苦味肽的形成機理及脫苦技術(shù)研究進展

郭興峰，魏芳，周祥山，田守生，劉海峰，張建嶺，郭曉飛

（1.聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東聊城252000；2.東阿阿膠股份有限公司，山東聊城252201）

苦味肽的形成機理及脫苦技術(shù)研究進展

郭興峰1，2，魏芳1，周祥山2，田守生2，劉海峰2，張建嶺2，郭曉飛2

（1.聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山東聊城252000；2.東阿阿膠股份有限公司，山東聊城252201）

蛋白水解物因具有良好的生物活性而備受關(guān)注。但因某些水解過程中會產(chǎn)生苦味物質(zhì)，從而限制了其在現(xiàn)代食品工業(yè)中的廣泛應(yīng)用。本文綜述了近年來國內(nèi)外研究對苦味肽的形成機理及脫苦技術(shù)的最新研究進展，并指出了脫苦過程中產(chǎn)生的問題，旨在為蛋白水解物的脫苦提供技術(shù)支持。

蛋白酶解物；苦味；形成機理；脫苦方法

蛋白質(zhì)在酸堿酶的作用下均可發(fā)生分解[1]，且水解過程中產(chǎn)生的多肽大都具有一定的生物活性[2]。研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)經(jīng)水解制得的多肽營養(yǎng)性能好，且易于被人體吸收利用[3]。但蛋白質(zhì)水解會產(chǎn)生不同程度的苦味，苦味是一種閥值很低的味感，當含量在較低的時候就可以品嘗出來[4]。由于苦味的產(chǎn)生，使食品無法滿足人們的口感和嗜好。因此，限制了其在現(xiàn)代工業(yè)中的廣泛應(yīng)用[5]。本文主要討論了蛋白水解物苦味產(chǎn)生機理及脫苦的研究進展，以及現(xiàn)代脫苦方法的缺陷和展望。

1 苦味產(chǎn)生機理

蛋白水解物的苦味主要是由于產(chǎn)生了苦味肽，而苦味肽中的疏水性氨基酸則是引起蛋白質(zhì)產(chǎn)生苦味的主要因素[6]。多肽中的疏水性氨基酸不像蛋白質(zhì)中的被包埋在里面，它的大部分疏水性氨基酸暴露在外面，能夠刺激味蕾，產(chǎn)生苦味。疏水性氨基酸暴露的越多，產(chǎn)生的苦味越大。此外，多肽鏈的長度、多肽鏈的疏水度、氨基酸的序列和氨基酸的組成也會對蛋白水解物的苦味產(chǎn)生較大的影響[7]。

目前為止，對于多肽鏈的疏水度與苦味的關(guān)系仍然采用Ney提出的Q規(guī)則。根據(jù)Q（平均疏水度）來判斷疏水度與苦味的關(guān)系。付光中[8]等通過對蝦頭自溶產(chǎn)物成分的疏水度和苦味之間的關(guān)系進行研究，發(fā)現(xiàn)蝦頭自溶產(chǎn)物的苦味主要來自分子質(zhì)量為3 kD～5 kD的肽，并且不同分子質(zhì)量大小的自溶產(chǎn)物，平均疏水度越小苦味越大。有研究發(fā)現(xiàn)，當疏水性氨基酸殘基位于多肽鏈的C-端或者N-端時都會產(chǎn)生苦味，且當位于C-端時比位于N-端時產(chǎn)生的苦味更大。這說明了氨基酸序列與苦味值有關(guān)。宋雪梅等[9]利用Sephadex G-25葡聚糖凝膠色譜柱，從牦牛乳硬質(zhì)干酪中分離出含有14種苦味肽的組分，苦味肽序列中的疏水性氨基酸主要有脯氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸，這些疏水性氨基酸對苦味的產(chǎn)生有較大貢獻。

2 脫苦方法

針對蛋白質(zhì)水解會產(chǎn)生苦味，目前為止，蛋白酶解物的苦味脫除方法大體有：分離法、掩蓋法、酶法、微生物法等[10]。

2.1 選擇分離法

選擇分離法脫苦其原理是利用蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物中不同多肽組分的理化性質(zhì)的不同，采用吸附、萃取、沉淀、色譜分離等方法將水解液中具有苦味的多肽予以除去。

