修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1基因單核苷酸多態(tài)性與彌漫大B淋巴瘤發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)及亞型的相關(guān)性

蘇 蕊 黃 耘 王思力

(廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液科，福建 廈門 361003)

修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1基因單核苷酸多態(tài)性與彌漫大B淋巴瘤發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)及亞型的相關(guān)性

蘇 蕊 黃 耘 王思力

(廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液科，福建 廈門 361003)

目的 探討修復(fù)交叉互補(bǔ)基因(ERCC)1單核苷酸多態(tài)性與彌漫大B淋巴瘤(DLBCL)發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)及亞型的相關(guān)性。方法 DLBCL患者108例，根據(jù)病理亞型分為活化B細(xì)胞型組(ABC組)和生發(fā)中心型組(GCB組)各54例。另選取同期該院體檢中心體檢的健康人群54例作為對(duì)照組，采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)方法進(jìn)行ERCC119007 T>C和ERCC18092 C>A位點(diǎn)多態(tài)性檢測(cè)，分析ERCC1基因單核苷酸多態(tài)性與DLBCL發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)及亞型的相關(guān)性。結(jié)果 3組ERCC1基因型中19007 T>C的TT和CT+CC分布頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而8092 C>A的CC和CA+CC分布頻率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；4個(gè)單體型中2種單體型頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義：?jiǎn)误w型C-C-C降低了個(gè)體DLBCL患病的風(fēng)險(xiǎn)(OR=0.589，P=0.039)，單體型T-C-T則提高了個(gè)體DLBCL患病的風(fēng)險(xiǎn)(OR=0.915，P=0.025)；TT和CT基因型發(fā)生不同亞型DLBCL發(fā)病危險(xiǎn)明顯高于CC基因型，且高分化和高分期患者的CT+CC基因型分布頻率高于低分化和低分期患者(P<0.05)。結(jié)論 ERCC1基因19007 T>C位點(diǎn)多態(tài)性與DLBCL發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)及亞型發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，攜帶該基因2種不同單體型的個(gè)體在DLBCL發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)及亞型患病風(fēng)險(xiǎn)上存在差異。

ERCC1基因；單核苷酸多態(tài)性；彌漫大B淋巴瘤；活化B細(xì)胞型；生發(fā)中心型

彌漫大B淋巴瘤(DLBCL)是最常見的非霍奇金淋巴瘤亞型，即典型的多基因病。修復(fù)交叉互補(bǔ)基因(ERCC)1單核苷酸多態(tài)性是人類基因組DNA中特定位置上單個(gè)核苷酸變異引起的DNA多態(tài)性〔1〕。多方面的研究顯示ERCC1基因單核苷酸多態(tài)性與神經(jīng)膠質(zhì)瘤、鼻咽癌、頭頸部鱗癌等腫瘤的發(fā)病有關(guān)〔2〕。也有研究認(rèn)為低表達(dá)ERCC1基因的患者對(duì)含有鉑類的化療方案較為敏感，其預(yù)后優(yōu)于高表達(dá)ERCC1基因患者〔3〕。DLBCL主要分為生發(fā)中心型(GCB型)、活化B細(xì)胞型(ABC型)及縱隔大B型等亞型〔4〕。目前國內(nèi)外關(guān)于ERCC1基因單核苷酸多態(tài)性與DLBCL 的相關(guān)性研究報(bào)道極少。本研究旨在探討ERCC1基因單核苷酸多態(tài)性與DLBCL發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)及亞型的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2011年5月至2015年5月我院血液科收治的DLBCL患者108例，診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2008年第4版《造血和淋巴組織腫瘤》WHO分類〔5〕，并經(jīng)組織病理學(xué)檢查確診。所有患者臨床治療采用以CHOP(環(huán)磷酰胺+多柔比星+長(zhǎng)春新堿+潑尼松)為主的方案化療6～8個(gè)療程。根據(jù)病理亞型分為ABC組和GCB組各54例，另選取同期我院體檢中心體檢的健康人群54例作為對(duì)照組。ABC組男29例，女25例，年齡(52.3±10.5)歲，淋巴瘤國際預(yù)后指數(shù)(IPI)評(píng)分(3.2±0.5)分，Ⅰ期18例，Ⅱ期21例，Ⅲ期8例，Ⅳ期7例；GCB組男28例，女26例，年齡(53.2±11.5)歲，IPI評(píng)分(3.6±0.5)分，Ⅰ期19例，Ⅱ期20例，Ⅲ期9例，Ⅳ期6例；對(duì)照組男30例，女24例，年齡(51.9±12.5)歲，IPI評(píng)分(1.2±0.1)分，3組基本資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 方法 主要試劑：TaqDNA聚合酶試劑、dNTPs、蛋白酶K、電泳瓊脂糖、DNA marker、飽和酚。主要儀器設(shè)備：PCR擴(kuò)增儀、紫外分光光度計(jì)、電泳儀、凝膠成像分析系統(tǒng)。

