蛋白酶K的性質(zhì)及其在核酸提取中的應(yīng)用

劉楊柳，武小芳，胡樹樣，孫紀(jì)錄，馬愛進(jìn)

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北保定071001；2.中國標(biāo)準(zhǔn)化研究院，北京100191）

蛋白酶K的性質(zhì)及其在核酸提取中的應(yīng)用

劉楊柳1，武小芳1，胡樹樣1，孫紀(jì)錄1，馬愛進(jìn)2，*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北保定071001；2.中國標(biāo)準(zhǔn)化研究院，北京100191）

蛋白酶K是一種高活性的絲氨酸蛋白酶，不但廣泛用于分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域的相關(guān)實驗，而且在食品、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用也與日俱增。從本質(zhì)上說，蛋白酶K降解影響核酸提取的組蛋白、核酸酶等蛋白質(zhì)，是其用于各個領(lǐng)域的主要基礎(chǔ)。目前，我國尚無針對核酸提取用蛋白酶K產(chǎn)品的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，從而給蛋白酶K產(chǎn)品的流通、使用和監(jiān)管造成諸多不便和困難。對蛋白酶K的性質(zhì)和酶活力測定方法進(jìn)行分析，并對其在從各種生物材料提取核酸中的應(yīng)用條件進(jìn)行總結(jié)，以期為核酸提取用蛋白酶K制定相關(guān)的方法標(biāo)準(zhǔn)和產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

蛋白酶K；性質(zhì)；酶活力；核酸；提取

蛋白酶K（EC 3.4.21.14）來源于林伯氏白色念球菌（Tritirachium album Limber），是一種與枯草桿菌蛋白酶相關(guān)的絲氨酸蛋白酶。由于它能降解角蛋白（keratin），因此被命名為蛋白酶K[1]。它是一種高活性的廣譜蛋白酶，在變性劑尿素或十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfonate，SDS）溶液中依然能保持較高酶活力，所以被廣泛應(yīng)用于各種生物材料中的DNA或RNA的提取。然而，迄今為止，我國尚未制定核酸提取用蛋白酶K的酶活力測定方法及產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)，從而給該酶制劑的流通、使用和質(zhì)量監(jiān)管造成諸多不便。因此，本文對蛋白酶K的性質(zhì)、酶活力測定方法以及在核酸提取過程中的應(yīng)用條件進(jìn)行總結(jié)分析，以期為核酸提取用蛋白酶K標(biāo)準(zhǔn)的制定與驗證提供參考。

1 蛋白酶K的性質(zhì)

1.1 分子結(jié)構(gòu)

蛋白酶K由一條肽鏈組成，包含277個氨基酸殘基，相對分子質(zhì)量為28 930?；钚圆课挥蒁39、H69和S224組成，底物識別位點主要為G100-Y104和S132-G136兩個片段。蛋白酶K的氨基酸序列與枯草芽孢桿菌蛋白酶具有高度同源性，因此被劃分為枯草芽孢桿菌蛋白酶類。蛋白酶K包含兩個二硫鍵（C34-C124，C179-C248），兩個色氨酸殘基（W8，W212）和一個游離半胱氨酸（C73）[2]。X射線晶體學(xué)研究表明，蛋白酶K的三維結(jié)構(gòu)為一個明確的球形折疊。蛋白酶K屬于α/ β類蛋白質(zhì)，包含6個α-螺旋，15個β-折疊和一個3/ 10螺旋[3]。

1.2 熒光性

蛋白酶K在295 nm處被激發(fā)，它的熒光性由兩個色氨酸殘基W8和W212決定。但是，兩個色氨酸的光反應(yīng)活性表現(xiàn)不同，W212要活潑得多。在pH 3～9范圍內(nèi)，色氨酸熒光量子產(chǎn)率恒定。對已激發(fā)的色氨酸進(jìn)行熱力滅活時，活化能需達(dá)到54 kJ/mol。這個值大幅地高于來自微生物的其他蛋白酶，因此可用來解釋蛋白酶K較高的熱穩(wěn)定性[4]。

