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    前列腺干細胞抗原及其單鏈抗體-堿性磷酸酶融合蛋白的表達與檢測

    2021-01-18 11:01:24尚國富劉江麗唐開義胡祖權
    安徽醫(yī)科大學學報 2020年12期
    關鍵詞:原核前列腺癌抗原

    尚國富,劉江麗,于 歡,唐開義,曾 柱,3,胡祖權,3,王 赟

    前列腺癌是男性常見的癌癥,也是男性癌癥死亡三大原因之一[1]。前列腺癌的患病率在我國呈現(xiàn)迅速上升的趨勢,該癌癥成為危害我國男性健康的重要疾病[2]。因此,建立快速、有效的前列腺癌檢測技術體系,對于臨床診斷和治療具有重要作用。前列腺干細胞抗原(prostate stem cell antigen, PSCA)是一種糖基磷脂酰肌醇錨定細胞表面蛋白,在前列腺組織中的表達有很高的特異性,其表達水平在前列腺癌組織中顯著高于正常前列腺組織[3]。因此,PSCA被認為是診斷和預后前列腺癌的生物標志物,也是治療的理想靶點[3-4]。該研究分別構建PSCA以及抗PSCA單鏈抗體(single-chain variable fragment, scFv)與堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, AP)融合蛋白的原核表達體系,大量表達并檢測其活性,為后期發(fā)展基于融合蛋白的免疫檢測技術提供實驗支持。

    1 材料與方法

    1.1 實驗材料大腸桿菌BL21(DE3)、大腸桿菌XL1-Blue、pET-32a載體及pDAP2/S載體由華中農業(yè)大學分子生物技術實驗室饋贈。pET-32a載體含有TrxA基因,PSCA基因構建到該載體中可誘導表達重組TrxA-PSCA融合蛋白,pDAP2/S載體含有AP基因,PaFv基因構建到該載體中可誘導表達重組PaFv-AP融合蛋白。T4 DNA連接酶、Taq聚合酶、RNAase、DNA Marker購自日本Takara公司;Tryptone、Yeast extract購自英國Oxoid公司;DNA凝膠回收試劑盒購自杭州愛思進生物技術有限公司;BCIP/NBT顯色試劑購自武漢博士德生物工程有限公司;蛋白Marker購自美國Thermo-Fisher公司;抗His單克隆抗體、AP標記羊抗小鼠特異抗體、對硝基苯磷酸二鈉(pNPP)購自美國Sigma-Aldrich公司;BCA蛋白質定量試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。

    1.2 PCR引物根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中的PSCA基因序列,利用Primer Primer 5.0軟件設計擴增PSCA成熟肽序列的引物,引物(表1)由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

    表1 本研究引物序列表

    1.3PSCA基因的擴增和PaFv基因的合成培養(yǎng)前列腺癌細胞,采用TRIzol法提取細胞總RNA,采用Oligo(dT)12-18引物反轉錄合成cDNA,再利用特異引物PHisF/PHisB進行PCR擴增獲得PSCA基因。在50 μl反應體系中,分別加入2 μl cDNA、PHisF、PHisB和dNTPs,5 μl 10× PCR Buffer,0.5 μl Taq酶;PCR擴增反應條件為: 95 ℃預處理5 min; 94 ℃、1 min,55 ℃、1 min,72 ℃、80 s,30個循環(huán);72 ℃、10 min。取2 μl PCR產物通過1.2%(W/V)瓊脂糖凝膠電泳檢測。

    為了提高抗PSCA單鏈抗體PaFv的原核表達效率,根據(jù)大腸桿菌的遺傳密碼偏愛性,利用GenSmart Codon Optimization工具優(yōu)化PaFv的密碼子,由金斯瑞生物科技公司合成,同時在基因的5′端添加SfiI限制酶酶切位點,在3′端同時添加218連接肽和NotI限制酶酶切位點。

    1.4 基因克隆與陽性克隆鑒定用BamHI和XhoI分別酶切PSCA目的基因和pET-32a載體,通過瓊脂糖凝膠電泳后回收純化,再在T4 DNA連接酶的作用下將目的基因連入載體中,獲得可用于原核表達的pET-32a-PSCA重組載體。經熱激法轉化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞中,涂布于含有Amp (100 μg/ml)的LB培養(yǎng)板上,37 ℃培養(yǎng)15 h。挑取單克隆培養(yǎng)并利用載體特異引物TF/T7t進行PCR擴增檢測,根據(jù)DNA條帶大小鑒定陽性克隆,送公司測序驗證。

