàn)以來，蛋白質(zhì)的提取就一直備受關(guān)注。組成蛋白質(zhì)的氨基酸成千上萬、排列方式多種多樣，造成了蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)不同，因此提取方法也各不一樣?？v觀當(dāng)代國(guó)內(nèi)外對(duì)于蛋白質(zhì)提取的研究，普遍采用方法有溶液提取法、酶提取法、超聲波提取法和雙水相萃取法。

1.1 溶液提取法

蛋白質(zhì)提取的原理是利用外加溶液使蛋白質(zhì)變性，形成沉淀析出。因大部分蛋白質(zhì)均具有水溶性，可溶于水、稀鹽等水溶液，在此基礎(chǔ)上發(fā)展形成了水溶液提取法，它具有安全有效、來源廣泛易得等優(yōu)點(diǎn)，根據(jù)原材料性質(zhì)的不同，提取液用量也各有不同，邱英華等[1]使用堿提法對(duì)蠶蛹蛋白進(jìn)行提取，固液比為1：6時(shí)效率最佳。而另有少數(shù)與脂類結(jié)合的或非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)具有脂溶性，可溶于乙醇等有機(jī)溶液中，以此為依據(jù)建立了有機(jī)溶劑提取法，并得到廣泛應(yīng)用，李昊等[2]使用Tripure試劑、乙醇、異丙醇溶液提取到較為純凈的驢皮蛋白。

1.2 酶提取法

酶是一種具有催化作用的大分子，能水解蛋白質(zhì)多肽鏈，具有作用溫和、高效、專一、多樣的特點(diǎn)。與傳統(tǒng)的酸堿法相比，酶法可以顯著提高蛋白質(zhì)的提取效率，適用于工業(yè)大生產(chǎn)，成為當(dāng)今蛋白質(zhì)提取中的常用方法。Morita[3]以大米粉為原料用高溫液化淀粉酶提取大米蛋白，提取蛋白含量達(dá)90%。沈蓮清等[4]采用雙酶法(堿性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶)提取茶渣蛋白，發(fā)現(xiàn)堿性蛋白酶對(duì)提取率影響較大。

1.3 超聲波提取法

超聲波提取(超聲波萃取)是一種綠色、較為成熟的提取技術(shù)，目前被廣泛應(yīng)用于各種動(dòng)植物蛋白的提取。超聲波能夠影響原料內(nèi)部分子的三維結(jié)構(gòu)及活性基團(tuán)分布，從而影響原料與水的親和力，增強(qiáng)原料的溶解度；并且超聲波能夠產(chǎn)生強(qiáng)烈微擾、湍動(dòng)、空化等效應(yīng)，增強(qiáng)了蛋白質(zhì)分子之間的能量傳遞，使蛋白質(zhì)分子更好的釋放出來。王萬能等[5]冰浴超聲，提取福壽螺螺肉蛋白，研究表明使用超聲波提取量高于未使用超聲波,且在超聲波提取過程中, 蛋白質(zhì)提取率曲線隨超聲時(shí)間呈拋物線形式，于33min達(dá)到最佳。

1.4 雙水相萃取

雙水相萃取是在特定前提下親水性聚合物水溶液形成雙水相，根據(jù)分離物在兩相中分配比不同,實(shí)現(xiàn)分離。其特點(diǎn)有含水量高，適于提取水溶性蛋白質(zhì)；不存在有機(jī)溶劑殘留；易于放大等。涂紹勇等[6]提取木瓜蛋白酶時(shí)以PEG(聚乙二醇)/(NH4)2SO4為雙水相系統(tǒng)，在PEG600的百分含量為27%，(NH4)2SO4的百分含量為21%時(shí)木瓜蛋白酶的分配系數(shù)最高為9.28。目前此技術(shù)普遍用于生物化學(xué)、生物工程、細(xì)胞生物學(xué)等學(xué)科。

