疊氮溴化乙錠與PCR技術結合檢測活菌研究進展

呂嬙，姜兆興，王海艷，趙林立，曹旭，崔強，趙治國，*，郭鐵箏，劉來俊

（1.內(nèi)蒙古出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，內(nèi)蒙古呼和浩特010020；2.赤峰出入境檢驗檢疫局，內(nèi)蒙古赤峰024000）

疊氮溴化乙錠與PCR技術結合檢測活菌研究進展

呂嬙1，姜兆興2，王海艷1，趙林立1，曹旭2，崔強1，趙治國1，*，郭鐵箏1，劉來俊1

（1.內(nèi)蒙古出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，內(nèi)蒙古呼和浩特010020；2.赤峰出入境檢驗檢疫局，內(nèi)蒙古赤峰024000）

微生物檢驗是食品安全把關的重要環(huán)節(jié)，而應用傳統(tǒng)的培養(yǎng)法檢測微生物難以做到及時、準確。PCR技術的出現(xiàn)為微生物快速檢測開辟了新的途徑，但該方法又難以區(qū)分食品中的死活菌。疊氮溴化乙錠（Ethidium monoazide bromide，EMA）與PCR技術相結合，可以快速、準確檢測食品中活體微生物，有效減少食品安全事件的發(fā)生。將對近年來EMA與PCR、RT-PCR和LAMP技術結合用于食品中活菌研究進展做一綜述。

疊氮溴化乙錠；PCR技術；活菌

一直以來，食品安全問題都是世界性焦點，食品檢測是保障人類生命安全與生活質(zhì)量的基礎性工程。我國食品安全事件頻發(fā)，嚴重影響了人民群眾的身心健康和國民經(jīng)濟的良性發(fā)展。其中，食源性致病菌微生物危害尤為突出，現(xiàn)有檢測方法采用常規(guī)培養(yǎng)法檢測，該方法是多數(shù)微生物檢測的通用方法，但也有許多難以克服的弊端，一是檢測靈敏度低，若食品中雜菌多目標菌較少，容易發(fā)生漏檢；二是各種菌在平板上形態(tài)各異，檢測人員需要有一定經(jīng)驗才能準確判定[1]；三是該方法檢測周期較長，甚至檢測結果出具時食品已過保質(zhì)期或已被消費者廣泛食用。另外，在我們的檢測工作過程中發(fā)現(xiàn)，由于食品在加工、運輸和儲藏中環(huán)境等因素的變化，細菌容易存活于活的非可培養(yǎng)（Viable but non-culturable，VBNC）狀態(tài)，它是細菌的一種特殊存活機制，是對不良環(huán)境的適應性反應[2-3]，由于VBNC菌不可培養(yǎng)的性質(zhì)，急需尋找能替代傳統(tǒng)平板計數(shù)法的方法[4]。

近年來，人們嘗試各種基于核酸擴增的檢測方法如普通PCR、熒光定量PCR和LAMP檢測樣品中的致病菌，但由于食品樣品DNA在死菌中能保留較長時間，傳統(tǒng)的核酸檢測法并不能區(qū)分死活菌。鑒于mRNA的半衰期較短，一般只存在于活體細胞中，是活菌檢測的新路徑。然而mRNA易受食品基質(zhì)中各種成分如脂肪、血細胞和蛋白質(zhì)的影響而不易被提取，從而使檢測靈敏度降低。疊氮溴化乙錠（Ethidium monoazide bromide，EMA）的發(fā)明為基于DNA檢測活菌開辟了新的思路，它在光激活作用下能與死細胞基因組DNA結合并抑制其進行PCR擴增，而由于完整未受損傷的活菌細胞膜能夠阻止EMA的滲透，對活菌DNA則不起作用。目前，將EMA與普通PCR、熒光定量PCR、LAMP等技術結合用于食品中活菌檢測已成為研究熱點。

