異甘草酸鎂對H22肝癌荷瘤小鼠核因子-κB p65、腫瘤壞死因子-α、血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)的影響

任炳楠 楊玉鵬 張煥玲 劉洪濤 田冬冬 吳 茵 魏 欣

(河北省人民醫(yī)院，河北 石家莊 050051)

異甘草酸鎂對H22肝癌荷瘤小鼠核因子-κB p65、腫瘤壞死因子-α、血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)的影響

任炳楠 楊玉鵬 張煥玲1劉洪濤 田冬冬 吳 茵 魏 欣

(河北省人民醫(yī)院，河北 石家莊 050051)

目的 探討異甘草酸鎂(MGIG)對肝癌小鼠模型肝癌前病變的作用。方法 通過H22細(xì)胞皮下注射建立肝癌動物模型,在制模過程中給予MGIG 50 mg/kg和5-Fu 10 mg/kg進(jìn)行干預(yù),通過免疫組化法檢測肝組織中的核因子(NF)-κB p65、血管內(nèi)皮生長因子(TNF)-α和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達(dá)，同時檢測血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)。結(jié)果 MGIG+5-Fu組的NF-κB p65、TNF-α和VEGF表達(dá)和血清ALT、AST水平均小于5-Fu組和陽性對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05%)。結(jié)論 MGIG對小鼠肝癌病變有一定的抑制作用，這種作用可能與抑制腫瘤細(xì)胞炎癥因子有關(guān)。

肝癌;異甘草酸鎂;核因子κB p65；腫瘤壞死因子α；血管內(nèi)皮生長因子；H22細(xì)胞

異甘草酸鎂(MGIG)是第4代甘草制劑，具有保護(hù)肝細(xì)胞膜、改善肝功能、延緩肝纖維化的作用，對急性肝損傷具有良好的防治作用〔1〕。研究表明甘草酸對肝纖維化過程中的炎性因子有抑制作用〔2〕，但其在肝癌中的作用尚需進(jìn)一步證實。本研究應(yīng)用H22細(xì)胞移植小鼠肝癌模型研究MGIG對小鼠肝組織中核因子(NF)-κB p65、腫瘤壞死因子(TNF)-α和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達(dá)情況和血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)水平的影響，探討MGIG對肝癌細(xì)胞炎性因子的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 動物 健康雄性昆明小鼠,6周齡,體質(zhì)量(25 ±5)g,清潔級,購自河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心(動物合格證:1503010)。顆粒狀飼料購自河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

1.2 藥品與儀器 MGIG購自江蘇正大天晴制藥有限公司；H22細(xì)胞來自河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)教研室，NF-κB p65、TNF-α和VEGF試劑盒和鹽酸二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑購自博士德公司。顯微鏡和COMS纖維成像系統(tǒng)為日本奧林巴斯產(chǎn)品(BX51T-PHD-J11)，數(shù)據(jù)采集使用美國Media Cybernetics 公司Image-Pro Plus，全自動生化分析儀使用日本TOSHIBA公司TBA-40FR。

1.3 分組及給藥方法 53只昆明小鼠分為四組，其中隨機(jī)取8只作為空白對照組，其余45只參照文獻(xiàn)〔3〕用于建立肝癌小鼠模型，小鼠腹水型肝癌細(xì)胞株H22用10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液常規(guī)傳代培養(yǎng)。對數(shù)生長期細(xì)胞以質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.9%的氯化鈉溶液調(diào)整細(xì)胞密度至1×106個/ml，取0.5 ml細(xì)胞懸液接種于小鼠腹腔中，7 d后抽取小鼠腹水，用0.9%氯化鈉稀釋成1∶4的細(xì)胞懸液，0.2 ml/只接種于45只小鼠右側(cè)腋窩皮下。24 h后將已經(jīng)接種的小鼠隨機(jī)分為三組：對照組(0.9%氯化鈉注射液NS組)、5-氟尿嘧啶(5-Fu)組和MGIG+5-Fu組，每組15只，各組間小鼠質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)差異(P> 0.05)。各組小鼠腹腔灌注給藥(MGIG 50 mg/kg，5-Fu 10 mg/kg)，1次/d，連續(xù)給藥7 d，末次給藥24 h后摘取眼球取血，然后頸椎脫臼處死，解剖后觀察腫瘤生長情況。