2 蛋白質(zhì)的分離純化

蛋白質(zhì)分離純化是利用生物工程下游技術(shù)從混合物中得到所需蛋白的方法，在蛋白質(zhì)研究中起到橋梁作用，成為當(dāng)代生物技術(shù)行業(yè)的核心。方法多種多樣其中根據(jù)配體特異性的分離方法為親和色譜法；依照蛋白質(zhì)分子大小不同分離的方法有透析與超濾；依照蛋白質(zhì)帶電性質(zhì)不同進(jìn)行分離的方法有電泳法、電子交換層析法、沉淀法。

2.1 沉淀法

沉淀法基本原理是溶質(zhì)分子之間及溶質(zhì)與溶劑分子之間親和力的不同，宏觀上表現(xiàn)為溶解度不同，從而達(dá)到分離的目的。影響溶解度大小的因素有溶質(zhì)和溶劑的化學(xué)性質(zhì)及結(jié)構(gòu)；是否有沉淀劑的加入；溶液pH值、離子強(qiáng)度的改變。目前常用的方法有鹽析、等電點(diǎn)沉淀。鹽析是利用無機(jī)鹽溶液來降低蛋白質(zhì)的溶解度，以使其凝聚析出，具有成本低、高效的優(yōu)點(diǎn)。 熊利芝等[7]利用鹽析、等電點(diǎn)沉淀等多種方法提取栝樓籽蛋白，終得出鹽析法效果最好的結(jié)論。等電點(diǎn)沉淀在實(shí)際應(yīng)用中常與透析等方法結(jié)合使用，張乾元等[8]將等電點(diǎn)沉淀、透析法、乙醇/水脫酚相結(jié)合，從厚殼貽貝粉末中分離提取蛋白，得率達(dá)93.8%。

2.2 膜分離技術(shù)

膜分離技術(shù)是指在分子水平上，應(yīng)用不同粒徑的半透膜，對(duì)分子大小不同的混合物進(jìn)行分離的技術(shù)。膜分離技術(shù)在生物體內(nèi)即存在，但應(yīng)用卻始于1960年的海水淡化。膜分離技術(shù)有以下幾個(gè)特點(diǎn)：可在分子級(jí)、不影響其性質(zhì)和結(jié)構(gòu)的前提下，對(duì)蛋白質(zhì)分離；工藝簡(jiǎn)化，運(yùn)行費(fèi)用低，節(jié)省能源[9]；為物理過程，可使蛋白質(zhì)保持原有的活性。膜分離技術(shù)目前主要有兩方面的應(yīng)用-透析和超濾，楊霞等[10]在提取驢皮蛋白時(shí)用蒸餾水透析兩天，除去蛋白質(zhì)中相對(duì)分子質(zhì)量大于一萬的雜質(zhì)，以達(dá)到分離純化蛋白質(zhì)的目的。周大寨等[11]提取蕓豆蛋白時(shí)選用切割分子量為5000D的超濾膜，很好地實(shí)現(xiàn)了對(duì)蕓豆蛋白的提取。

2.3 電泳法

電泳法是利用蛋白質(zhì)為兩性化合物的性質(zhì)，在電場(chǎng)作用下，向兩極按各自速率移動(dòng)，從而使組分分離，得到狹窄的條帶，并使用合適的儀器記錄電泳區(qū)帶圖譜的方法?，F(xiàn)主要有SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、毛細(xì)管電泳(CE)、雙向電泳(2-DE)和等電聚焦電泳(IEF)等

2.3.1 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳

當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)提取后對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離鑒別，SDS聚丙烯酰胺電泳為常用方法之一，它的基本原理是利用聚丙烯酰胺凝膠網(wǎng)狀構(gòu)造所具有的分子篩效應(yīng)實(shí)現(xiàn)蛋白的分離。由于蛋白質(zhì)分子量是影響蛋白質(zhì)遷移率的唯一因素，所以用這種方法測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量，操作簡(jiǎn)便，重現(xiàn)性好，值得進(jìn)一步推廣和利用[12]。

