厚樸酚對肺纖維化大鼠肺病理學和羥脯氨酸含量的影響

劉 波 莫鎮(zhèn)濤 李意奇 翟玉榮

(遵義醫(yī)學院珠海校區(qū)藥理教研室，廣東 珠海 519041)

厚樸酚對肺纖維化大鼠肺病理學和羥脯氨酸含量的影響

劉 波 莫鎮(zhèn)濤 李意奇 翟玉榮

(遵義醫(yī)學院珠海校區(qū)藥理教研室，廣東 珠海 519041)

目的 觀察厚樸酚(MAG)對肺纖維化大鼠肺病理學和羥脯氨酸(HYP)含量的影響。方法 雄性SD大鼠58只，隨機分為假手術組(n=18)、模型組(n=20)、MAG治療組(n=20)。模型組和MAG治療組采用氣管內注入博萊霉素(5 mg/kg)制作大鼠肺纖維化模型，各組于造模后次日開始給藥，MAG治療組腹腔注射MAG 50 mg/kg，假手術組和模型組腹腔注射等體積的生理鹽水，每日1次，共28 d。給藥后第7、14、28天，各實驗組分別取至少6只大鼠處死取肺組織，計算肺系數(shù)、測定肺組織HYP含量、HE染色進行肺組織病理學觀察及評價肺泡炎程度。結果 與模型組相比，各時間點MAG治療組大鼠肺系數(shù)、HYP含量、肺泡炎程度均顯著降低(P<0.05或P<0.01)；肺組織病理學觀察，各時間點病變均明顯減輕。結論 MAG可減輕肺纖維化大鼠的肺組織纖維化程度，降低肺組織含量，具有抗肺纖維化作用。

厚樸酚；肺纖維化；病理學；羥脯氨酸

肺纖維化(PF)的主要病理學特征是肺泡上皮細胞及內皮細胞損傷、成纖維細胞增殖、膠原過度沉積、肺泡結構遭破壞、大量細胞外基質聚集和彌漫性肺泡炎〔1〕。由于機制不清，國內外至今對PF仍無特效的藥物及治療方法。因此，有針對性地尋找有效的治療PF的藥物和防治手段，既有理論意義又有臨床價值。厚樸酚(MAG)，是厚樸提取物的重要單體物質，是厚樸的主要活性成分之一，現(xiàn)代藥理研究證實，MAG具有抗感染、抗菌、抗氧化、抗血管平滑肌增殖、中樞肌肉松弛、抗?jié)兊茸饔谩?〕。此外，MAG還可通過干擾活性氧簇形成而抑制心臟成纖維細胞的增生〔3〕及對脂多糖誘發(fā)的小鼠急性肺損傷也有保護作用〔4〕，但MAG是否具有抗PF作用尚未見報道。本實驗采用博萊霉素(BLM)誘導大鼠PF模型，通過觀察肺組織病理學改變及肺組織中羥脯氨酸(HYP)含量的影響，探討MAG的抗PF作用。

1 材料與方法

1.1 動物、藥物、試劑的儀器 雄性SD大鼠，58只，體質量(200±20) g，SPF級，由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供，合格證號scxk(粵)2014-0002。在潔凈級動物房飼養(yǎng)，適應性喂養(yǎng)3 d，實驗期間大鼠自由進食和飲水。MAG，購自成都曼思特生物科技有限公司，產(chǎn)品批號：MUST-12122405，由中藥厚樸皮中提取而來，為白色精細粉末，分子式：C18H18O2，HPLC含量99.5%。BLM，購自日本化藥株式會社，15 mg/支，藥品進口注冊證號:H20055883；生產(chǎn)批號：131510。HYP含量測定試劑盒，購自南京建成生物工程研究所，生產(chǎn)批號：20131220。光學顯微鏡為日本OLYMPUS公司產(chǎn)品，型號：BX53。全自動紫外分光光度計為美國BECKMAN公司產(chǎn)品。E260電子天平為梅特勒公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 大鼠PF模型制備 采用氣管內注入鹽酸BLM制作大鼠PF模型，按參考文獻〔5〕方法略作改進。實驗大鼠用1%戊巴比妥鈉(0.1 ml/100 g)腹腔注射麻醉后固定于鼠板上，頸部剪毛消毒后，做頸部正中切口，鈍性分離暴露氣管，模型組、MAG治療組將針頭于氣管軟骨環(huán)間隙穿刺入氣管沿向心端方向緩慢注入鹽酸BLM(5 mg/kg)，隨后立即注入0.2 ml空氣2次，假手術組在相同條件下經(jīng)氣管注入等體積生理鹽水及空氣，注藥后立即將大鼠直立，沿身體縱軸快速旋轉30 s，使藥液均勻分布兩肺，術后消毒縫合傷口，將大鼠仰臥位置于籠中，待自然清醒后常規(guī)飼養(yǎng)。