    用SfiI和NotI內切酶分別切割pDAP2/S載體的質粒DNA和PaFv目的基因,通過瓊脂糖凝膠電泳回收純化后,再在T4 DNA連接酶的作用下將目的基因連入載體中,獲得可用于原核表達的pDAP2/S-PaFv重組載體。經熱激法轉化至XL1-Blue大腸桿菌感受態(tài)細胞中,涂布于含有Amp (100 μg/ml)的LB培養(yǎng)板上,37 ℃培養(yǎng)16 h。挑取單克隆培養(yǎng)并利用載體特異引物pDAP2-Spel/pDAP2-Sap進行PCR擴增鑒定,陽性克隆送公司測序驗證。

    1.5 TrxA-PSCA融合蛋白的原核表達與純化取20 μl甘油保存的重組菌株BL21(DE3)/pET-32a-PSCA接種于20 ml含100 μg/ml Amp的2TY液體培養(yǎng)基[5]中,37 ℃、200 r/min振蕩過夜培養(yǎng)后,取16 ml菌液接種至800 ml含100 μg/ml Amp的2TY培養(yǎng)基中,37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)使其OD600 nm達到0.4~0.6時,加入終濃度為0.5 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside, IPTG),繼續(xù)誘導表達5 h。超聲波破碎提取TrxA-PSCA融合蛋白,在4 ℃條件下8 000 r/min離心5 min,取菌液上清液利用Ni-NTA基質純化。純化后的TrxA-PSCA融合蛋白經BCA定量試劑盒定量后,取4 μg上樣進行SDS-PAGE檢測。

    1.6 PaFv-AP融合蛋白的原核表達取20 μl甘油保存的XL1-Blue/pDAP2/S-PaFv重組菌液,接種于20 ml含有100 μg/ml Amp的2TY液體培養(yǎng)基中,于37 ℃恒溫搖床200 r/min培養(yǎng)12 h。取10 ml菌液轉接到200 ml新鮮的含有100 μg/ml Amp的2TY培養(yǎng)基中,于37 ℃恒溫搖床200 r/min培養(yǎng)使其OD600 nm達到0.5~0.6時,加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG誘導蛋白表達。在20 ℃條件下200 r/min誘導培養(yǎng)14 h。4 ℃、5 000 r/min離心10 min收集菌體,加入15 ml PBS緩沖液重懸菌體[5],經超聲波破碎處理后,4 ℃、12 000 r/min離心10 min收集上清液。

    1.7 Western blot分析取20 μl XL1-Blue/pDAP2/S-PaFv重組大腸桿菌大量表達的總蛋白經10%SDS-PAGE電泳后,利用半干轉印儀將凝膠中的蛋白轉印到NC膜上,放入5%脫脂奶粉溶液中封閉2 h后,再用1 ∶5 000稀釋的抗His單克隆抗體室溫孵育2 h,AP標記的二抗室溫孵育2 h,最后用BCIP/NBT顯色試劑顯色。

    1.8 AP顯色反應及ELISA檢測PaFv-AP融合蛋白的活性原核表達的PaFv-AP融合蛋白通過AP顯色反應快速檢測融合蛋白的AP活性[5],再通過ELISA反應檢測融合蛋白的抗原結合特性。用PBS稀釋TrxA-PSCA蛋白至20 ng/μl,取100 μl加入ELISA板孔中,37 ℃孵育2 h,PBS作為空白對照。加入200 μl PBS洗板3次后,每孔加入200 μl 2% (W/V) BSA溶液,37 ℃封閉2 h。甩干ELISA板中的封閉液,每孔加入200 μl PBS洗板3次。隨后,每孔加入100 μl表達的PaFv-AP融合蛋白(20 ng/μl),37 ℃孵育1.5 h。用200 μl PBST和PBS分別洗滌3次后,加入100 μl 0.2%(W/V) pNPP顯色液,黑暗條件下反應后用酶標儀在405 nm波長下測定OD值。

    2 結果

    2.1 目的基因的獲取以cDNA為模板,利用特異引物通過PCR擴增獲得PSCA目的基因,凝膠電泳檢測顯示目的片段約250 bp (圖1A),與預期的大小一致。另外,根據(jù)大腸桿菌的遺傳密碼子的使用頻率,優(yōu)化抗PSCA單鏈抗體的編碼基因,并添加內切酶酶切位點和218連接肽,合成PaFv基因片段,凝膠電泳檢測結果如圖1B所示,目的基因片段與預期的約850 bp相一致。

    圖1 PSCA基因及PaFv基因的電泳圖

    2.2 原核表達載體的構建重組載體pET-32a-PSCA轉化大腸桿菌BL21(DE3)后,隨機挑取5個單克隆轉化子,PCR擴增結果顯示5號克隆擴增出的DNA條帶大小與預期一致(圖2A)。公司測序結果確證PSCA基因成功構建到pET-32a載體中。重組載體pDAP2/S-PaFv轉化大腸桿菌XL1-Blue后,PCR擴增結果顯示1-3號克隆擴增出的DNA條帶清晰明亮(圖2B)。測序結果確證成功獲得含有pDAP2/S-PaFv重組質粒的陽性轉化子。