操作中有幾點(diǎn)需要注意：在進(jìn)行電泳時(shí)盡量減少染色和脫色時(shí)間，蓋新娜等[13]實(shí)驗(yàn)不經(jīng)染色直接進(jìn)行，所得蛋白成分純度提高，且避免了不必要的成分，證明了此觀點(diǎn)。目前實(shí)驗(yàn)中常用的脫色液為冰醋酸，但冰醋酸可能會(huì)與蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，從而不利于脫色回收，康彬[14]等的研究證明了該點(diǎn)，且研究出在短暫染色后用250mmol/L氯化鉀代替冰醋酸脫色，將蛋白質(zhì)的回收率提高了三倍多。

2.3.2 毛細(xì)管電泳法

毛細(xì)管電泳法是上世紀(jì)八十年代后在全球迅速崛起的一項(xiàng)技術(shù)，因具有分離時(shí)間短、分離效率高、系統(tǒng)體積小等優(yōu)點(diǎn)，毛細(xì)管電泳亦成為蛋白質(zhì)分離分析中的常用手段之一。其基本模式有毛細(xì)管區(qū)帶電泳(CZE)、毛細(xì)管凝膠電泳(CGE)、親和毛細(xì)管電泳(ACE)、毛細(xì)管電色譜(CEC)等。在電泳過程中，緩沖液pH值為蛋白質(zhì)分離的主要影響因素，這是因?yàn)閜H值不僅控制著樣品的有效淌度，還控制著電滲流，pH增大，電滲流加快，組分出峰快，不利于分離[15]。由于在電泳過程中，蛋白質(zhì)分子中帶正電的基團(tuán)會(huì)與毛細(xì)管上硅羥基發(fā)生不可逆吸附，為提高蛋白質(zhì)分離效率，應(yīng)盡可能減少吸附。胡平等[16]在對(duì)菟絲子進(jìn)行電泳時(shí)采取了使用減性緩沖液和增大緩沖液離子濃度的措施，有效優(yōu)化了蛋白質(zhì)分離條件。

2.3.3 雙向電泳

雙向電泳為SDS-PAGE與等電聚焦電泳的結(jié)合，即先進(jìn)行等點(diǎn)聚焦電泳(按照等電點(diǎn)分離)，再進(jìn)行SDS-PAGE(按照分子量大小分離)。雙向電泳具有可以在一塊凝膠上同時(shí)分離數(shù)千乃至上萬個(gè)蛋白質(zhì)，并可得到每種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)等信息的優(yōu)點(diǎn)。在品種鑒別方面，可以作為指紋圖譜應(yīng)用。電泳時(shí)蛋白質(zhì)會(huì)因溫度過高而畸變，所以最好在進(jìn)行第二向電泳時(shí)安裝冷循環(huán)水裝置[17]；染色方法對(duì)電泳結(jié)果也有影響，陳蕊紅等[18]采用膠體考馬斯亮藍(lán)染色法，得到的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)清楚，容易脫色。為了改進(jìn)雙向電泳進(jìn)一步提高凝膠比對(duì)時(shí)的準(zhǔn)確率，Culu等[19]提出了差異凝膠電泳的新概念，即用熒光標(biāo)記樣品，混合樣品后一起電泳，通過不同波長(zhǎng)檢測(cè)熒光，從而在一塊凝膠上顯示不同樣品的差異。

2.3.4 等電聚焦電泳

等電聚焦(IEF)在最近幾年急速發(fā)展。其優(yōu)點(diǎn)為重復(fù)性好、分辨力高、操作迅速簡(jiǎn)便。目前等電點(diǎn)相差0.001pH單位的生物分子均可以通過該項(xiàng)技術(shù)進(jìn)行分辨。在實(shí)際操作中，影響IEF的最主要因素為毛細(xì)管內(nèi)壁涂層，它可以吸附蛋白質(zhì)分子，從而影響分離效果，楊春等[20]采用不經(jīng)稀釋的卵清蛋白，以戊二醛為穩(wěn)定劑，以改良毛細(xì)管，獲得較好的分離結(jié)果。

