缺氧誘導(dǎo)因子-1α和Survivin蛋白在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及其與人乳頭狀瘤病毒感染的相關(guān)性

周 穎 趙 敏 張 輝 謝永紅 李曉超 尹端端

(秦皇島市第一醫(yī)院病理科，河北 秦皇島 066000)

缺氧誘導(dǎo)因子-1α和Survivin蛋白在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及其與人乳頭狀瘤病毒感染的相關(guān)性

周 穎 趙 敏 張 輝 謝永紅1李曉超 尹端端2

(秦皇島市第一醫(yī)院病理科，河北 秦皇島 066000)

目的 研究非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α和Survivin蛋白的相關(guān)性并分析HIF-1α和Survivin與人乳頭狀瘤病毒(HPV)感染的相關(guān)性。方法 應(yīng)用免疫組化法檢測60例NSCLC及20例肺良性病變組織中HIF-1α、Survivin蛋白的表達(dá)，應(yīng)用PCR方法選用HPV16、18型特異性引物檢測兩組中HPV DNA的表達(dá)。 結(jié)果 ①NSCLC中HIF-1α和Survivin的表達(dá)陽性率分別為48.3%和38.3%，肺良性病變組均未見陽性表達(dá)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。②NSCLC中HIF-1α的表達(dá)率與Survivin呈正相關(guān)(r=0.335,P<0.05)。③HPV DNA檢出率NSCLC組為41.7%，肺良性病變組5.0%，二者有顯著差異(P<0.05)。④HPV DNA陽性組與陰性組間HIF-1α的陽性表達(dá)率分別為52.0%和45.7%，無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。HPV DNA陽性組與陰性組間Survivin的陽性表達(dá)率分別為36.0%和40.0%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 HIF-1α與Survivin在NSCLC的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用；HPV感染可能是NSCLC發(fā)生的病因?qū)W因素之一；然而NSCLC中HIF-1α、Survivin表達(dá)與HPV感染均無協(xié)同作用。

非小細(xì)胞肺癌；缺氧誘導(dǎo)因子-1α；Survivin蛋白；人乳頭狀瘤病毒

缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α在肺癌、乳腺癌等多種腫瘤組織中過度表達(dá)。HIF-1α可使Survivin蛋白表達(dá)增高，推測HIF-1α可能在介導(dǎo)Survivin的轉(zhuǎn)錄活化中發(fā)揮重要作用。人乳頭狀瘤病毒(HPV)是一種DNA病毒，感染人和動物的皮膚或黏膜可引起增殖性損傷。近年來，研究檢測出肺癌患者攜帶HPV〔1，2〕，尤其是HPV 16、18型。但HPV感染與肺癌的關(guān)系，目前說法不一。然而在肺癌中HIF-1α、Survivin與HPV感染的關(guān)系尚未見報道。本文研究非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中HIF-1α和Survivin的相關(guān)性，探討HIF-1α和Survivin在NSCLC發(fā)生發(fā)展中的作用，并分析他們與HPV感染的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本 收集秦皇島市第一醫(yī)院2012年1～5月NSCLC新鮮標(biāo)本60例，男46例，女14例；年齡36～80歲；鱗癌42例，腺癌18例；高分化12例，中分化29例，低分化19例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30例，吸煙者43例。20例肺良性病變組織，包括肺結(jié)核6例，炎性假瘤5例，硬化性血管瘤4例，肺大皰4例，支氣管擴(kuò)張1例。標(biāo)本取材后，部分置-20℃保存，部分40%甲醛固定，石蠟包埋。

1.2 HPV PCR檢測

1.2.1 引物 選用分別用來擴(kuò)增HPV16、18型的特異性引物2對。引物均由北京奧科生物公司合成。HPV16E6正義鏈5′-CTG CAA GCA ACA GTT ACT GCG ACG-3′;反義鏈5′-CAT ACA TCG ACC GGT CCA CC-3′；長度315 bp；HPV18E7正義鏈5′-GAG CCG AAC CAC AAC GTC AC-3′；反義鏈5′-GGA TGC ACA CCA CGG ACA CA-3′；長度152 bp。