1.3 酶學(xué)性質(zhì)

蛋白酶K具有很高的切割活性，底物識別位點能和底物組成一個3股的反平行β片層，可催化脂肪族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽鍵斷裂。α-螺旋是保持蛋白酶K活性中心構(gòu)象穩(wěn)定性的主要結(jié)構(gòu)。α-螺旋共包含90個氨基酸殘基，占?xì)埢倲?shù)的1/3，大部分殘基處在伸展的β-折疊結(jié)構(gòu)中。這使得整個分子有序度低，變性熵不大，比變性焓值極低，反映了酶穩(wěn)定性的本質(zhì)。分子中兩個二硫鍵及兩個Ca2+也對三級結(jié)構(gòu)的熱穩(wěn)定性有貢獻(xiàn)[5]。pH、溫度、Ca2+、激活劑和抑制劑等是影響蛋白酶K活力的主要因素。

1.3.1 pH對蛋白酶K活力的影響

蛋白酶K的催化活性在pH 6～10范圍內(nèi)保持穩(wěn)定，在pH 8～10內(nèi)大幅增加。最適pH為8.0，屬于中性蛋白酶。在pH 3.5～9.0，蛋白酶K分子的三維結(jié)構(gòu)對pH改變不敏感。蛋白酶K在過酸、過堿性環(huán)境中將發(fā)生不可逆變性。

1.3.2 溫度對蛋白酶K活力的影響

蛋白酶K在20℃～60℃范圍內(nèi)保留超過80%的最高活性，在37℃時酶活力最大[6]。65℃保溫10 min～15 min可部分失活。95℃加熱10 min，則完全失活。蛋白酶K的熱變性過程符合三態(tài)模型，存在一個中間態(tài)；蛋白酶K分子內(nèi)部存在酪氨酸殘基對色氨酸殘基的共振能量轉(zhuǎn)移作用[7]。蛋白酶K的構(gòu)象柔性和內(nèi)部運動性強(qiáng)烈依賴于溶劑溫度，而蛋白質(zhì)自身溫度對蛋白酶構(gòu)象柔性的影響程度較低[8]。

1.3.3 Ca2+對蛋白酶K活力的影響

天然蛋白酶K結(jié)合著兩個Ca2+。Ca1被D200的Oδ1、Oδ2和V177的羰基氧原子緊緊固定，而Ca2與 D260的Oδ1、Oδ2和T16的羰基氧原子結(jié)合不牢固[9]。

去除Ca2+會降低酶的熱穩(wěn)定性和一定程度的底物親和力，但對酶的催化活性沒有影響。天然的和去除Ca2+的蛋白酶K具有相似的結(jié)構(gòu)性質(zhì)；蛋白酶K中的一些氫鍵和鹽橋在維持兩個Ca2+位點周圍的構(gòu)象上起關(guān)鍵作用[9]。

若向反應(yīng)體系中引入Ca2+，則會對蛋白酶K催化活性產(chǎn)生影響。在制備高聚合度的RNA過程中，EDTA存在時，蛋白酶K能迅速鈍化DNase I；而加入10 mmol/L Ca2+后，即使蛋白酶濃度高達(dá)1 mg/mL，蛋白酶K也不能鈍化DNase I。在存在或缺少Ca2+條件下，蛋白酶K都能鈍化RNase A（污染DNase的雜質(zhì)）。因此，可在Ca2+存在下用蛋白酶K處理DNase I，以選擇性地去除污染物RNase A，而不會鈍化DNase的活性[10]。

1.3.4 激活劑和抑制劑對蛋白酶K活力的影響

在螯合劑EDTA、巰基試劑、對氯汞苯甲酸（PCMB）、N-甲苯磺酰-L-賴氨酰-氯甲基酮（TLCK）或甲苯磺酰-苯丙氨酸氯甲基酮（TPCK）存在下，蛋白酶K仍可保持穩(wěn)定和活力。變性劑如尿素、SDS（1%）可提高它的催化活性。