1.2.1 DNA的提取 采集DLBCL患者的外周血及體檢健康者靜脈血各2 ml，用乙二胺四乙酸二鉀(EDTA2K2)抗凝，嚴(yán)格按照試劑盒的說明書進(jìn)行操作，提取基因組DNA，-70℃保存。

1.2.2 ERCC1基因多態(tài)性位點(diǎn)基因型檢測(cè) 基于美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫獲得相關(guān)基因位點(diǎn)外顯子序列，設(shè)計(jì)相關(guān)外顯子的引物；PCR引物序列：19007 T>C的上游引物為5'-ACGTTGGATGGCACATAGTCGGGAATTACG-3'，下游引物為5'-ACGTTGGATGGGCAATCCCGTACTGAAGTT-3'；8092 C>A的上游引物為5'-ACGTTGGATGCGGATTCTATTGGCTCCGTC-3'，下游引物為5'-ACGTTGGATGGGAGGGCGTCCAGATGCTA-3'。用設(shè)計(jì)的引物序列對(duì)DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后的序列進(jìn)行序列測(cè)定。對(duì)測(cè)序獲得的堿基序列與NCBI中的ERCC1基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，并結(jié)合臨床表型數(shù)據(jù)，進(jìn)行單核苷酸基因型判讀。

1.2.3 PCR擴(kuò)增 10倍緩沖液2 μl，MgCl22.1 μl，dNTP 0.4 μl，上下游引物均為0.4 μl，TaqDNA聚合酶0.25 μl，DNA模板2 μl，雙蒸水補(bǔ)足至20 μl。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性45 s、52℃退火45 s、72℃延伸1 min，32個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用1.5%瓊脂糖電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶37℃水浴16 h消化后，酶切產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，即得到ERCC1基因單核苷酸多態(tài)性的基因分型。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0 軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)、方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 3組ERCC1基因型分布頻率比較 3組ERCC1基因型中19007 T>C的TT和CT+CC分布頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而8092 C>A的CC和CA+CC分布頻率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.2 ERCC1基因SNPs間配對(duì)單體型頻率比較 4個(gè)單體型中2種單體型頻率有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義：?jiǎn)误w型C-C-C(ABC組32.2%，GCB組31.8%，對(duì)照組27.6%)，降低了個(gè)體DLBCL患病的風(fēng)險(xiǎn)(OR=0.589，95%CI：0.987～1.574，P=0.039)；單體型T-C-T(ABC組33.3%，GCB組31.5%，對(duì)照組40.7%)，提高個(gè)體DLBCL患病的風(fēng)險(xiǎn)(OR=0.915，95%CI：0.845～1.254，P=0.025)。單體型C-A-T ABC組頻率56.5%，GCB組55.6%，對(duì)照組65.7%，P=1.022，OR=0.265，95%CI：0.598～1.254；C-C-T ABC組43.4%，GCB組41.5%，對(duì)照組54.3%，P=0.895，OR=0.248，95%CI：0.689～1.986。

2.3 不同亞型DLBCL發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)與ERCC1基因型分布比較 TT和CT基因型發(fā)生不同亞型DLBCL發(fā)病危險(xiǎn)與CC基因型比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而且高分化和高分期患者的CT+CC基因型分布率分別高于低分化和低分期患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表1 3組ERCC1基因型分布頻率比較〔n(%),n=54〕

表2 不同亞型DLBCL發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)與ERCC1基因型分布比較〔n(%),n=54〕