1.2.2 組織DNA的提取 取適量凍存組織，加提取緩沖液制成單細(xì)胞懸液后，沸水浴10 min，冷卻至室溫加蛋白酶K消化，酚-氯仿-異戊醇反復(fù)抽提3次，再經(jīng)100%冰冷無水乙醇沉淀、70%冰冷無水乙醇洗滌后，加TE〔10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)，pH8.0〕緩沖液溶解所得DNA并4℃保存。

1.2.3 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系：每25 μl反應(yīng)體系中包含 10×倍緩沖液 2.5 μl，20 pmol/μl引物各0.5 μl，Taq酶1 μl(1 U/μl)，Mg2+1.5 μl，dNTPs 0.5 μl，去離子水16.5 μl及DNA模板2 μl。擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min，循環(huán)特征為94℃ 45 s，55℃ 45 s，72℃ 45 s，共30個循環(huán)，72℃延伸8 min。每次實驗以不加模板為陰性對照，HPV16、18型分別用Siha和Hela細(xì)胞株DNA作陽性對照。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用加有溴乙啶的1.5%瓊脂糖凝膠，80 V電壓下電泳約40 min，于紫外透射儀上觀察結(jié)果。

1.3 HIF-1α、Survivin免疫組化檢測 HIF-1α抗體、Survivin抗體及通用型SP試劑盒均購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司，染色步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。一抗稀釋濃度為1∶100。陰性對照用PBS代替一抗。

HIF-1α陽性表達(dá)為細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃或棕褐色顆粒，Survivin陽性表達(dá)為胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃或棕褐色顆粒，顯色結(jié)果由兩位病理醫(yī)生采用半定量評分系統(tǒng)獨立判定。每例均高倍鏡下(×400)隨機(jī)選擇5個視野，每個視野計數(shù)200個細(xì)胞，取平均值，用半定量積分法判斷結(jié)果：0分陰性；1分<25%；2分25%～75%；3分>75%。陽性強度：1分弱表達(dá)(淺黃色)；2分中等強度表達(dá)(棕黃色)；3分強表達(dá)(棕褐色)。兩者積分相乘，0～1分為陰性(-)，2～3分為弱陽性(±)，4～6分為中等陽性(+)，7～9分為強陽性()。就其結(jié)果進(jìn)行分析，將-、±合并為“-”，+、合并為“+”，以簡化數(shù)據(jù)處理。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，組間比較采用χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 HIF-1α、Survivin的檢測結(jié)果及兩者的相關(guān)性 NSCLC中HIF-1α的陽性表達(dá)位于細(xì)胞核(圖1)，陽性率為48.3%(29/60)，肺良性病變組未見陽性表達(dá)，二者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=15.163,P<0.05)。Survivin的陽性表達(dá)位于胞質(zhì)(圖1)，陽性率為38.3%(23/60)，肺良性病變組未見陽性表達(dá)，二者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=10.760,P<0.05)。HIF-1α陽性組中Survivin的表達(dá)率55.2%(16/29)，明顯高于HIF-1α陰性組〔22.6%(7/31)，χ2=6.733，P<0.05〕，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，兩者呈正相關(guān)(r=0.335,P<0.05)。

2.2 NSCLC中HIF-1α、Survivin表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 NSCLC組中HIF-1α表達(dá)與性別、年齡、吸煙、組織學(xué)分型無關(guān)，與組織分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。NSCLC組中Survivin表達(dá)與性別、年齡、吸煙、組織學(xué)分型、組織分化程度無關(guān)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)。見表1。

2.3 HPV DNA的PCR檢測結(jié)果及與臨床病理特征的關(guān)系 HPV DNA檢出率NSCLC組為41.7%(25/60)，肺良性病變組5.0%(1/20)，二者有顯著差異(χ2=9.193,P<0.05,圖2)；HPV16、18型特異性引物分型檢測，HPV16型12例，檢出率為48.0%(12/25)，18型13例，檢出率為52.0%(13/25)。NSCLC組HPV感染與性別、年齡、吸煙、組織學(xué)分型無關(guān)，而與組織分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05)。見表1。