蛋白酶K屬于絲氨酸蛋白酶類，因此可以被苯甲基磺酰氟（PMSF）或二異丙基氟磷酸（DFP）抑制。利用一些合成抑制劑可研究抑制劑與蛋白酶K的結(jié)合機(jī)制。Betzel C等使用差值傅里葉法，測定了合成的芐氧羰基-AAA-氯甲基酮抑制劑與蛋白酶K活性中心的結(jié)合模式。抑制物通過兩個共價鍵結(jié)合到蛋白酶K上，一個是在抑制劑的亞甲基碳和起催化作用的His 68的N∈2之間，另一個是在抑制劑的酮碳原子和起催化作用的Ser 221的Oγ之間。此外，由Ser 221的肽鍵NH和Asn 160的側(cè)鏈NH2提供的兩個氫鍵在氧離子洞中支持著半縮酮O-。肽抑制劑進(jìn)一步以氫鍵連接到蛋白酶多肽鏈的一個三股反平行折疊片上[11]。

2 蛋白酶K酶活力測定方法

雖然蛋白酶K催化蛋白質(zhì)水解的能力和特性與其他種類的蛋白酶顯著不同，但是，目前測定蛋白酶K酶活力方法尚無特定的方法，而是沿用一般的蛋白酶活力測定方法，主要有福林（Folin）-酚法、紫外分光光度法、考馬斯亮藍(lán)法等。

2.1 福林酚法

又稱Lowry法。該法以酪蛋白或變性血紅蛋白為底物，在一定的溫度和pH條件下，于680 nm處測定每分鐘內(nèi)產(chǎn)生的相當(dāng)于酪氨酸的顯色呈Folin陽性的氨基酸或多肽的蛋白酶K的量（μmol）。該方法靈敏度較高，但操作耗時，并需嚴(yán)格計時，同時會受到Tris-HCl緩沖液的干擾。

2.2 紫外分光光度法

紫外分光光度法是以酪蛋白為底物，在55℃，pH 8.0的0.01 mol/L Tris-HCl緩沖液中，于275 nm波長處測定1 min內(nèi)蛋白酶K水解酪蛋白產(chǎn)生的L-酪氨酸的量（μg）[12]。

2.3 考馬斯亮藍(lán)法

該法以酪蛋白或牛血清白蛋白為底物，在一定溫度和pH條件下，蛋白酶K水解酪蛋白或牛血清白蛋白，染料考馬斯亮藍(lán)G-250與未被水解的蛋白質(zhì)形成藍(lán)色絡(luò)合物，在595 nm處可快速測定，從而得到蛋白酶酶活力[13]。于潔等在分離純化生姜蛋白酶時，用考馬斯亮藍(lán)染色法測定了酶活力。此法顏色穩(wěn)定，測定快速、準(zhǔn)確，但是會受到SDS、Trition-100等物質(zhì)的干擾[14]。

2.4 其他方法

國內(nèi)外近年來也出現(xiàn)了一些有關(guān)蛋白酶K活性檢測的新方法，例如流動注射分析法、DNA/溴乙錠熒光分析法、人工合成底物法等[15-16]。雖然這些方法提高了底物的特異性，但不易操作，其儀器試劑成本較高，不利于推廣應(yīng)用。

我國現(xiàn)行的涉及蛋白酶酶活力測定方法的標(biāo)準(zhǔn)有GB/T 28715-2012《飼料添加劑酸性、中性蛋白酶活力的測定分光光度法》、GB/T 23527-2009《蛋白酶制劑》和SB/T 10317-1999《蛋白酶活力測定法》等。這些標(biāo)準(zhǔn)對蛋白酶的種類并未作出嚴(yán)格限定，具有普遍性，但是不具有針對性。蛋白酶K被廣泛應(yīng)用于核酸分離提取中，而目前并沒有針對此類用途的蛋白酶K酶活力測定的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。雖然各酶制劑公司通常采用國標(biāo)規(guī)定的福林酚法和紫外分光光度法測定蛋白酶K酶活力，但是其選用的底物及其濃度、緩沖液種類、pH及濃度等影響酶活力的因素參數(shù)卻不盡相同，所以測定結(jié)果也不具有可比性。因此，迫切需要建立核酸提取用蛋白酶K活力測定的專用方法標(biāo)準(zhǔn)，為該酶制劑的質(zhì)量控制和流通使用提供依據(jù)。

