蛋白質的提取、分離與純化研究進展

金秋陽， 劉鑫宇， 胡晶紅

(山東中醫(yī)藥大學 藥學院,山東 濟南 250355)

蛋白質的提取、分離與純化研究進展

金秋陽， 劉鑫宇， 胡晶紅

(山東中醫(yī)藥大學 藥學院,山東 濟南 250355)

蛋白質的提取、分離與純化技術是研究蛋白質所必需的，其在生物工程、藥物研究、分子研究等領域扮演著越來越重要的角色。隨著科學技術的發(fā)展，蛋白質的提取、分離與純化技術也取得了重大發(fā)展，本文對蛋白的提取分離純化方法進行綜述，并指出蛋白質分離純化所面臨的問題、解決方法與未來的發(fā)展方向。

蛋白質；提??；分離與純化；SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳

蛋白質是一類復雜有機大分子總稱，作為生命物質基礎，在生命活動中發(fā)揮著重要作用。因此，蛋白質是解開人類對于生物體研究的一枚關鍵鑰匙。自1838年荷蘭科學家格麗特發(fā)現(xiàn)蛋白質，人們就未曾停下對蛋白質研究的腳步。在對蛋白質的研究進程中，蛋白質的提取、分離與純化是至關重要的一步，是當代生物產業(yè)當中的研究熱點。但該技術難度大、成本高，所以該技術在實際應用亟需改良和創(chuàng)新。本文對蛋白質的提取、分離提純方法進行了綜述，并闡述了該技術的前景與瓶頸。

1 蛋白質的提取

蛋白質自發(fā)現(xiàn)以來，蛋白質的提取就一直備受關注。組成蛋白質的氨基酸成千上萬、排列方式多種多樣，造成了蛋白質的理化性質不同，因此提取方法也各不一樣?？v觀當代國內外對于蛋白質提取的研究，普遍采用方法有溶液提取法、酶提取法、超聲波提取法和雙水相萃取法。

1.1 溶液提取法

蛋白質提取的原理是利用外加溶液使蛋白質變性，形成沉淀析出。因大部分蛋白質均具有水溶性，可溶于水、稀鹽等水溶液，在此基礎上發(fā)展形成了水溶液提取法，它具有安全有效、來源廣泛易得等優(yōu)點，根據(jù)原材料性質的不同，提取液用量也各有不同，邱英華等[1]使用堿提法對蠶蛹蛋白進行提取，固液比為1：6時效率最佳。而另有少數(shù)與脂類結合的或非極性側鏈較多的蛋白質具有脂溶性，可溶于乙醇等有機溶液中，以此為依據(jù)建立了有機溶劑提取法，并得到廣泛應用，李昊等[2]使用Tripure試劑、乙醇、異丙醇溶液提取到較為純凈的驢皮蛋白。

1.2 酶提取法

酶是一種具有催化作用的大分子，能水解蛋白質多肽鏈，具有作用溫和、高效、專一、多樣的特點。與傳統(tǒng)的酸堿法相比，酶法可以顯著提高蛋白質的提取效率，適用于工業(yè)大生產，成為當今蛋白質提取中的常用方法。Morita[3]以大米粉為原料用高溫液化淀粉酶提取大米蛋白，提取蛋白含量達90%。沈蓮清等[4]采用雙酶法(堿性蛋白酶、復合蛋白酶)提取茶渣蛋白，發(fā)現(xiàn)堿性蛋白酶對提取率影響較大。

1.3 超聲波提取法

超聲波提取(超聲波萃取)是一種綠色、較為成熟的提取技術，目前被廣泛應用于各種動植物蛋白的提取。超聲波能夠影響原料內部分子的三維結構及活性基團分布，從而影響原料與水的親和力，增強原料的溶解度；并且超聲波能夠產生強烈微擾、湍動、空化等效應，增強了蛋白質分子之間的能量傳遞，使蛋白質分子更好的釋放出來。王萬能等[5]冰浴超聲，提取福壽螺螺肉蛋白，研究表明使用超聲波提取量高于未使用超聲波,且在超聲波提取過程中, 蛋白質提取率曲線隨超聲時間呈拋物線形式，于33min達到最佳。

1.4 雙水相萃取

雙水相萃取是在特定前提下親水性聚合物水溶液形成雙水相，根據(jù)分離物在兩相中分配比不同,實現(xiàn)分離。其特點有含水量高，適于提取水溶性蛋白質；不存在有機溶劑殘留；易于放大等。涂紹勇等[6]提取木瓜蛋白酶時以PEG(聚乙二醇)/(NH4)2SO4為雙水相系統(tǒng)，在PEG600的百分含量為27%，(NH4)2SO4的百分含量為21%時木瓜蛋白酶的分配系數(shù)最高為9.28。目前此技術普遍用于生物化學、生物工程、細胞生物學等學科。