1.2.2 動物分組及給藥 SPF雄性SD大鼠隨機分為假手術組(n=18)、模型組(n=20)、MAG治療組(n=20)。各組于造模后次日開始給藥：MAG治療組腹腔注射MAG(50 mg/kg)，假手術組和模型組腹腔注射等體積的生理鹽水，每日1次，連續(xù)給藥28 d。

1.2.3 取材和指標檢測觀察 給藥后第7、14、28天，各實驗組分別取至少6只大鼠處死取肺組織進行各指標檢測。①計算肺系數(shù)：稱取大鼠體質量，1%戊巴比妥鈉(0.1 ml/100 g)腹腔注射，取完整雙肺組織，用PBS溶液快速沖洗，除去血液，濾紙拭干，稱雙肺濕重計算肺系數(shù)：肺系數(shù)=(雙肺濕重g/體重kg)×100%。②肺組織病理學觀察：取右肺中葉投入10%甲醛中固定，常規(guī)石蠟包埋，切片，進行HE染色，光學顯微鏡下觀察其病理形態(tài)。HE染色后根據(jù)Szapiel等〔6〕方法評價肺泡炎的程度，0分：無肺組織炎；1分：輕度肺組織炎，炎性細胞浸潤僅限于局部或近胸膜部，面積小于全肺的20%；2分：中度肺組織炎，受累面積占全肺的20%～50%；3分：重度肺組織炎，受累面積大于50%。③HYP含量檢測：準確稱取右肺下葉組織50 mg，放-70℃冰箱保存，以堿性水解法按試劑盒說明測肺組織HYP含量。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析及t檢驗。

2 結 果

2.1 大鼠一般狀態(tài) 對照組大鼠活潑好動，皮毛光澤發(fā)亮，體重逐漸增加，呼吸平穩(wěn)；模型組大鼠精神不振，行動遲緩，皮毛枯槁倒立、無光澤，身體較其他組消瘦，呼吸急促；MAG治療組皮毛尚可，精神一般，飲食未見異常。實驗中，假手術組無死亡，模型組死亡2只，MAG治療組死亡1只。

2.2 HE染色光鏡下肺組織病理學觀察及分析 假手術組第7、14、28天肺內結構清晰，肺泡上皮細胞結構完整，肺泡間隔無明顯充血水腫及斷裂，間隔有少量炎細胞浸潤；模型組第7天，部分肺泡壁破壞，有少量的成纖維細胞，肺間質內有大量炎性細胞浸潤，肺泡間隔明顯充血水腫，間隔不等且明顯增寬，第14、28天肺泡間隔進一步明顯增寬，大量肺泡壁破壞，肺泡炎逐漸不明顯，但肺纖維化程度呈進行性加重；MAG治療組與模型組相比，各時間點病變均明顯減輕，肺泡壁無明顯破壞，肺間隔明顯變窄，炎細胞浸潤及膠原纖維細胞增生及成纖維生成減少。HE染色光鏡下病理學評分表明，模型組大鼠肺泡炎程度在不同時間點均明顯高于同期假手術組(P<0.01)；與模型組相比，MAG治療組肺組織肺泡炎程度在各時間點均有不同程度改善(P<0.05)。見表1。

2.3 MAG對肺纖維化大鼠肺系數(shù)的影響 造模后第7，14，28天，與假手術組相比，各時間點模型組大鼠肺系數(shù)均明顯增大(P<0.01)；與模型組相比，各時間點MAG治療組大鼠肺系數(shù)均不同程度的降低，差異顯著(P<0.05或P<0.01)。見表2。

2.4 MAG對肺纖維化大鼠肺組織HYP含量的影響 造模后第7，14，28天，與假手術組相比，各時間點模型組大鼠肺組織HYP含量均明顯升高(P<0.05或P<0.01)；與模型組相比，各時間點MAG治療組大鼠肺組織HYP含量顯著降低(P<0.01)。見表3。

組別7d14d28d假手術組0.33±0.070.24±0.050±0模型組2.67±0.391)2.51±0.361)2.33±0.411)MAG治療組1.76±0.422)1.52±0.602)1.16±0.532)