2.4 NSCLC中HIF-1α、Survivin的表達(dá)與HPV感染的關(guān)系 HPV DNA陽性組與陰性組間HIF-1α的陽性表達(dá)率分別為52.0%(13/25)和45.7%(16/35)，二者差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.231，P=0.631)。HPV DNA陽性組與陰性組間Survivin的陽性表達(dá)率分別為36.0%(9/25)和40.0%(14/35)，二者差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.099，P=0.753)。

表1 NSCLC中HIF-1α、Survivin陽性表達(dá)及HPV感染陽性表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系〔n(%)〕

圖1 NSCLC中HIF-1α及Survivin陽性表達(dá)(DAB，×400)

M：Marker；1、2：HPV16 陽性、陰性對照；3、4：HPV16；5、6：HPV18 陽性、陰性對照；7、8：HPV18圖2 PCR檢測HPV16、18型DNA擴(kuò)增結(jié)果電泳圖

3 討 論

HIF-1是由α、β亞單位構(gòu)成的異二聚體，其中HIF-1α受缺氧的調(diào)節(jié)。缺氧是實體腫瘤微環(huán)境特征之一。在細(xì)胞缺氧時，細(xì)胞核中HIF-1α顯著增加。HIF-1α不僅調(diào)節(jié)眾多的下游基因以維持或促進(jìn)腫瘤的血管形成和腫瘤的發(fā)展，而且可反饋接受腫瘤生長過程中產(chǎn)生的因子或缺氧環(huán)境上調(diào)表達(dá)，如此形成惡性循環(huán)促進(jìn)腫瘤生長、浸潤和轉(zhuǎn)移〔3〕。本研究提示HIF-1α在NSCLC的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，與組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，與Swinson等〔4〕的結(jié)果基本一致。高分化型HIF-1α的表達(dá)率低于中、低分化型，推測腫瘤分化程度降低，缺氧程度明顯加重，HIF-1α表達(dá)上調(diào)，通過與缺氧反應(yīng)元件作用便利于腫瘤克服缺氧并誘導(dǎo)新生血管形成，浸潤生長。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組HIF-1α的表達(dá)率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組。有研究報道HIF-1α通過調(diào)節(jié)其下游基因VEGF誘導(dǎo)腫瘤新生淋巴管形成；同時上調(diào)COX-2，促使癌細(xì)胞對基質(zhì)的黏附性增加，E-cadherin蛋白水平下降，使癌細(xì)胞易于轉(zhuǎn)移，提示HIF-1α是NSCLC發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵步驟，并參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移〔5〕。

Survivin是凋亡抑制蛋白家族的新成員，是迄今發(fā)現(xiàn)最強的凋亡抑制因子，在人類多種腫瘤組織中異常表達(dá)〔6,7〕。Survivin具有抑制細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和細(xì)胞分裂的雙重功能，表達(dá)于細(xì)胞周期的G2/M期，定位于細(xì)胞有絲分裂的紡錘體上，通過直接或間接抑制Caspase活性而發(fā)揮抗凋亡作用。本研究提示Survivin是NSCLC發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中的重要因子。陳余清等〔8〕對Survivin啟動子5'上游非編碼序列生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，Survivin核心啟動子位于TSS上游-203～+64 bp處，其中-19～16 bp和-133～136 bp兩處存在潛在的HIF-1α結(jié)合位點。Peng等〔9〕在乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，在乏氧或常氧條件下，表皮生長因子(EGF)誘導(dǎo)表達(dá)的HIF-1α蛋白可通過結(jié)合Survivin核心啟動子片段(-203～+27 bp)中的潛在HIF-1α位點，上調(diào)Survivin表達(dá)。另外，有研究發(fā)現(xiàn)在胰腺癌，結(jié)直腸癌中過表達(dá)的HIF-1α上調(diào)Survivin表達(dá)〔10〕。體外研究采用HIF-1α基因沉默導(dǎo)致Survivin的表達(dá)下調(diào)，表明兩者存在顯著正相關(guān)〔11〕。陳中建〔12〕和張曉燕等〔13〕研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α對Notch和胰島素樣生長因子受體誘導(dǎo)的Survivin的表達(dá)有協(xié)調(diào)作用，表明HIF-1α在Survivin的表達(dá)調(diào)控中起著非常重要的作用。本研究提示Survivin可能是HIF-1α的靶基因之一，HIF-1α通過上調(diào)Survivin的表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，兩者在NSCLC發(fā)生發(fā)展中起協(xié)同作用。本研究顯示，Survivin的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，說明Survivin的表達(dá)預(yù)示腫瘤有較高的侵襲性和不良預(yù)后。