3 蛋白酶K在核酸提取中的應(yīng)用

蛋白酶K可用于各種蛋白質(zhì)的消化，包括制備脈沖電泳的染色體DNA，蛋白質(zhì)印跡以及去除DNA和RNA制備中的核酸酶。蛋白酶K在提取核酸中的應(yīng)用涉及到食源性疾病預(yù)防、農(nóng)業(yè)病蟲害的防治、法醫(yī)學(xué)基因鑒定比對和分子生物學(xué)試驗研究等多個領(lǐng)域。應(yīng)用對象包括原核生物、人體血樣及組織、動植物組織、寄生蟲、微生物等類別。蛋白酶K的應(yīng)用條件，如工作濃度、緩沖液種類及濃度、處理時間、處理溫度等條件依據(jù)樣品的不同而變化。

3.1 蛋白酶K在動物細(xì)胞核酸提取中的應(yīng)用

蛋白酶K可以用于昆蟲基因組DNA的分離，作為植物抗蟲性進(jìn)一步研究的基礎(chǔ)。王鈺婷等比較了CTAB（溴化十六烷三甲基銨）法、蛋白酶K法和鹽析法對桑蟥基因組DNA的提取影響。其中，蛋白酶K法是在加入樣品和DNA裂解液后，加入蛋白酶K（20 mg/mL）至終濃度10 μg/mL，45℃水浴1 h。結(jié)果表明，3種方法均可以提取基因組DNA，蛋白酶K法和CTAB法DNA獲得率優(yōu)于鹽析法[17]。韓玉翠等研究了蛋白酶K法和CTAB法對單頭蚜蟲DNA提取產(chǎn)量和質(zhì)量的影響，發(fā)現(xiàn)無論從DNA的產(chǎn)量還是從質(zhì)量上，CTAB法都優(yōu)于蛋白酶K法，能達(dá)到測序要求，且方法簡便，但成功率低于蛋白酶K法，蛋白酶K使用條件為，100 mg/mL的蛋白酶K與樣品、緩沖液、SDS混合，55℃恒溫消化5 h～7 h至澄清[18]。Ferreira STG等研究發(fā)現(xiàn)，與標(biāo)準(zhǔn)方法相比，更高的蛋白酶K量和更長的溫育時間對于從骨中提取DNA質(zhì)量并沒有什么影響。在標(biāo)準(zhǔn)方法中，20 mg/mL蛋白酶K和樣品、緩沖液混合，56℃保溫隔夜處理[19]。

3.2 蛋白酶K在植物細(xì)胞核酸提取中的應(yīng)用

史公軍等利用SDS-蛋白酶K法，即50 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0），10 mmol/L EDTA和0.012%蛋白酶K、10%SDS混合，37℃溫育1 h，從不結(jié)球白菜黃化苗的線粒體中提取DNA。該法所提取的DNA純度高，以此為PCR進(jìn)行RAPD擴(kuò)增，可得到清晰的擴(kuò)增圖譜[20]。席夢利等研究發(fā)現(xiàn)，10 μg/mL的蛋白酶K在37℃孵育30 min，可消化百合花蕾切片中的大部分蛋白質(zhì)，并且材料RNA結(jié)構(gòu)完整[21]。宋洋研究發(fā)現(xiàn)，用20 mg/mL蛋白酶K于42℃，100 r/min溫和振蕩1.5 h提取的棉花幼蕾總RNA完整性較好，純度較高，棉酚褐化現(xiàn)象得到很好的抑制[22]。