2.1.1 吸附法

吸附法是利用活性炭、樹脂等吸附劑將水解液中的苦味去除。趙晨霞等[11]采用活性炭對玉米肽進行初步分離純化，結(jié)果表明在pH值為3，吸附溫度為30℃，吸附劑用量為1∶10，吸附時間為2 h時，可對酶解得到的玉米肽進行初步分離純化，并為脫色脫苦提供了理論依據(jù)。此外，李治龍等[12]也做了相同的實驗，并得出了一致結(jié)論。徐錦等[13]對草魚蛋白酶解物進行脫腥脫苦的工藝研究，得到的最佳脫腥脫苦工藝條件為：活性炭添加量為0.6%，時間為1.5 h，溫度50℃。在此條件下水解液的腥苦味能很好的去除，且酶解液顏色較淺具有良好的風(fēng)味。Liu等[14]通過比較風(fēng)味酶和活性炭對大豆蛋白水解物的苦味的影響時發(fā)現(xiàn)，風(fēng)味酶的脫苦效果優(yōu)于活性炭。此外，硅藻土、珍珠巖也被用于蛋白水解液的脫苦[15-16]。

Cheison等[17]用20%、40%、75%的乙醇洗脫NA-mano G蛋白酶水解的乳清分離蛋白，得到了3個不同的組分HS20、HS40、HS75。結(jié)果表明，HS75的疏水性氨基酸含量最高，苦味最重。HS20則沒有可以察覺的苦味。米恒振等[18]通過比較8種大孔吸附樹脂的吸附解吸效果，最終確定XADTHP樹脂具有較好的脫苦效果，樹脂DA201-C的脫腥效果較好。

2.1.2 萃取法

酶解蛋白產(chǎn)物中苦味物質(zhì)還可用萃取法去除，苦味肽在其沸混合物如水與仲乙醇、水與乙醇或水與丙醇等醇相中濃縮，從而達到分離。采用這種方法對蛋白水解物有良好的去除效果[19]。

楊柳等[20]通過比較活性炭和仲丁醇對牛乳蛋白水解液的脫苦效果，發(fā)現(xiàn)仲丁醇添加量較少時脫苦效果不明顯。當仲丁醇添加量在150%時，苦味基本可除去，但氨基損失較高。相比之下，活性炭的脫苦效果優(yōu)于仲丁醇。

王向東等[21]分別采取吸附法、包埋法、掩蓋法、萃取法、發(fā)酵法對蛋清蛋白的復(fù)合酶解產(chǎn)物進行脫苦脫臭處理。結(jié)果表明膨潤土吸附法、β-環(huán)糊精包埋法、檸檬酸掩蓋法和酵母發(fā)酵法可基本去除蛋清寡肽混合液的苦臭味，是較有效的脫苦脫臭方法，而乙醚萃取法的脫苦效果不理想。

襲迪紅等[22]等用乙醚萃取鮐魚水解液，得到較好的脫苦脫腥效果。除此之外，乙醇、異丙基乙醇都可以作為萃取劑除去蛋白水解液中的苦味[23]。

2.1.3 色譜分離法

用于肽與蛋白質(zhì)分離的色譜分離法有：凝膠電泳色譜分離法（SDS-PAGE）、反相色譜（RLC）和疏水層析等[24-26]。

解銘[27]利用SP Sephadex C-25葡聚糖凝膠填料和反相高效液相色譜，對鱈魚肉酶解液進行分離純化，最終得到純度較高的兩條苦味肽。Sephadex C-25色譜柱能分離分子量為1 000 Da～5 000 Da肽類分子，是常用的分離凝膠柱[28-29]。

盧鶴等[30]通過超濾以及凝膠過濾色譜法（Sephadex G-15）分離大豆蛋白水解物，并對分子量在1 000 Da以下的小肽進行收集，從而為大豆酶解物中苦味的去除提供了理論依據(jù)。

2.1.4 沉淀法

沉淀法也被應(yīng)用于蛋白水解物的脫苦中。馮學(xué)武[31]通過等電點沉淀脫除大豆蛋白水解液的苦味，但是去除沉淀物后，脫苦效果并不十分明顯。Adler-Nissen[32]通過等電點沉淀，將蛋白水解物去除。

2.2 掩蓋法

掩蓋法是利用掩蓋劑與蛋白水解物混合，而達到脫苦的目的。因其不會造成其功能性成分的損失從而在食品工業(yè)中被廣泛應(yīng)用。

耿瑞婷等[33]通過研究扇貝蛋白酶解液的脫腥脫苦工藝，運用正交試驗優(yōu)化超濾聯(lián)合掩蓋法的最佳工藝條件。確定聯(lián)合脫腥脫苦的最佳組合為0.005%乙基麥芽酚、0.002%乳酸乙酯、0.1%料酒和0.5%食鹽。在此條件下，水解超濾液無苦味和腥味。李萍[34]通過單因素實驗和響應(yīng)面設(shè)計探究了β-環(huán)狀糊精脫苦大豆肽的最佳條件：pH 6.7、溫度40.0℃、β-環(huán)狀糊精與大豆肽的質(zhì)量比為1∶4、反應(yīng)時間為40.0 min。在此條件下，能夠大大降低大豆肽的苦味且與傳統(tǒng)的脫苦方法相比既不會造成功能肽的損失，也不會造成能源的浪費。曹川等[35]利用粉末活性炭和β-環(huán)糊精聯(lián)合處理貽貝肉酶解液，得到較好的脫腥脫苦效果。具體的條件為：先用1.25%的活性炭在40.0℃下吸附35 min，離心過濾除去活性炭，繼用1.2%β-環(huán)糊精在70.0℃下保溫10 min。