3 討 論

ERCC1基因作為DNA損傷修復(fù)的重要基因，第4外顯子的T19007C和3'非編碼區(qū)的C8092A是ERCC1基因比較常見的兩種單核苷酸多態(tài)。其中，第4外顯子的T19007C可使118號(hào)密碼子的編碼序列發(fā)生改變，出現(xiàn)單核苷酸 C-T的改變，導(dǎo)致ERCC1基因118的密碼子存在3種等位基因型，即基因型C/C、C/T、T/T。雖然改變后的C/T、T/T基因型編碼序列仍編碼天冬酰胺氨基酸，但ERCC1基因的轉(zhuǎn)錄水平升高，導(dǎo)致細(xì)胞的ERCC1蛋白表達(dá)升高，最終引起細(xì)胞核苷酸切除修復(fù)能力的加強(qiáng)〔6,7〕。ERCC1基因3'非編碼區(qū)的C8092A轉(zhuǎn)變可能通過使ERCC1 mRNA轉(zhuǎn)錄受到抑制或者使mRNA穩(wěn)定性降低而導(dǎo)致細(xì)胞的DNA核苷酸切除修復(fù)能力降低。有研究〔8〕發(fā)現(xiàn)亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)677CT和TT基因型能夠降低DLBCL的易感性，而1298CC基因型能夠增加T細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。而本研究結(jié)果顯示19007 T>C的CT和TT可以增加DLBCL發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，而且單體型中的T-C-T增加了DLBCL發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，C-C-C降低了DLBCL發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，而且ABC亞型和GCB亞型的DLBCL均可以增加其發(fā)病危險(xiǎn)。以往的研究〔9～11〕對(duì)DLBCL的MTHFR基因的單核苷酸位點(diǎn)的研究顯示CT和TT基因型能夠降低DLBCL的易感性，CC增加DLBCL的發(fā)病危險(xiǎn)；腫瘤壞死因子(TNF)和白細(xì)胞介素(IL)-10基因的單核苷酸位點(diǎn)的研究顯示TNF和IL-10的GA和AA可以增加DLBCL發(fā)病危險(xiǎn)；氧化應(yīng)激基因的單核苷酸位點(diǎn)的GA和AA可以增加DLBCL發(fā)病危險(xiǎn)；關(guān)于預(yù)后基因的單核苷酸位點(diǎn)的GG增加了DLBCL的發(fā)病危險(xiǎn)。這些研究均對(duì)DLBCL的易感性和預(yù)后基因型的多態(tài)性進(jìn)行分析〔12〕。但是將不同亞型的DLBCL應(yīng)用于其發(fā)病危險(xiǎn)的研究及ERCC1基因單核苷酸位點(diǎn)多態(tài)性對(duì)不同亞型的DLBCL的發(fā)病危險(xiǎn)沒有詳細(xì)的報(bào)道，本研究結(jié)果顯示除了ERCC1基因單核苷酸多態(tài)性的TT+CC對(duì)DLBCL發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)及亞型有關(guān)，還與患者的分化及分級(jí)程度有關(guān)。

1 章 艷,賈祝霞,盧緒章,等.BCL-2,BCL-6及p53基因異常在彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤患者中的預(yù)后價(jià)值〔J〕.右江醫(yī)學(xué),2013;41(5):650-2,封4.

2 王 旭,王春波,鄂明艷,等.ERCC1基因單核苷酸多態(tài)性與非小細(xì)胞肺癌的相關(guān)研究進(jìn)展〔J〕.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué),2013;21(8):1899-901.

3 Rojas L,Cardona AF,Arrieta O,etal.P1.42(also presented as PD2.04):PEM/CBP/BEV followed by maintenance PEM/BEV in hispanic patients with NSCLC:outcomes according to TS,ERCC1 and VEGF:track:advanced NSCLC〔J〕.J Thorac Oncol,2016;11(10S):S208-S209.

4 韋素華,張 梅,王夢(mèng)昌,等.生發(fā)中心與非生發(fā)中心型彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)病特點(diǎn)及預(yù)后因素分析〔J〕.西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2014;35(5):710-3.

5 李順義.重視WHO(2008)造血與淋巴組織腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)的普及和推廣〔J〕.疑難病雜志,2012;11(8):573-4.

6 Bahceci A,Paydas S,Tanriverdi K,etal.DNA repair gene polymorphisms in B cell non-Hodgkin's lymphoma〔J〕.Tumour Biol,2015;36(3):2155-61.

7 Xu P,Chen B,Feng J,etal.Polymorphisms in XPC provide prognostic information in acute myeloid leukemia〔J〕.Int J Hematol,2012;96(4):450-60.

8 廖小莉,謝偉敏,胡曉樺,等.XPD Lys751 Gln基因多態(tài)性與非霍奇金淋巴瘤化療后生存期及白細(xì)胞抑制的關(guān)系〔J〕.腫瘤學(xué)雜志,2013;19(2):113-7.

9 李素霞,朱宏麗,郭 搏,等.XPD基因多態(tài)性與非霍奇金淋巴瘤的相關(guān)性〔J〕.解放軍醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2014;35(8):853-7.

10 蘇國蘭.ERCC1蛋白在非霍奇金淋巴瘤組織中的表達(dá)及其臨床意義〔D〕.南寧：廣西醫(yī)科大學(xué),2011.

11 張海燕,李紅玉,李 迅.HLA-Ⅱ類基因多態(tài)性與霍奇金淋巴瘤相關(guān)性的Meta分析〔J〕.實(shí)用腫瘤雜志,2016;31(2):169-73.

12 Lauc G,lluffman JE,Pucic M,etal.Loci associated with N-glycosylation of human immunoglobulin G show pleiotropy with autoimmune diseases and haematological cancers〔J〕.PLoS Genet,2013;9(1):e1003225.

〔2016-10-11修回〕

(編輯 袁左鳴)

2014年廈門市科技計(jì)劃科技惠民項(xiàng)目(No.3502Z20144003)

王思力(1975-)，女，博士，副主任醫(yī)師，主要從事淋巴瘤基礎(chǔ)與臨床研究。

蘇 蕊(1977-)，女，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事血液系統(tǒng)疾病研究。

R733

A

1005-9202(2017)06-1409-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.06.045