1 EMA簡介

疊氮溴化乙錠（Ethidium monoazide bromide，EMA）是Hixon等[5]發(fā)現(xiàn)于上世紀70年代的核酸熒光染料，分子式為C21H18BrN5，分子量為420，不溶于水、可溶于乙醇的橙色固體。其特點是當樣品中死活細胞共同存在時，能選擇性地與死細胞DNA共價結合[6]。其主要原理是：通常死細胞的細胞膜已經(jīng)遭到破壞，EMA很容易滲透到細胞內(nèi)部從而插入到細胞內(nèi)DNA雙螺旋上。但活菌的細胞膜比較完整，EMA不能滲透到活菌內(nèi)部。后續(xù)經(jīng)過高強度的可見光曝光處理后，插入到DNA雙螺旋上的EMA能夠與DNA雙螺旋發(fā)生共價交叉偶合，且這種共價偶合具有不可逆性，從而抑制后續(xù)PCR擴增中引物與死菌DNA的結合，達到區(qū)分死活菌的目的[7]。

以EMA-PCR為例說明：將EMA加入到含有活菌和死菌的測試樣品中，曝光1min導致游離EMA穿透死亡細胞并與DNA共價結合，但不能進入活細胞。與EMA共價結合的死細胞DNA和未與EMA結合的活細胞DNA，在PCR反應中，來自活細胞的DNA是可以與引物結合進行PCR擴增，而死細胞DNA由于與EMA的不可逆結合不能被擴增[8]。

2 EMA在區(qū)分死活菌中的應用

2.1 EMA與PCR技術

1985年，Randal等[9]首次在science發(fā)表聚合酶鏈式反應（Polymerase chain reactiom，PCR），它是一種體外核酸序列擴增技術。PCR是在模板DNA、四種脫氧核糖核苷酸和引物存在下，依賴于DNA聚合酶的酶促反應，經(jīng)過雙鏈DNA的高溫變性、引物與模板的低溫退火和適溫延伸3個步聚反復循環(huán)，PCR的特定DNA序列產(chǎn)量隨著循環(huán)次數(shù)呈指數(shù)增加，達到迅速大量擴增目的[10]。PCR技術已在分子生物學、法學、醫(yī)學、生物化學等領域得到了廣泛應用。

將EMA與PCR技術聯(lián)用可以克服傳統(tǒng)PCR無法區(qū)分死活菌的缺點[11]。目前EMA-PCR方法已用于多種致病菌的檢測。2005年，Knut等[8]在檢測經(jīng)過滅菌和抗生素處理的復雜食品中難以培養(yǎng)的細菌時，EMA-PCR法起到了良好的效果。2006年，Jung-Lim等[12]利用EMA處理鱈魚片肉湯培養(yǎng)物的細菌混合菌群后，用通用引物DG74和RW01擴增所有真細菌16S rDNA的高度保守區(qū)的序列片段（約370 bp），結果較為理想。2010年，Minami等[13]通過小劑量的EMA處理，檢測嬰兒配方食品中活的阪崎腸桿菌。2013年，Saiyudthong等[14]研究雞肉中鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella Typhimurium）和腸炎沙門氏菌（Salmonella Enteritidis）時，將雞肉樣品在營養(yǎng)肉湯中預培養(yǎng)，微生物得到大量繁殖后，再利用EMA-PCR法進行檢測，使檢測結果更加可靠。2015年，Hiroaki等[15]采用EMA-PCR方法分析來自6個冷卻塔和3個洗浴水樣的軍團菌屬多樣性，針對將617個16S rRNA基因序列分為99個操作分類單位（OTUs），且與VBNC狀態(tài)培養(yǎng)的細菌具有差異性。大量研究證實，EMA確實能穿過死細菌不完整的細胞膜與基因組DNA結合，“屏蔽”死細胞和游離狀態(tài)的DNA，使其不能作為模板進行PCR擴增。