3.3 蛋白酶K在微生物核酸提取中的應(yīng)用

任衍春等提取高質(zhì)量水稻紋枯菌（真菌）基因組DNA的最佳方法是蛋白酶K法，工作條件為20 mg/mL的蛋白酶K于37℃水浴1 h[23]。張喆等采用溶菌酶-蛋白酶K法提取單核細(xì)胞增生李斯特菌基因組DNA。結(jié)果表明，利用20 mg/mL的蛋白酶K 58℃溫育50 min，所提取的DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢出限最低，提取的基因組DNA適用于PCR擴(kuò)增和其他分子生物學(xué)研究[24]。袁巧等對比甘氨酸聚乙二醇富集后硅膠膜離心柱法（方法A）和蛋白酶K（200 μg/mL）生物消化（37℃，350 r/min，1 h）后順磁性硅膠基法（方法B）兩種核酸提取方法，發(fā)現(xiàn)方法B的病毒回收率高，快捷，更適合長期監(jiān)測[25]。Villarreal JV等研究了DNase I和蛋白酶K分離去除微生物參考系統(tǒng)和天然飲用水生物被膜中的受傷或死亡細(xì)菌的DNA[26]。

經(jīng)過比較發(fā)現(xiàn)，商品化蛋白酶K推薦工作濃度一般是50 μg/mL～100 μg/mL，反應(yīng)溫度在50℃～65℃。而在國內(nèi)外相關(guān)研究中，應(yīng)用于核酸提取的蛋白酶K工作濃度在50 μg/mL～500 mg/mL范圍，以20 mg/mL應(yīng)用最廣；反應(yīng)緩沖液為Tris-HCl（pH 7.5～8.0），以pH 8.0應(yīng)用最廣；反應(yīng)溫度基本設(shè)定在37℃及45℃～65℃范圍。由此看來，核酸提取用蛋白酶K的應(yīng)用條件沒有統(tǒng)一的規(guī)定，研究者應(yīng)結(jié)合實際情況來確定蛋白酶K具體應(yīng)用條件。

[1] Ebeling W,Hennerich N,Klockow M,et al.Proteinase K from Tritirachium album Limber[J].Eur J Biochem,1974,47(1):91-97

[2] Jany K,Georg L,Barbara M.Amino acid sequence of proteinase K from the mold Tritirachium album Limber[J].FEBS Letters,1986, 199(2):139-144

[3] Ritu T,Dubey V K,Jagannadham M V.Effect of alkyl alcohols on partially unfolded state of Proteinase K:Differential stability of αhelix and β-sheet rich regions of the enzyme[J].Biochimie,2009, 91(8):951-960

[4] Christian B,Pal G P,Mark S,et al.Active-site geometry of proteinase K.Crystallographic study of its complex with a dipeptide chloromethyl ketone inhibitor[J].FEBS Letters,1986,197(1/2):105-110

[5]王邦寧,談夫.水合和pH對蛋白酶K熱誘發(fā)轉(zhuǎn)變影響的量熱法研究[J].物理化學(xué)學(xué)報,1991,7(1):43-48

[6] Bajorath J,Saenger W,Pal G P.Autolysis and inhibition of proteinase K,a subtilisin-related serine proteinase isolated from the fungus Tritirachium album Limber[J].Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Protein Structure and Molecular Enzymology,1988,954: 176-182

[7] 張奇兵,那馨竹,尹宗寧.光譜法表征蛋白酶K的熱變性過程[J].光譜學(xué)與光譜分析,2013,33(7):1749-1753

[8]楊瓊.溶劑溫度對絲氨酸蛋白酶蛋白酶K動力學(xué)行為的影響[D].云南:云南大學(xué),2015

[9] Liu S Q,Tao Y,Meng Z H,et al.The effect of calciums on molecular motions of proteinase K[J].J Mol Model,2011,17(2):289-300

[10]Tullis R H,Rubin H.Calcium protects DNase I from proteinase K:A new method for the removal of contaminating RNase from DNase I [J].Analytical Biochemistry,1980,107(1):260-264

[11]Kore A R,Shanmugasundaram M,Charle I,et al.Synthesis and biological evaluation of modified pentapeptides as potent proteinase K inhibitors[J].Bioorganic and Medicine Chemistry Letters,2010,20 (9):2750-2754