2.4 層析法

層析法近年廣泛應(yīng)用，基本原理為待分離物質(zhì)在流動(dòng)相和固定相中的分配比例有差異，當(dāng)兩個(gè)相做相對(duì)運(yùn)動(dòng)，這些物質(zhì)在兩相中反復(fù)分配，使其相互分開，得到較為純凈的目的物質(zhì)。層析法分支眾多，其中高效液相色譜(HPLC)在液相層析中應(yīng)用最為廣泛，本文將著重介紹。

上個(gè)世紀(jì)60年代，科學(xué)人員研究出高效液相色譜法(HPLC)，它將高壓泵和化學(xué)鍵合固定相結(jié)合用于液相色譜，在當(dāng)今研究中處于重要的地位。它將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動(dòng)相泵入裝有固定相的色譜柱，各成分在柱內(nèi)被分離后，進(jìn)入檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，從而將樣品分離分析，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)的研究。

目前應(yīng)用較廣的反相高效液相色譜(RP-HPLC)是HPLC的各種模式中的焦點(diǎn)其通常采用低離子強(qiáng)度的酸性有機(jī)洗脫液(如乙腈、二甲基甲酸銨)和烷基硅膠鍵合固定相[21]。常用的填料有十八烷基、辛烷基等。另外流速、洗脫溫度、和洗脫液pH值等因素同樣影響蛋白質(zhì)分離，張麗華等[22]使用十八烷基載體柱分離多肽和蛋白質(zhì)，實(shí)驗(yàn)中提高柱溫，不但減少了洗脫時(shí)間，還提高了蛋白質(zhì)混合物的分離效率。實(shí)際操作中，多肽種類繁多性質(zhì)相似，單獨(dú)使用某種分離方法，可能無法達(dá)到理想分離效果， 再加上HPLC 具有無法應(yīng)用于大生產(chǎn)、浪費(fèi)資源等缺點(diǎn)，所以HPLC常與其他光譜或色譜聯(lián)合使用，在這其中HPLC-MS更是被廣泛應(yīng)用，HPLC-MS可以確定蛋白質(zhì)分子量分布，同時(shí)進(jìn)行自動(dòng)分離檢測(cè)，從而提高檢測(cè)靈敏度，王敏等[23]用HPLC和HPLC-MS分別檢測(cè)胰蛋白酶中酪氨酸，發(fā)現(xiàn)HPLC-MS靈敏度較HPLC顯著提高，證實(shí)了HPLC-MS靈敏度提高的事實(shí)。

2.5 其他

2.5.1 反膠團(tuán)萃取

用反膠團(tuán)萃取技術(shù)分離純化蛋白質(zhì)已引起人們的廣泛關(guān)注，其實(shí)質(zhì)為液-液萃取，具有可放大和易操作的特點(diǎn)，有廣闊的應(yīng)用前景。這種方法對(duì)表面活性劑、離子強(qiáng)度和種類、溶液的pH值、蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)(親水性、等電點(diǎn)……)表現(xiàn)敏感。楊邱慧子等[24]利用反膠團(tuán)萃取紅豆蛋白質(zhì)時(shí)發(fā)現(xiàn)大多數(shù)表面活性劑在己烷、庚烷等脂肪族有機(jī)溶劑中較難溶解，無法生成穩(wěn)固的反膠束體系，不利于蛋白質(zhì)的分離。雖然當(dāng)今反膠團(tuán)技術(shù)在理論和應(yīng)用領(lǐng)域取得重大進(jìn)展，但仍有很多問題亟待解決，如目標(biāo)蛋白的提取率和選擇性有待提高[25]。在未來，它的眾多優(yōu)點(diǎn)將會(huì)吸引更多科學(xué)家繼續(xù)探索。

2.5.2 分子印跡技術(shù)