2.2 EMA與熒光定量PCR技術

1996年，Applied Biosystems公司首次推出熒光定量 PCR技術（Real Time Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）。熒光定量PCR是指在PCR反應體系中加入熒光物質(zhì)，并實時監(jiān)測整個PCR擴增過程中熒光信號的積累，最后通過已知濃度的標準樣品制作的標準曲線，對未知濃度樣品進行定量分析的技術。該方法彌補了傳統(tǒng)PCR技術不能定量的不足，具有特異性好、定量準確、靈敏度高、自動化程度高和速度快等優(yōu)點，并且實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍[16]。

近年來，關于EMA與實時RT-PCR相結合定量檢測食品中致病菌活細胞的研究報道比較多。2005年，Rudi等[17]采用EMA與熒光定量PCR法結合用于檢測活、死的和VBNC狀態(tài)下的荷蘭產(chǎn)高德干酪（gouda-like cheeses）中單核細胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）。2009 年，Helen 等[18]采用相同的方法檢測果汁發(fā)酵過程中敗壞酵母（Zygosaccharomyces bailii）的產(chǎn)生過程。同年，Wang[19]分別用EMA與熒光定量PCR結合法、反轉錄RNA擴增法和熒光定量PCR法對禽肉和牛肉制品中大腸桿菌O157：H7和沙門氏菌進行檢測，結果表明EMA與熒光定量PCR結合法檢測效率最好。2010年，Wang等[20]采用EMA與熒光定量PCR結合法檢測雞肉和雞蛋培養(yǎng)液中沙門氏菌，檢測低限可達10 CFU/mL。Meng[21]分別用EMA與熒光定量PCR結合法和平板計數(shù)法定量檢測雙歧桿菌，結果表明兩種方法檢測結果有良好的相關性（R2=0.994 8），EMA與熒光定量PCR結合法可直接、快速（4 h內(nèi)）完成商業(yè)酸奶中活的雙歧桿菌檢測。2012年，Soejima等[22]采用EMA與熒光定量PCR結合法，擴增較長片段16S-23S rRNA基因序列（2 451 bp），分析巴氏殺菌乳總大腸菌群。Shi等[23]采用玻璃珠DNA提取方法和EMA與熒光定量PCR結合法檢測葡萄酒中微生物，如酵母、釀酒酵母、乳酸菌（LAB）、乙酸菌（AAB）和非酒花（oeniLAB）的測定。2014年，Seinige等[24]將EMA與熒光定量PCR結合法成功應用于水樣中彎曲桿菌的分離與鑒定，結果表明該法對死活菌混合物的檢測優(yōu)于熒光定量PCR法。

2.3 EMA與LAMP技術

2000年，Notomi等[25]首次提出環(huán)介導等溫擴增技術 （loop-mediated isothermal amplification，簡稱LAMP），它是針對靶基因6個區(qū)域設計4條LAMP特異性引物，利用DNA聚合酶（Bst DNA Polymerase）在恒溫條件下保溫約60 min進行擴增。目前，已有EMA-LAMP技術成功用于食源性病原菌檢測的報道。2009年，Lu等[26]采用EMA-LAMP分析沙門氏菌的invA基因序列。2012年，Wang等[27]采用相同的方法擴增tlh基因檢測VBNC狀態(tài)下的副溶血性弧菌，來自死菌的DNA擴增被EMA成功抑制，而處于VBNC狀態(tài)下菌株被成功擴增出來。2015年，Wu等[28]采用EMA與Real Time-LAMP結合的方法研究食源性致病菌腸炎沙門氏菌，并通過不斷試驗優(yōu)化選擇了最佳的EMA濃度。

