過氧化物酶體增殖物激活受體2及其磷酸化形式在脂肪干細(xì)胞脂向分化過程中的表達(dá)

周 煒 張 駿 凡 進(jìn) 殷國(guó)勇

(南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科，江蘇 南京 210029)

過氧化物酶體增殖物激活受體2及其磷酸化形式在脂肪干細(xì)胞脂向分化過程中的表達(dá)

周 煒 張 駿1凡 進(jìn) 殷國(guó)勇

(南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科，江蘇 南京 210029)

目的 探討過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARγ)2及其磷酸化形式在脂肪干細(xì)胞脂向分化過程中的表達(dá)。方法 采用組織塊貼壁法培養(yǎng)脂肪干細(xì)胞，對(duì)第3代細(xì)胞進(jìn)行脂向分化誘導(dǎo)，應(yīng)用Western印跡檢測(cè)誘導(dǎo)不同時(shí)間的PPARγ2非磷酸化及其磷酸化形式表達(dá)，RT-PCR檢測(cè)誘導(dǎo)不同時(shí)間的PPARγ2 mRNA表達(dá)。結(jié)果 隨著脂向分化誘導(dǎo)時(shí)間的增長(zhǎng)，PPARγ2的非磷酸化與磷酸化形式的相對(duì)表達(dá)量明顯增加，PPARγ2 mRNA相對(duì)表達(dá)量呈逐漸遞增的趨勢(shì)(P<0.05)，其中第7、9天達(dá)到峰值差異比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 PPARγ2在脂肪干細(xì)胞脂向分化過程中起著重要作用，作用機(jī)制可能是通過自身的磷酸化來促進(jìn)脂向分化。

脂肪干細(xì)胞；過氧化物酶體增殖物激活受體2

現(xiàn)階段軟組織缺損是臨床亟需解決的難題，而脂肪組織工程為軟組織的修復(fù)重建開辟了新的思路，已成為目前臨床研究的重要方向。脂肪組織工程需要有合適的種子細(xì)胞，而脂肪干細(xì)胞來源豐富且具有多項(xiàng)分化能力和較強(qiáng)的增殖能力，已成為脂肪組織工程的理想種子細(xì)胞〔1〕。但是目前脂肪干細(xì)胞的成脂分子機(jī)制尚不明確，進(jìn)而使組織工程化脂肪的構(gòu)建受阻。過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARγ)2是體外及體內(nèi)形成脂肪的必須轉(zhuǎn)錄因子，在脂肪酸代謝及脂肪細(xì)胞發(fā)育過程中的作用顯著〔2〕。有研究發(fā)現(xiàn)通過成體干細(xì)胞模型進(jìn)行脂向分化實(shí)驗(yàn)將研究結(jié)果轉(zhuǎn)變?yōu)榕R床研究的效果較好〔3〕。本研究旨在探討PPARγ2及其磷酸化形式在脂肪干細(xì)胞脂向分化過程中的表達(dá)意義。

1 材料與方法

1.1 材料 8只14 d的綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠由中科院上海藥物研究所提供；胎牛血清(FBS)購(gòu)于美國(guó)Hyclone公司；0.25%乙二胺四乙酸(ETDA)及二喹啉甲酸(BCA)蛋白含量測(cè)定試劑盒購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；胰島素、地塞米松磷酸鈉、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；2×Pfu PCR Master Mix、One Step RNA PCR Kit及柱式小量RNA抽提試劑盒購(gòu)于日本TaKaPa公司；PCR儀購(gòu)于美國(guó)GE公司；小鼠Anti-PPARγ2單克隆抗體及小鼠Anti-PPARγ2 phosphoSer112單克隆抗體均購(gòu)于美國(guó)Pierce公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗小鼠IgG及TRITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)均購(gòu)于北京中衫金橋公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 脂肪干細(xì)胞提取和培養(yǎng) 小鼠頸椎脫臼后75%酒精浸泡5 min，分離腹股溝脂肪組織并剪碎，貼于培養(yǎng)皿(6 cm)中，組織基本貼壁后加入含10%FBS、改良型α-MEM及100 U/ml的鏈霉素及青霉素的培養(yǎng)基，置于5% CO2，37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天更換1次培養(yǎng)基。當(dāng)貼壁細(xì)胞融合至80%時(shí)使用0.25%的胰蛋白酶消化傳代，1×105/ml細(xì)胞數(shù)目接種繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 脂肪干細(xì)胞脂向分化誘導(dǎo) 待細(xì)胞融合至80%左右時(shí)對(duì)第3代干細(xì)胞給予脂向誘導(dǎo)分化，培養(yǎng)基主要含有10%FBS、改良型α-MEM、0.5 mmol/L的1，3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、10-5mol/L胰島素、10-6mol/L地塞米松磷酸鈉、0.2 mmol/L吲哚嘌呤，并將未誘導(dǎo)分化的干細(xì)胞作對(duì)照組。分別于誘導(dǎo)后第3、6天給予半量換液。所有樣本量均3個(gè)復(fù)孔，于顯微鏡下觀察細(xì)胞質(zhì)脂滴形成情況和細(xì)胞形態(tài)，并于誘導(dǎo)5 d后行油紅O染色，鑒定脂向誘導(dǎo)情況。