2 蛋白質的分離純化

蛋白質分離純化是利用生物工程下游技術從混合物中得到所需蛋白的方法，在蛋白質研究中起到橋梁作用，成為當代生物技術行業(yè)的核心。方法多種多樣其中根據(jù)配體特異性的分離方法為親和色譜法；依照蛋白質分子大小不同分離的方法有透析與超濾；依照蛋白質帶電性質不同進行分離的方法有電泳法、電子交換層析法、沉淀法。

2.1 沉淀法

沉淀法基本原理是溶質分子之間及溶質與溶劑分子之間親和力的不同，宏觀上表現(xiàn)為溶解度不同，從而達到分離的目的。影響溶解度大小的因素有溶質和溶劑的化學性質及結構；是否有沉淀劑的加入；溶液pH值、離子強度的改變。目前常用的方法有鹽析、等電點沉淀。鹽析是利用無機鹽溶液來降低蛋白質的溶解度，以使其凝聚析出，具有成本低、高效的優(yōu)點。 熊利芝等[7]利用鹽析、等電點沉淀等多種方法提取栝樓籽蛋白，終得出鹽析法效果最好的結論。等電點沉淀在實際應用中常與透析等方法結合使用，張乾元等[8]將等電點沉淀、透析法、乙醇/水脫酚相結合，從厚殼貽貝粉末中分離提取蛋白，得率達93.8%。

2.2 膜分離技術

膜分離技術是指在分子水平上，應用不同粒徑的半透膜，對分子大小不同的混合物進行分離的技術。膜分離技術在生物體內即存在，但應用卻始于1960年的海水淡化。膜分離技術有以下幾個特點：可在分子級、不影響其性質和結構的前提下，對蛋白質分離；工藝簡化，運行費用低，節(jié)省能源[9]；為物理過程，可使蛋白質保持原有的活性。膜分離技術目前主要有兩方面的應用-透析和超濾，楊霞等[10]在提取驢皮蛋白時用蒸餾水透析兩天，除去蛋白質中相對分子質量大于一萬的雜質，以達到分離純化蛋白質的目的。周大寨等[11]提取蕓豆蛋白時選用切割分子量為5000D的超濾膜，很好地實現(xiàn)了對蕓豆蛋白的提取。

2.3 電泳法

電泳法是利用蛋白質為兩性化合物的性質，在電場作用下，向兩極按各自速率移動，從而使組分分離，得到狹窄的條帶，并使用合適的儀器記錄電泳區(qū)帶圖譜的方法?，F(xiàn)主要有SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、毛細管電泳(CE)、雙向電泳(2-DE)和等電聚焦電泳(IEF)等

2.3.1 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳

當?shù)鞍踪|提取后對蛋白質進行分離鑒別，SDS聚丙烯酰胺電泳為常用方法之一，它的基本原理是利用聚丙烯酰胺凝膠網狀構造所具有的分子篩效應實現(xiàn)蛋白的分離。由于蛋白質分子量是影響蛋白質遷移率的唯一因素，所以用這種方法測定蛋白質的分子量，操作簡便，重現(xiàn)性好，值得進一步推廣和利用[12]。

操作中有幾點需要注意：在進行電泳時盡量減少染色和脫色時間，蓋新娜等[13]實驗不經染色直接進行，所得蛋白成分純度提高，且避免了不必要的成分，證明了此觀點。目前實驗中常用的脫色液為冰醋酸，但冰醋酸可能會與蛋白質發(fā)生反應，從而不利于脫色回收，康彬[14]等的研究證明了該點，且研究出在短暫染色后用250mmol/L氯化鉀代替冰醋酸脫色，將蛋白質的回收率提高了三倍多。

2.3.2 毛細管電泳法

毛細管電泳法是上世紀八十年代后在全球迅速崛起的一項技術，因具有分離時間短、分離效率高、系統(tǒng)體積小等優(yōu)點，毛細管電泳亦成為蛋白質分離分析中的常用手段之一。其基本模式有毛細管區(qū)帶電泳(CZE)、毛細管凝膠電泳(CGE)、親和毛細管電泳(ACE)、毛細管電色譜(CEC)等。在電泳過程中，緩沖液pH值為蛋白質分離的主要影響因素，這是因為pH值不僅控制著樣品的有效淌度，還控制著電滲流，pH增大，電滲流加快，組分出峰快，不利于分離[15]。由于在電泳過程中，蛋白質分子中帶正電的基團會與毛細管上硅羥基發(fā)生不可逆吸附，為提高蛋白質分離效率，應盡可能減少吸附。胡平等[16]在對菟絲子進行電泳時采取了使用減性緩沖液和增大緩沖液離子濃度的措施，有效優(yōu)化了蛋白質分離條件。