綜上所述，EMA與分子生物學方法結合在生命科學的各個領域應用前景廣闊，但也有一些弊端，研究學者Kobayashi等[29]采用EMA與熒光定量PCR結合法分析葡萄球菌屬的tuf基因，表明EMA并不是可以將所有死活菌可靠區(qū)分，如金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌，可能原因是該細菌細胞壁較厚。研究表明，一定濃度的表面活性劑在較低濃度下能顯著改變細菌的表面性質(zhì)，具有增加細胞膜通透性的能力[30]，可以有效補充該方法對個別細菌死活菌難以區(qū)分的弊端。另外，反復凍融也可以使細菌細胞膜破裂，Lee等[31]擴增來自鱈魚塊細菌16S rDNA保守區(qū)域的序列，表明反復凍融破碎法導致細胞膜的損傷，通過共聚焦顯微鏡顯示EMA更容易穿透到細菌中。同時，使用其他的核酸插入活力染料疊氮溴化丙錠（PMA），將EMA和PMA在應用分子生物學檢測技術前進行預處理[32-35]。

3 展望

EMA與普通PCR、熒光定量PCR和LAMP等技術結合用于食品中死活菌的檢測效果可靠，集快速、準確、靈敏度高等PCR技術的優(yōu)點和EMA抑制死菌DNA擴增的優(yōu)點于一體，不僅在檢測食品中對人體有害的活體微生物方面應用前景廣泛，在水體微生物、環(huán)境微生物和人畜病原早期快速檢測等方面應用潛力巨大[36-38]。2015年，Gorzata等[39]研究熒光定量PCR可以定量診斷廢水中的死活微生物（大腸桿菌和沙門氏菌），其中EMA預處理是定量分析活菌的關鍵步驟。2007年，Pisz等[40]采用EMA與熒光定量PCR結合研究環(huán)境樣品中的死活菌。2015年，Moreno等[41]采用EMA/PMA與熒光定量PCR結合研究甲型肝炎病毒（HAV）的感染與傳播。

從分子層面上來看，DNA檢測歷經(jīng)了普通PCR和熒光定量PCR方法，實現(xiàn)DNA從定性到相對定量的檢測。數(shù)字PCR（digital PCR，dPCR）是近年來發(fā)展起來基于核酸分子的絕對定量檢測技術，該方法在傳統(tǒng)的PCR擴增前將含有核酸分子的反應體系進行有效分割，通過PCR擴增和熒光信號的積累讀取陽性反應單元數(shù)，再通過泊松分布計算出樣本的DNA分子數(shù)目[42-44]。dPCR的定量檢測限比傳統(tǒng)定量PCR低，特異性和重復性和傳統(tǒng)定量PCR也存在極大的優(yōu)勢。鑒于這種微滴反應能極大程度分散反應體系，可以有效消除抑制因子的作用，保證檢測過程中的擴增效率，對檢測低含量目標核酸分子的樣品有良好的效果[45]。因此，在后續(xù)的研究中，可以將EMA與數(shù)字PCR結合，用于活體微生物絕對定量檢測。

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Advances in Detection of Viable Bacteria Using Ethidium Monoazide Bromide and PCR Technology

Lü Qiang1，JIANG Zhao-xing2，WANG Hai-yan1，ZHAO Lin-li1，CAO Xu2，CUI Qiang1，ZHAO Zhi-guo1，*，GUO Tie-zheng1，LIU Lai-jun1
（1.The Inspection and Quarantine Technology Center of Inner Mongolia Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Hohhot 010020，Inner Mongolia，China；2.Chifeng Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Chifeng 024000，Inner Mongolia，China）

Microbiological examination plays an important part in food safety，but based on the traditional culture method is difficult to achieve result timely and accurate.PCR technology has opened up a new way for the rapid detection of microbes，however，it can not distinguish the dead and viable bacteria.Ethidium monoazide bromide （EMA）combined with PCR，can rapidly and accurately detect viable microorganisms from food，therefore reducing the incidence of food safety incidents.In this review，we summarized recent progresses on EMA combined with PCR，RT-PCR and LAMP technology for detecting the viable bacteria in food.

Ethidium monoazide bromide；PCR technology；viable bacteria

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.24.043

國家質(zhì)檢總局科技計劃項目（2016IK165）

呂嬙（1987—），女（漢），碩士研究生，研究方向：食品科學。

*通信作者：趙治國（1983—），男（蒙古），高級獸醫(yī)師，研究方向：食品安全與動物檢疫。

2017-04-01