1.4 肝組織處理 取出肝臟,在右前、右后肝葉最大直徑處各取2 塊,用4%多聚甲醛(0.1 mol/L PBS,pH7.0 ～ 7.6,含0.1%DEPC)進(jìn)行固定，24 h 之后進(jìn)行石蠟包埋。

1.5 免疫組化指標(biāo)和血清中生化指標(biāo)的檢測 用免疫組化SP染色方法檢測肝組織中NF-κB p65和VEGF及TNF-α的表達(dá)情況。切片常規(guī)脫蠟入水，使用抗原修復(fù)液水浴修復(fù)，滴加山羊血清封閉液，室溫20 min。切片上滴加第一抗體，4℃過夜，0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次×5 min；切片上滴加第二抗體，37℃ 20 min，0.1 mol/L PBS洗3次×5 min；切片上滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，37℃ 20 min，0.1 mmol/L PBS洗3次×5 min；DAB顯色，蘇木素復(fù)染，水洗，中性樹脂封片，DAB 顯色，顯微鏡下觀察。使用全自動生化分析儀測定血清ALT與AST的含量。

1.6 結(jié)果判定 末次給藥24 h 后，取腫瘤組織，稱質(zhì)量，計算抑瘤率，抑瘤率=(對照組瘤質(zhì)量-實驗組瘤質(zhì)量)/對照組瘤質(zhì)量，均取平均值。免疫組化染色結(jié)果：NF-κB p65 陽性表達(dá)定位于肝細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，呈棕黃色顆粒。VEGF 染色呈棕黃色細(xì)顆粒表達(dá)于胞膜和胞質(zhì)；TNF-α主要來自于單核細(xì)胞、吞噬細(xì)胞，染色呈黃色，表達(dá)于細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)。參照文獻(xiàn)〔7〕中標(biāo)準(zhǔn)，每張切片隨機(jī)選擇5 個視野,每個視野計數(shù)80～100個細(xì)胞,根據(jù)染色的深度及陽性細(xì)胞的數(shù)量分別計分:不著色為0分,淺黃色為1分,黃色為2分,棕黃色為3分。陽性細(xì)胞數(shù)<1%為0 分,1%～10%為1分,11%～50%為2分,51%～80%為3分,81%～100%為4分。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0軟件行獨(dú)立樣本的t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況及腫瘤組織大小 實驗過程中,各組均無小鼠死亡。實驗組小鼠腫瘤組織直徑增大。NS組的腫瘤組織質(zhì)量〔(3.29±1.21)g〕最大，與5-Fu組〔(0.83±0.26)g〕和MGIG+5-Fu組〔(0.4±0.14)g〕相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，5-Fu組與MGIG+5-Fu組的抑瘤率分別為56.53%、84.80%，提示MGIG與5-Fu對腫瘤增長有抑制作用。MGIG+5-Fu組腫瘤組織質(zhì)量小于5-Fu組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 免疫組化染色檢測結(jié)果 NF-κB p65、TNF-α和VEGF陽性細(xì)胞主要呈彌漫性分布，見圖1。各實驗組NF-κB p65表達(dá)和ALT、AST水平與空白對照組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與NS組相比，5-Fu組和MGIG+5-Fu組的NF-κB p65、TNF-α和VEGF蛋白表達(dá)和ALT、AST水平均明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)差異。與5-Fu組相比，MGIG+5-Fu組的NF-κB p65、TNF-α和VEGF蛋白表達(dá)和ALT、AST水平均明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