2.3.3 雙向電泳

雙向電泳為SDS-PAGE與等電聚焦電泳的結合，即先進行等點聚焦電泳(按照等電點分離)，再進行SDS-PAGE(按照分子量大小分離)。雙向電泳具有可以在一塊凝膠上同時分離數(shù)千乃至上萬個蛋白質，并可得到每種蛋白質的等電點等信息的優(yōu)點。在品種鑒別方面，可以作為指紋圖譜應用。電泳時蛋白質會因溫度過高而畸變，所以最好在進行第二向電泳時安裝冷循環(huán)水裝置[17]；染色方法對電泳結果也有影響，陳蕊紅等[18]采用膠體考馬斯亮藍染色法，得到的蛋白質斑點清楚，容易脫色。為了改進雙向電泳進一步提高凝膠比對時的準確率，Culu等[19]提出了差異凝膠電泳的新概念，即用熒光標記樣品，混合樣品后一起電泳，通過不同波長檢測熒光，從而在一塊凝膠上顯示不同樣品的差異。

2.3.4 等電聚焦電泳

等電聚焦(IEF)在最近幾年急速發(fā)展。其優(yōu)點為重復性好、分辨力高、操作迅速簡便。目前等電點相差0.001pH單位的生物分子均可以通過該項技術進行分辨。在實際操作中，影響IEF的最主要因素為毛細管內壁涂層，它可以吸附蛋白質分子，從而影響分離效果，楊春等[20]采用不經稀釋的卵清蛋白，以戊二醛為穩(wěn)定劑，以改良毛細管，獲得較好的分離結果。

2.4 層析法

層析法近年廣泛應用，基本原理為待分離物質在流動相和固定相中的分配比例有差異，當兩個相做相對運動，這些物質在兩相中反復分配，使其相互分開，得到較為純凈的目的物質。層析法分支眾多，其中高效液相色譜(HPLC)在液相層析中應用最為廣泛，本文將著重介紹。

上個世紀60年代，科學人員研究出高效液相色譜法(HPLC)，它將高壓泵和化學鍵合固定相結合用于液相色譜，在當今研究中處于重要的地位。它將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，各成分在柱內被分離后，進入檢測器進行檢測，從而將樣品分離分析，現(xiàn)已廣泛應用于蛋白質的研究。

目前應用較廣的反相高效液相色譜(RP-HPLC)是HPLC的各種模式中的焦點其通常采用低離子強度的酸性有機洗脫液(如乙腈、二甲基甲酸銨)和烷基硅膠鍵合固定相[21]。常用的填料有十八烷基、辛烷基等。另外流速、洗脫溫度、和洗脫液pH值等因素同樣影響蛋白質分離，張麗華等[22]使用十八烷基載體柱分離多肽和蛋白質，實驗中提高柱溫，不但減少了洗脫時間，還提高了蛋白質混合物的分離效率。實際操作中，多肽種類繁多性質相似，單獨使用某種分離方法，可能無法達到理想分離效果， 再加上HPLC 具有無法應用于大生產、浪費資源等缺點，所以HPLC常與其他光譜或色譜聯(lián)合使用，在這其中HPLC-MS更是被廣泛應用，HPLC-MS可以確定蛋白質分子量分布，同時進行自動分離檢測，從而提高檢測靈敏度，王敏等[23]用HPLC和HPLC-MS分別檢測胰蛋白酶中酪氨酸，發(fā)現(xiàn)HPLC-MS靈敏度較HPLC顯著提高，證實了HPLC-MS靈敏度提高的事實。

2.5 其他

2.5.1 反膠團萃取

用反膠團萃取技術分離純化蛋白質已引起人們的廣泛關注，其實質為液-液萃取，具有可放大和易操作的特點，有廣闊的應用前景。這種方法對表面活性劑、離子強度和種類、溶液的pH值、蛋白質的理化性質(親水性、等電點……)表現(xiàn)敏感。楊邱慧子等[24]利用反膠團萃取紅豆蛋白質時發(fā)現(xiàn)大多數(shù)表面活性劑在己烷、庚烷等脂肪族有機溶劑中較難溶解，無法生成穩(wěn)固的反膠束體系，不利于蛋白質的分離。雖然當今反膠團技術在理論和應用領域取得重大進展，但仍有很多問題亟待解決，如目標蛋白的提取率和選擇性有待提高[25]。在未來，它的眾多優(yōu)點將會吸引更多科學家繼續(xù)探索。