與假手術組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.05

組別7d14d28d假手術組4.83±0.415.01±0.355.23±0.51模型組10.13±0.771)11.81±0.421)12.05±0.751)MAG治療組7.97±0.562)8.82±0.802)8.46±0.883)

與假手術組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.05，3)P<0.01

組別7d14d28d假手術組0.76±0.080.82±0.070.84±0.05模型組1.12±0.022)1.15±0.031)1.20±0.041)MAG治療組0.90±0.093)0.93±0.093)1.02±0.083)

與假手術組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與模型組比較：3)P<0.01

3 討 論

PF的動物模型制備有多種方法，BLM復制的動物PF模型，其病理組織學改變與人類PF最為相似〔7〕，故被國內外廣泛采用。膠原是器官纖維化時細胞外基質的主要成分，膠原合成的一個重要過程是脯氨酸經(jīng)羥化酶作用轉化為HYP，HYP 作為膠原纖維中特有的一類氨基酸，在膠原蛋白中占13.4%，在彈性蛋白中占極少量，其他蛋白中均不存在，所以HYP含量成為間接反映膠原含量的敏感指標，能反映器官纖維化的程度而被廣泛應用于肺纖維化的研究〔8〕。病理形態(tài)學觀察是研究PF病理發(fā)展過程最直觀的指標。

本實驗結果表明PF化模型復制成功。目前PF尚無特效藥物治療。西藥大多療效不佳且有嚴重的毒副作用。研究表明，已有不少單味中藥及其提取物有減輕PF的作用〔9〕。所以從植物藥中分離提取有活性、低毒的單體藥物，可能會給抗PF治療提供新的希望。MAG是我國傳統(tǒng)中藥厚樸提取物的重要單體物質，是厚樸的主要活性成分之一。本實驗研究結果提示MAG具有抗大鼠PF作用，為MAG用于PF的治療提供了一定的實驗依據(jù)，本實驗只對MAG減輕PF療效做了初步研究，后續(xù)將對其抗PF的最佳劑量及作用機制進一步深入探討。

1 趙 敏，徐安莉，周艷艷，等.溫補腎陽法對腎陽虛肺纖維化大鼠肺內CTGF表達的影響〔J〕.中國老年學雜志，2015；35(2)：421-4.

2 張 勇，唐 方.厚樸酚藥理作用的最新研究進展〔J〕.中國中藥雜志，2012；37(23)：3526-30.

3 Liou JY，Chen YL，Loh SH，etal.Magnolol depresses urotensin-Ⅱ-induced cell proliferation in rat cardiac fibroblasts〔J〕.Clin Exp Pharmacol Physiol，2009；36(7)：711-6.

4 Ni YF，Jiang T，Cheng QS，etal.Protective effect of magnolol on lipopolysaccharide-induced acute lung injury in mice〔J〕.Inflammation，2012；35(6)：1860-6.

5 Ye Q，Li Y，Jiang H，etal.Prevention of pulmonary fibrosis via trichostatin A(TSA)in bleomycin induced rats〔J〕.Sarcoidosis Vasc Diffuse Lung Dis，2014；31(3)：219-26.

6 Szapiel SV，Elson Na，F(xiàn)ulmer J D，etal.Bleomycin induced interstitial pulmonary disease in the nude athymie mouse〔J〕.Am Rev Respir Dis，1979；120(4)：893-9.

7 甘 卉，王忠超，李 偉，等.潤肺治纖湯對肺纖維化大鼠肺組織形態(tài)學變化的影響〔J〕.當代醫(yī)學，2014；20(11)：17-8.

8 吳娟娟，凌春華，何煥榮，等.復方三七飲對博萊霉素致大鼠肺纖維化模型的干預作用〔J〕.現(xiàn)代中西醫(yī)結合雜志，2013；22(23)：2527-31.

9 張 帥，鄧家剛，黃思詩，等.中藥治療肺纖維化的研究進展〔J〕.醫(yī)藥導報，2014；33(9)：1208-11.

〔2015-09-29修回〕

(編輯 曹夢園)

貴州省中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥民族醫(yī)藥科學技術基金項目(No.QZYY2013-96)

翟玉榮(1976-)，女，教授，碩士，主要從事心血管藥理與組織纖維化防治研究。

劉 波(1978-)，男，講師，碩士，主要從事心腦血管生理及腎臟生理研究。

R282.71

A

1005-9202(2017)06-1325-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.06.009