HPV感染是宮頸癌的主要病因，然而近年來HPV感染與肺癌的關(guān)系已經(jīng)引起人們的重視〔14〕。本研究提示HPV感染可能是NSCLC發(fā)生的病因?qū)W因素之一。HPV感染與NSCLC患者臨床病理資料的關(guān)系目前尚未明確，本研究發(fā)現(xiàn)HPV感染與性別、年齡、吸煙、組織學(xué)分型無關(guān)，與組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。高分化型NSCLC HPV DNA的檢出率低于中、低分化型，可能是由于分化成熟的細(xì)胞退出了細(xì)胞周期，細(xì)胞不再具有分裂能力，細(xì)胞內(nèi)僅有少量病毒復(fù)制所需的復(fù)制酶。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組HPV DNA的檢出率高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組。Lane等〔15〕報道HPV(+)的腫瘤細(xì)胞株與HPV(-)的相比血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達(dá)水平普遍升高。Lopez-ocejo等〔16〕認(rèn)為HPV E6可能如一些原癌基因一樣能夠使VEGF表達(dá)增強。VEGF不僅誘導(dǎo)血管生成，還可誘導(dǎo)腫瘤外周形成新的淋巴管，促進(jìn)癌細(xì)胞通過淋巴管轉(zhuǎn)移到淋巴結(jié)。由此推測HPV感染與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可能存在一定的相關(guān)性。

HIF-1α與HPV感染之間的關(guān)系國內(nèi)外研究較少，其可能的聯(lián)系有：野生型P53蛋白可通過直接抑制HIF-1α轉(zhuǎn)錄活性和通過促進(jìn)mdm2介導(dǎo)的HIF-1α泛素化-蛋白酶降解兩種形式抑制HIF-1α活性。而Munger〔17〕報道HPV16、18型E6可以降解野生型P53蛋白。本課題組先前研究也發(fā)現(xiàn)，HPV DNA陽性組P53基因的突變失活率明顯高于HPV DNA陰性組。推測HPV16、18型E6可能通過降解野生型P53蛋白，誘導(dǎo)P53基因突變，從而促進(jìn)HIF-1α的積聚〔18〕，但本研究未發(fā)現(xiàn)兩者有相關(guān)性。Muzio等〔19〕發(fā)現(xiàn)在HPV陽性的鱗狀細(xì)胞癌中Survivin亦呈高表達(dá)，然而本研究未發(fā)現(xiàn)NSCLC中Survivin表達(dá)與HPV感染有關(guān)聯(lián)。

綜上所述，HIF-1α與Survivin在NSCLC的發(fā)生發(fā)展中具有重要協(xié)同作用，檢測NSCLC組織中HIF-1α、Survivin的表達(dá)，可以為臨床判斷腫瘤的惡性程度及預(yù)后提供有效參考，同時為靶向HIF-1α的抗腫瘤治療提供理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。

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〔2015-08-19修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

秦皇島市科技支撐計劃項目(2012023A135)

趙 敏(1973-)，女，主任醫(yī)師，博士，主要從事腫瘤病理研究。

周 穎(1981-)，女，主治醫(yī)師，碩士，主要從事腫瘤病理研究。

R734.2

A

1005-9202(2017)06-1406-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.06.044

1 秦皇島市第一醫(yī)院科教科 2 秦皇島市第一醫(yī)院腫瘤科