2.5.2 分子印跡技術

分子印跡技術是在材料化學、結構化學、生物化學等多學科的基礎上發(fā)展而來的，因其具有預設性、辨別性、可靠性等特點是為近年來新興的一項技術?；驹硎钱斈０宸肿优c聚合物分子集合時會在聚合物上留下作用點，從而在聚合過程中將這種作用記錄下來，然后當將模板分子分離后，聚合物就會留下相應的凹槽，這些凹槽可以特異識別模板分子或與其相似的物質。包埋印跡法由于簡便易行，得到的MIP(分子印記聚合物)性能基本可以令人滿意，所以目前被廣泛應用[26]，Kazuya[27]在油包水乳液中，利用烷基咪唑作為功能單體,N-α-t-boc-l-histidine作為模板分子制備了有印記效果的胰蛋白酶的模板聚合物。

2.5.3 微流控芯片

隨著蛋白質組學的發(fā)展，越來越多的科學家將關注焦點轉移到了微流控芯片(Microfluidics)上，在芯片上對蛋白質進行分離提純，分離效率和分離速度都有了明顯提高。微流控芯片是一門新興交叉學科，具有微型化、集成化的特征。滿燕[28]著重研究通道內壁簡單的涂層技術，從而抑制蛋白質的非特異性吸附。

3 瓶頸

現(xiàn)代技術研究對蛋白質濃度純度要求極高，但蛋白質分離和提取過程中由于其自身性質或取材原因，使得提出的蛋白質往往無法達到要求。具體問題如下：(1)取材。如驢皮等較硬材料，因膠質和脂肪組織含量較多，雜質干擾嚴重，提取蛋白質時各提取法效果均不理想。(2)易變性。蛋白質在熱、酸、堿、重金屬鹽、紫外線等條件下不穩(wěn)定，蛋白質結構會發(fā)生不可逆的變化，從而失去其生理活性。(3)含量低。蛋白質在生物材料中含量較低，而且種類繁多，構成復雜。(4)不穩(wěn)定性。蛋白質材料易受酶的影響降解而不穩(wěn)定。

4 展望

隨著生物技術水平的進一步提高，對各種蛋白質的結構和功能研究的深入，蛋白質的提取、分離純化技術也有了飛速發(fā)展。蛋白質的研究也不只是只涉及一門單獨的學科，而是與化學、物理、藥學等學科相聯(lián)系。雖然目前已有了分子印記技術和微流控芯片等新技術應用到蛋白質的分離純化，但是由于蛋白質本身性質復雜，不易提取，因此目前還沒有適用于所有蛋白質的高效提取分離方法。在未來的研究道路上，如何高效提取蛋白質，提高蛋白質的純度，將是科學工作者研究的熱點。

[1] 邱英華,孫衛(wèi)東,王玉海,等.蠶蛹蛋白提取與脫臭工藝研究[J].中國食品添加劑,2012(3): 133- 136.

[2] 李 昊,黃美娟,張少權.驢真皮中主要蛋白的組成及其相互作用的研究[J].中國中藥雜志,2006,31(08):659-662.

[3] Morita T,Kiriyana S .Mass production method for rice protein isolate and nutritional evaluation[J].Food Science,1993,58(6):1393-1396.

[4] 沈蓮清,黃光榮,王向陽,等.茶渣中蛋白質酶法提取工藝[J]. 食品與生物技術學報,2006,(06):7-12,33.

[5] 王萬能,全學軍,郭志龍,等.超聲波輔助福壽螺蛋白質提取的研究[J].食品科技,2006(08):149-151.

[6] 涂紹勇,李路,楊愛華,等.雙水相萃取法提取木瓜蛋白酶的研究[J].食品工業(yè)科技, 2010(09):220-222.

[7] 熊利芝,吳玉先,曹衛(wèi)君,等.栝樓籽蛋白分離純化及抗氧化性的研究[J].應用化工,2016,45(01):7-10.

[8] 張乾元,MARIUS Nzekebaloudou,張?zhí)m,等,厚殼貽貝分離蛋白提取、氨基酸組成及理化特性研究[J]. 食品工業(yè)科技,2012,33(24):154-157.

[9] 施東魁,胡春梅. 膜分離技術及其在醫(yī)藥生產和研究中的應用[J]. 中國中藥雜志,2006(15):1221-1224.