    圖2 PCR鑒定陽性轉化子

    2.3 蛋白的原核表達與檢測重組菌株BL21(DE3)/pET-32a-PSCA在37 ℃、200 r/min條件下,0.5 mmol/L IPTG誘導表達5 h,純化后獲得的TrxA-PSCA融合蛋白濃度為0.40 mg/ml。SDS-PAGE電泳檢測結果如圖3A所示,在約28 ku處出現(xiàn)單一的目的條帶,獲得了純度約85%的可溶性TrxA-PSCA融合蛋白。含有pDAP2/S-PaFv重組質粒的大腸桿菌通過IPTG誘導表達,超聲波破碎處理提取總蛋白,經SDS-PAGE電泳和Western雜交檢測。結果顯示有單一的約90 ku大小的蛋白條帶(圖3B),與PaFv-AP融合蛋白的分子量相一致。

    2.4 PaFv-AP融合蛋白的活性分析AP顯色反應顯示原核表達的PaFv-AP融合蛋白能夠快速催化pNPP底物顯色,其顯色值高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(t=-67.945,P<0.001) (圖4)。實驗組平均讀值為對照組9.2倍,說明融合蛋白可溶性表達并具有很強的AP活性。在ELISA孔中包被TrxA-PSCA重組蛋白,加入原核表達的PaFv-AP融合蛋白進行ELISA檢測(圖4),PaFv-AP融合蛋白的OD405 nm值與對照組相比,平均讀值相差3.2倍,差異有統(tǒng)計學意義(t=-28.946,P<0.001),表明原核表達的PaFv-AP融合蛋白保留scFv和AP的活性,可用于PSCA蛋白的免疫學檢測。

    圖3 TrxA-PSCA和PaFv-AP融合蛋白的表達鑒定

    圖4 AP顯色反應和ELISA檢測PaFv-AP融合蛋白的活性

    3 討論

    PSCA是一種前列腺癌腫瘤相關抗原,由Reiter et al[3]在1998年研究前列腺癌的基因表達過程中發(fā)現(xiàn)。近年來的研究[3-4,6]表明PSCA的表達與前列腺癌患者的預后密切相關,可作為前列腺癌預后的指標以及晚期患者的治療靶標。本研究克隆了人PSCA成熟肽的編碼基因序列(78~314 bp),通過與促溶蛋白標簽TrxA融合表達TrxA-PSCA蛋白作為免疫檢測的抗原。

    免疫學檢測方法具備特異性好、靈敏度高、價格低廉和操作簡單等優(yōu)勢,現(xiàn)已被廣泛應用于疾病診斷及毒素檢測分析等[7-9]。scFv是通過基因工程技術制備的具有完全抗原結合位點的最小抗體片斷,對靶抗原的結合活性與天然抗體十分接近[10]。由于scFv的特殊小分子結構,蛋白糖基化修飾對其活性功能影響較小,可在大腸桿菌等原核生物中高效表達,純化過程和操作簡單[11]。更重要的是,scFv基因可根據(jù)表達的宿主細胞進行密碼子優(yōu)化來提高表達量、可溶性和活性等,也可在體外進行設計改造或與AP、細胞因子等蛋白質的編碼基因通過基因工程操作融合表達,從而改變或增加scFv的特性[12-13]。scFv-AP融合蛋白用于抗原檢測時不需要添加酶標記二抗,從而使免疫學檢測過程大大加速,檢測成本顯著下降,應用前景十分廣泛[5]。

    本研究確定在IPTG終濃度為0.5 mmol/L時,37 ℃誘導培養(yǎng)5 h能夠獲得大量可溶性表達的TrxA-PSCA融合蛋白;在IPTG終濃度為0.5 mmol/L時,20 ℃誘導培養(yǎng)14 h能夠高效可溶性表達PaFv-AP融合蛋白。AP顯色反應和ELISA分析結果顯示原核表達的PaFv-AP融合蛋白保留了scFv和AP的活性,但尚未達到檢測應用的要求,后續(xù)將進一步優(yōu)化表達條件后通過發(fā)酵大量生產融合蛋白,或通過分子建模和定點突變等技術提高融合蛋白的活性。本研究通過基因工程操作技術實現(xiàn)了PSCA抗原和PaFv-AP融合蛋白在大腸桿菌中的可溶性表達,為后續(xù)前列腺癌免疫診斷的應用研究奠定了實驗基礎。

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