分子印跡技術(shù)是在材料化學(xué)、結(jié)構(gòu)化學(xué)、生物化學(xué)等多學(xué)科的基礎(chǔ)上發(fā)展而來的，因其具有預(yù)設(shè)性、辨別性、可靠性等特點(diǎn)是為近年來新興的一項(xiàng)技術(shù)。基本原理是當(dāng)模板分子與聚合物分子集合時(shí)會(huì)在聚合物上留下作用點(diǎn)，從而在聚合過程中將這種作用記錄下來，然后當(dāng)將模板分子分離后，聚合物就會(huì)留下相應(yīng)的凹槽，這些凹槽可以特異識(shí)別模板分子或與其相似的物質(zhì)。包埋印跡法由于簡(jiǎn)便易行，得到的MIP(分子印記聚合物)性能基本可以令人滿意，所以目前被廣泛應(yīng)用[26]，Kazuya[27]在油包水乳液中，利用烷基咪唑作為功能單體,N-α-t-boc-l-histidine作為模板分子制備了有印記效果的胰蛋白酶的模板聚合物。

2.5.3 微流控芯片

隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展，越來越多的科學(xué)家將關(guān)注焦點(diǎn)轉(zhuǎn)移到了微流控芯片(Microfluidics)上，在芯片上對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離提純，分離效率和分離速度都有了明顯提高。微流控芯片是一門新興交叉學(xué)科，具有微型化、集成化的特征。滿燕[28]著重研究通道內(nèi)壁簡(jiǎn)單的涂層技術(shù)，從而抑制蛋白質(zhì)的非特異性吸附。

3 瓶頸

現(xiàn)代技術(shù)研究對(duì)蛋白質(zhì)濃度純度要求極高，但蛋白質(zhì)分離和提取過程中由于其自身性質(zhì)或取材原因，使得提出的蛋白質(zhì)往往無法達(dá)到要求。具體問題如下：(1)取材。如驢皮等較硬材料，因膠質(zhì)和脂肪組織含量較多，雜質(zhì)干擾嚴(yán)重，提取蛋白質(zhì)時(shí)各提取法效果均不理想。(2)易變性。蛋白質(zhì)在熱、酸、堿、重金屬鹽、紫外線等條件下不穩(wěn)定，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生不可逆的變化，從而失去其生理活性。(3)含量低。蛋白質(zhì)在生物材料中含量較低，而且種類繁多，構(gòu)成復(fù)雜。(4)不穩(wěn)定性。蛋白質(zhì)材料易受酶的影響降解而不穩(wěn)定。

4 展望

隨著生物技術(shù)水平的進(jìn)一步提高，對(duì)各種蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能研究的深入，蛋白質(zhì)的提取、分離純化技術(shù)也有了飛速發(fā)展。蛋白質(zhì)的研究也不只是只涉及一門單獨(dú)的學(xué)科，而是與化學(xué)、物理、藥學(xué)等學(xué)科相聯(lián)系。雖然目前已有了分子印記技術(shù)和微流控芯片等新技術(shù)應(yīng)用到蛋白質(zhì)的分離純化，但是由于蛋白質(zhì)本身性質(zhì)復(fù)雜，不易提取，因此目前還沒有適用于所有蛋白質(zhì)的高效提取分離方法。在未來的研究道路上，如何高效提取蛋白質(zhì)，提高蛋白質(zhì)的純度，將是科學(xué)工作者研究的熱點(diǎn)。

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Research Progress on extraction, separation and purification of protein

JinQiuyang,LiuXinyu,HuJinghong*

(School of Pharmacy, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China)

Protein extraction, separation and purification technology is necessary for the study of protein, which plays a more and more important role in the field of biological engineering, drug research, molecular research and so on. With the development of science and technology, protein extraction, separation and purification technology has made significant progress. In this paper the methods of extraction, purification and separation of protein were reviewed. The problems, solutions and the future development trend were pointed out about extraction, separation and purification of protein.

protein; extraction; separation and purification; SDS polyacrylamide gel electrophoresis

2017-05-07

山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2015GSF119004)，山東中醫(yī)藥大學(xué)SRT項(xiàng)目(2016060)本研究在山東中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心平臺(tái)完成，獲得2016年國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目立項(xiàng)(編號(hào):2016060)

金秋陽(1995—)，女(回族)，山東濟(jì)南人，本科在讀，; 通訊作者：胡晶紅(1974—)，博士，講師 。

TQ936；TQ464.7

A

1008-021X(2017)14-0035-04

專論與綜述