圖1 各組積分光密度(DAB)

組別n積分光密度NF-κBp65VEGFTNF-αALT(U/L)AST(U/L)空白對照組815.85±2.214.00±1.117.38±2.33142.15±5.8833.00±2.85NS組1547.53±9.971)39.40±3.051)66.53±3.651)193.33±14.231)62.80±4.981)5-Fu組1522.33±3.861)2)16.00±1.031)2)12.67±1.251)2)169.67±4.741)2)61.73±4.451)MGIG+5-Fu組1519.33±3.861)2)3)12.93±2.261)2)3)10.93±1.611)2)3)140.80±3.432)3)33.06±2.172)3)

與空白對照組相比:1)P<0.05；與NS組相比:2)P<0.05；與5-Fu組相比:3)P<0.05

3 討 論

肝癌的發(fā)生與NF-κB的表達(dá)密切相關(guān)，NF-κB 在肝癌組織中表達(dá)較高，是炎癥致癌過程中主要的調(diào)節(jié)因子，活性增加可導(dǎo)致腫瘤體積增大，在炎癥的刺激下，NF-κB磷酸化而抑制作用消失，使活化的 NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核而激活一系列的炎癥因子〔7～10〕。在抗腫瘤的過程中抑制NF-κB 的活化可提高治療效果。p65是NF-κB的亞基，參與調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄，具有轉(zhuǎn)錄激活的作用，可調(diào)控VEGF和TNF-α的表達(dá)，且與VEGF和TNF-α的表達(dá)正相關(guān)〔8〕。TNF-α是一種細(xì)胞因子，具有調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、促進(jìn)細(xì)胞生長分化的功能，能夠活化巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)淋巴細(xì)胞免疫功能，引起腫瘤血管損傷，抑制腫瘤血管形成。TNF-α體內(nèi)濃度較低，適量對機(jī)體有保護(hù)作用，過量則對機(jī)體產(chǎn)生損傷反應(yīng)〔9〕。TNF-α可通過激活NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移〔10〕。VEGF是一種腫瘤血管生長因子，主要通過促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖而促進(jìn)腫瘤血管生成，表達(dá)水平與腫瘤惡性程度密切相關(guān)〔11〕。NF-κB 的激活可造成腫瘤組織對化療的抵抗而導(dǎo)致治療失敗，抑制NF-κB的激活可以提高化療的療效，延緩疾病進(jìn)展和復(fù)發(fā)〔7〕。MGIG是甘草酸單一異構(gòu)體鎂鹽，能夠顯著抑制炎癥因子TNF-α和NF-κB p65〔12〕。本結(jié)果表明，MGIG聯(lián)合5-Fu干預(yù)H22小鼠腫瘤，能夠明顯抑制腫瘤生長、抑制腫瘤相關(guān)因子表達(dá)和抗血管生成，同時降低肝臟細(xì)胞的損傷。MGIG聯(lián)合5-Fu能夠明顯降低小鼠腫瘤組織NF-κB p65、TNF-α和VEGF的表達(dá)，其機(jī)制可能與阻斷NF-κB 下游通路、抑制TNF-α和VEGF的表達(dá)從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長、增殖有關(guān)。

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3 姜 晗,任 軍,崔 勇,等.小鼠原位移植性肝癌模型的建立及其磁共振表現(xiàn)〔J〕.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué),2007;15(2):174-6.

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〔2016-03-18修回〕

(編輯 袁左鳴)

河北省衛(wèi)生廳科研基金項目(No.20130410)

楊玉鵬(1983-),男,碩士，主治醫(yī)師,主要從事抗腫瘤藥物研究。

任炳楠(1983-),男,碩士,主要從事抗腫瘤藥物研究。

R73

A

1005-9202(2017)06-1330-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.06.011

1 河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物學(xué)部 河北省實驗動物重點(diǎn)實驗室