[10] 楊 霞,王珊珊,趙芙釵,等.驢皮中膠原蛋白的提取及其特性[J]. 精細化工,2011(09):883-886.

[11] 周大寨,朱玉昌,周毅鋒,等,蕓豆蛋白質的提取及超濾分離研究[J].食品科學,2008,29(08):386-390.

[12] 石繼紅,趙永同,王俊樓,等. SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析小分子多肽[J]. 第四軍醫(yī)大學學報,2000(06):761-763.

[13] 蓋新娜,蔣輝,盧靜.用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的方法提純蛋白質[J].實驗動物科學與管理, 2001 , 18 (4) :44-45.

[14] 康 彬,童 哲.一種利于蛋白質回收的快速SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳染色-脫色方法[J].生物化學與生物物理進展,2000,27(2):210-211.

[15] 唐 萍,田 晶,余振寶,等.奶制品中蛋白質測定的毛細管電泳法研究[J].分析科學學報,2006,22(01):5-8.

[16] 胡 平,羅國安,王如驥,等.中藥菟絲子的高效毛細管電泳法鑒別[J].藥學學報, 1997 (07):549-552.

[17] 胡 敏,徐凌飛,張軍科,等.梨葉片總蛋白提取及雙向電泳體系的建立[J]. 西北農林科技大學學報(自然科學版),2012,40(01):197-203.

[18] 陳蕊紅,張政生,劉 衛(wèi),等.小麥花藥蛋白質組雙向電泳技術體系的優(yōu)化[J].核農學報,2008,22(04):404-409.

[19] Culu M, Morgan M, Minden J. Difference gel electrophuresise a single gel for detecting changes in protein extracts[J].Electrophuresis,1997,18:2071.

[20] 楊 春,張維冰,張玉奎. 毛細管柱表面雞卵清蛋白快速改性并用于等電聚焦電泳分離蛋白質[J]. 分析化學,2003(09):1097-1100.

[21] 周雅琳,闡健全,陳宗道.高效液相色譜法在蛋白質分析中應用[J].糧食與油脂,2001(11):37-38.

[22] 張麗華,屠紅敏,吳高德,等. HPLC無孔徑載體柱用于快速分離蛋白質和多肽[J]. 高技術通訊,19 95(2 ):45-47.

[23] 王 敏,張秀芹,楊振宇,等.HPLC-MS/MS檢測含蛋白質輻照食品中的鄰酪氨酸[J].分析測試學報,2011,30(10):1187-1190.

[24] 楊邱慧子,張志寬,陳雨泰,等.反膠團萃取分離紅豆蛋白質[J].食品工業(yè)科技,2013,49(19):252-256.

[25] 趙喜紅.何小維,楊連生,等.反膠團萃取蛋白質研究進展[J].食品工業(yè)科技,2009,30(02):326-329.

[26] 宋錫瑾,龔偉,王杰. 蛋白質分子印跡[J]. 化學通報,2005(07):504-509.

[27] Kazuya U, Masahiro G. Amolecularly imprinted polymer that shows enzymatic activity[J]. Biochemical Engineering Journal,2003,14:85-91.

[28] 滿 燕.基于微流控芯片的蛋白質高靈敏快速檢測技術研究[D].北京:北京理工大學,2015:1-128.

(本文文獻格式：金秋陽， 劉鑫宇， 胡晶紅.蛋白質的提取、分離與純化研究進展[J].山東化工，2017，46(14)：35-38.)

Research Progress on extraction, separation and purification of protein

JinQiuyang,LiuXinyu,HuJinghong*

(School of Pharmacy, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China)

Protein extraction, separation and purification technology is necessary for the study of protein, which plays a more and more important role in the field of biological engineering, drug research, molecular research and so on. With the development of science and technology, protein extraction, separation and purification technology has made significant progress. In this paper the methods of extraction, purification and separation of protein were reviewed. The problems, solutions and the future development trend were pointed out about extraction, separation and purification of protein.

protein; extraction; separation and purification; SDS polyacrylamide gel electrophoresis

2017-05-07

山東省重點研發(fā)計劃項目(2015GSF119004)，山東中醫(yī)藥大學SRT項目(2016060)本研究在山東中醫(yī)藥大學國家級實驗教學示范中心平臺完成，獲得2016年國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目立項(編號:2016060)

金秋陽(1995—)，女(回族)，山東濟南人，本科在讀，; 通訊作者：胡晶紅(1974—)，博士，講師 。

TQ936；TQ464.7

A

1008-021X(2017)14-0035-04

專論與綜述