1.2.3 Western印跡檢測(cè) 分別提取誘導(dǎo)0、1、3、5、7、9 d的細(xì)胞蛋白，BCA蛋白含量試劑盒對(duì)總蛋白含量進(jìn)行測(cè)定。對(duì)30 μg蛋白樣品進(jìn)行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，小鼠抗-PPARγ2單克隆抗體及小鼠抗-PPARγ2 phosphoSer112單克隆抗體為一抗，HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG為二抗，使用化學(xué)發(fā)光法對(duì)免疫復(fù)合物及美國(guó)Gel Doc XR系統(tǒng)拍攝結(jié)果。利用Quantity-One 4.6.2軟件分析PPARγ2及其磷酸化形成的蛋白表達(dá)情況及其條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。

1.2.4 RT-PCR半定量檢測(cè) 分別對(duì)0、1、3、5、7、9 d的脂肪干細(xì)胞RNA進(jìn)行提取誘導(dǎo)。依據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，具體RT條件：30 min 50℃，5 min 95℃，10 min 4℃。以1 μl cDNA為模板添加1 μl上、下游引物、10 μl 2×Pfu PCR Master Mix，補(bǔ)齊ddH2O至20 μl后行PCR反應(yīng)，具體條件：3 min 94℃；30 s 94℃，65℃30 s(每2個(gè)循環(huán)降低1℃)，1 min 72℃，20個(gè)循環(huán)；30 s 94℃，30 s 55℃，1 min 72℃，20個(gè)循環(huán)；5 min 72℃；5 min 4℃。對(duì)5 μl Marker及6 μl PCR產(chǎn)物行20 g/L瓊脂糖凝膠電泳，電壓120 V進(jìn)行30 min，結(jié)束后采用凝膠成像系統(tǒng)拍攝電泳結(jié)果，并分析PPARγ2的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行方差分析、LSD檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 脂肪干細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 油紅O可觀察到，在條件誘導(dǎo)培養(yǎng)基下，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增長(zhǎng)，脂滴逐漸融合變大，脂滴呈橙紅色，見圖1。

圖1 油紅O染色觀察(×100)

2.2 半定量RT-PCR結(jié)果 隨著脂向分化誘導(dǎo)時(shí)間的增長(zhǎng)，PPARγ2 mRNA相對(duì)表達(dá)量呈逐漸遞增的趨勢(shì)(P<0.05)，0 d：0.102±0.002，1 d：0.124±0.006,3 d:0.201±0.005,5 d:0.301±0.022,7 d:0.368±0.012,9 d:0.387±0.011,其中第7天和第9天差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

圖2 誘導(dǎo)不同時(shí)間PPARγ2 mRNA表達(dá)

2.3 Western印跡結(jié)果 隨著脂向分化誘導(dǎo)時(shí)間的增長(zhǎng)，PPARγ2的非磷酸化與磷酸化形式的相對(duì)表達(dá)量明顯增加(P<0.05)，見表1，圖3。

時(shí)間非磷酸化PPARγ2PPARγ20d0.562±0.0640.212±0.0411d0.682±0.0321)0.401±0.0211)3d0.832±0.1021)0.703±0.0741)5d1.211±0.1041)1.031±0.2211)7d1.403±0.1201)1.134±0.1501)9d1.603±0.1351)1.230±0.1511)F/P值7.302/<0.056.891/<0.05

與0 d比較：1)P<0.05

圖3 PPARγ2的磷酸化與非磷酸化形式的Western印跡檢驗(yàn)