[12]林霖,李淅,潘蘭芳,等.蛋白酶K活性檢測方法建立[J].食品科技,2013,38(2):266-271

[13]周慧,魯治斌,齊杰,等.蛋白水解酶活力測定新方法[J].中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報,1994,10(5):630-632

[14]于潔,肖超妮,王世祥,等.測定生姜蛋白酶活性的新方法[J].熱帶作物學(xué)報,2011,32(8):1475-1478

[15]陳安和.幾種蛋白酶活力測定新方法[J].生命的化學(xué),1997,17(6): 41-43

[16]Severini A,Morgan A R.An assay for proteinases and their inhibitors based on DNA/ethidium bromide fluorescence[J].Analytical Biochemistry,1991,193(1):83-89

[17]王鈺婷,汪泰初,李瑞雪,等.3種桑蟥基因組DNA提取方法比較研究[J].中國農(nóng)村小康科技,2014,4(12):95-98

[18]韓玉翠,呂芃,侯升林,等.2種蚜蟲DNA提取方法的比較與改進(jìn)研究[J].中國農(nóng)學(xué)通報,2014,30(16):272-277

[19]Ferreira S T G,Paula K A,Maia F A,et al.Do the amount of Proteinase K and the incubation time of samples make a difference in DNA extraction from bones?A comparative study of protocols[J]. Forensic Science International:Genetics Supplement Series,2013, 4(1):370-371

[20]史公軍,王彥華,侯喜林.不結(jié)球白菜線粒體DNA的提取及分析[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報,2004,13(1):52-54

[21]席夢利,潘梅,施季森.麝香百合花蕾組織原位雜交體系的建立[J].分子植物育種,2011,9(4):514-518

[22]宋洋.棉花恢復(fù)系幼蕾cDNA文庫構(gòu)建及發(fā)育相關(guān)基因的克隆[D].北京:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院,2007

[23]任衍春,張震,毛雪琴,等.水稻紋枯菌總DNA提取方法的比較[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報,2011,23(4):741-747

[24]張喆,呂淑霞,祝儒剛,等.單增李斯特菌基因組DNA提取方法比較[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,39(2):67-69

[25]袁巧,李暉,鄧小玲,等.牡蠣中諾如病毒核酸兩種提取方法比較[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2013,33(4):568-572

[26]Villarreal J V,Jungfer C,Obst U,et al.DNase I and Proteinase K eliminate DNA from injured or dead bacteria but not from living bacteria in microbial reference systems and natural drinking water biofilms for subsequent molecular biology analyses[J].Journal of Microbiol Methods,2013,94(3):161-169

Properties of Proteinase K and Its Application in Nucleic Acid Extraction

LIU Yang-liu1，WU Xiao-fang1，HU Shu-yang1，SUN Ji-lu1，MA Ai-jin2，*
（1.College of Food Science and Technology，Hebei Agricultural University，Baoding 071001，Hebei，China；2.China National Institute of Standardization，Beijing 100191，China）

Proteinase K，a kind of serine proteinases with high activity，is not only widely used in the related experiments of molecular biology and cell biology，but also increasingly applied to food，agriculture，medicine and other fields.In essence，proteinase K can degrade histone，nuclease and other proteins that affect the extraction of nucleic acid，which is the main foundation of its application in various fields.At present，there is not any uniform standards about proteinase K production specifically used for the extraction of nucleic acid in China，which causes much inconvenience and difficulty in the circulation，application and supervision.In this essay，the property and detection method about enzyme activity of proteinase K were analyzed，and its actual application conditions in the extraction of nucleic acid from different biomaterials were also summarized.The paper was aimed at providing some reference for the formulation of method standards and production standards related to proteinase K used for the extraction of nucleic acid.

proteinase K；property；enzyme activity；nucleic acid；extraction

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.10.044

2016-08-21

質(zhì)檢公益性行業(yè)科研專項（201510208-2）

劉楊柳（1992—），女（漢），碩士研究生，研究方向：食品工程。

*通信作者：馬愛進(jìn)（1975—），男，研究員，博士。