3 討 論

肥胖的產(chǎn)生因素較多，脂肪細(xì)胞增大是重要原因。此外，脂肪細(xì)胞數(shù)目的增加也是導(dǎo)致肥胖的重要因素，而存在于脂肪組織內(nèi)多潛能干細(xì)胞的脂向分化是脂肪細(xì)胞數(shù)目增多的重要來源，并且于相關(guān)因素的刺激下，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞等其他器官的干細(xì)胞也可募集到脂肪組織分化為脂肪細(xì)胞〔4，5〕。脂肪細(xì)胞的分化可分為多能干細(xì)胞、前脂肪細(xì)胞及脂肪細(xì)胞3個(gè)階段〔6〕?，F(xiàn)階段對(duì)于脂肪細(xì)胞分化的研究主要集中于小鼠前脂肪細(xì)胞到成熟脂肪細(xì)胞階段，脂肪細(xì)胞的調(diào)節(jié)機(jī)制也是目前研究的重要方向。

PPARγ2被認(rèn)為是脂肪分化的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。脂肪細(xì)胞中最具有代表性的PPAR目的基因是脂肪酸結(jié)合蛋白基因，其含有一個(gè)典型的PPAR/視黃醇X受體結(jié)合位點(diǎn)〔7〕。PPAR可通過此結(jié)合位點(diǎn)與配體直接結(jié)合、調(diào)節(jié)磷酸化狀態(tài)及熱休克蛋白結(jié)合配體方式激活，進(jìn)而與RXR形成異二聚體，復(fù)合物中RXR能與目的基因的PPAR反應(yīng)元件相互作用，進(jìn)行目的基因的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)相關(guān)研究〔8～10〕發(fā)現(xiàn)PPARγ2的異常表達(dá)可使成肌細(xì)胞、前脂肪細(xì)胞及成纖維細(xì)胞進(jìn)行脂向分化，增強(qiáng)子CCAAT結(jié)合蛋白α于PPARγ2缺失的條件下無法誘導(dǎo)脂向分化，但PPARγ2可在增強(qiáng)子CCAAT結(jié)合蛋白α缺失的條件下誘導(dǎo)脂向分化，還可誘導(dǎo)多種脂肪細(xì)胞特異基因的表達(dá)。本研究結(jié)果充分說明PPARγ2為脂肪分化的重要轉(zhuǎn)錄因子，在脂肪分化的過程中地位顯著。

本研究發(fā)現(xiàn)未分化的脂肪干細(xì)胞的PPARγ2及其磷酸化形式存在弱表達(dá)，與Lynch等〔11〕的研究相符。項(xiàng)芬芬等〔12〕的研究發(fā)現(xiàn)，未分化的骨髓充質(zhì)干細(xì)胞也存在PPARγ2及其磷酸化形式存在弱表達(dá)。PPARγ含磷蛋白質(zhì)，與其他細(xì)胞核受體相似，其轉(zhuǎn)錄活性與磷酸酶及激酶的交互作用影響較大，但PPARγ通過磷酸化調(diào)節(jié)的活性較復(fù)雜并存在爭(zhēng)議。PPARγ2及其磷酸化蛋白與脂肪干細(xì)胞脂向分化關(guān)系主要有以下兩點(diǎn)〔13，14〕：(1)PPARγ的磷酸化可被MAPK家族中的JNK、ERK同時(shí)作用，通過激活MAPK通路磷酸化PPARγ，并降低其轉(zhuǎn)錄活性進(jìn)而抑制脂向分化；(2)112位絲氨酸無法被磷酸化的突變體中，PPARγ可幫助細(xì)胞抵抗有絲分裂源誘發(fā)的脂向分化抑制。但是，不是所有的磷酸化均可抑制脂肪分化。高濃度血清可增加PPARγ及其磷酸化形式的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)脂向分化。

此外，胰島素處理可促進(jìn)PPARγ及其磷酸化形式的表達(dá)，并增加配體依賴性的PPARγ轉(zhuǎn)錄活性和增強(qiáng)TZD誘導(dǎo)的PPARγ轉(zhuǎn)錄激活功能。本研究結(jié)果提示PPARγ可能是通過自身磷酸化而加強(qiáng)脂向分化。

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〔2016-10-09修回〕

(編輯 滕欣航)

國(guó)家自然科學(xué)基金(No.81401800)

殷國(guó)勇(1965-)，男，博士，主任醫(yī)師，主要從事骨科及脊柱臨床與基礎(chǔ)研究。

周 煒(1982-)，男，博士在讀，副主任醫(yī)師，主要從事骨科、脊柱外科臨床與基礎(chǔ)研究。

R3

A

1005-9202(2017)06-1304-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.06.002

1 浙江省人民醫(yī)院骨科