此外，其他的一些物質(zhì)如：聚磷酸鹽、檸檬酸、酸性氨基酸等都可以有效降低蛋白水解物的苦味[36]。

王東等[37]采用無機酸、有機酸、酸性氨基酸、β-環(huán)糊精、蔗糖、淀粉、脫脂奶粉等對大豆多肽進行脫苦。結(jié)果表明，有機酸、酸性氨基酸、β-環(huán)糊精以及酸糖按一定比例配合使用有較好的脫苦效果。陳園園[38]通過采用活性炭吸附與有機酸、葡萄糖掩蓋結(jié)合的方法，運用正交試驗優(yōu)化，當酶解液經(jīng)2%活性炭處理后，確定了最佳添加比例：檸檬酸0.3%，蘋果酸0.1%，葡萄糖3%。此時，水解液苦味基本被掩蓋，具有酸甜的口味并帶有淡淡蘋果香氣。此外，多聚谷氨酸也可以作為各種食物的苦味掩蓋劑，且作為健康飲食的組成成分而被廣泛應(yīng)用[39]。

甄潤英等[40]通過單因素試驗和正交試驗對羊骨膠原多肽口服液生產(chǎn)過程中的酶解液脫苦進行了研究。發(fā)現(xiàn)：采用8.5%蔗糖，1.2%甘氨酸和0.7%檸檬酸進行聯(lián)合掩蓋脫苦效果相對較好。

2.3 酶法

酶法脫苦主要是利用氨肽酶或羧肽酶去除多肽鏈末端的疏水性氨基酸殘基而達到去除苦味的目的。根據(jù)水解的位置不同，酶法可以分為氨肽酶法和羧肽酶法。氨肽酶法是從肽鏈的N-端開始水解，羧肽酶法則是從C-端開始水解。由于酶法條件溫和，不會造成生理活性成分的損失。因此，酶法被廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)水解物的脫苦中。

2.3.1 氨肽酶法

李靜等[41]以羅非魚下腳料經(jīng)中性蛋白酶所得的呈味肽為底物，經(jīng)氨肽酶酶解確定了最適合的酶解條件。在此條件下，呈味肽溶液的苦味基本消失。

須瑛敏[42]通過研究從豆腐乳中篩選得到的一種枯草芽孢桿菌所產(chǎn)的氨肽酶對大豆蛋白質(zhì)水解物苦味的影響，結(jié)果表明添加氨肽酶可較好的脫除大豆蛋白水解物的苦味。

2.3.2 羧肽酶法

早在1970年，Arai研究發(fā)現(xiàn)了用黑曲霉羧肽酶處理大豆蛋白水解物，多肽的苦味明顯下降[43]。

陳丹等[44]發(fā)現(xiàn)利用rocpo（重組米曲酶羧肽酶0）可以減輕大豆蛋白和酪蛋白的Alcalase蛋白酶水解物的苦味。

除了用氨肽酶法和羧肽酶法脫除蛋白質(zhì)水解物的苦味之外，錢方等[45]在相同條件下，將5種不同的蛋白酶（HAP低溫高堿堿性蛋白酶、1398中性蛋白酶、Flavourzyme復(fù)合風(fēng)味蛋白酶、胃蛋白酶和Alcalase堿性內(nèi)切酶）分別作用于大豆分離蛋白，發(fā)現(xiàn)用HAP低溫高堿堿性蛋白酶、1398中性蛋白酶、Flavourzyme復(fù)合風(fēng)味蛋白酶處理后的大豆蛋白水解物不易產(chǎn)生苦味，而剩下的兩種易產(chǎn)生苦味。此外，類蛋白反應(yīng)也被應(yīng)用于蛋白質(zhì)水解物的脫苦中[46]。

2.4 微生物法

自然界中的許多微生物可以產(chǎn)生肽酶，如少數(shù)的細菌、霉菌、酵母等，這些微生物具有脫苦的效果[1]。

2.4.1 細菌脫苦

張楨等[47]采用微生物發(fā)酵和活性炭吸附兩種處理方式對羅非魚下腳料酶解液進行脫腥去苦的研究，通過不同的考察指標，選取最佳活性炭吸附條件和最佳微生物發(fā)酵條件。并確定了羅非魚下腳料酶解液最佳脫腥去苦方式為干酪乳桿菌Lc菌和植物乳桿菌Lp菌混合發(fā)酵，發(fā)酵條件：發(fā)酵比例為 1 ∶1（Lc ∶Lp），接種量2%，發(fā)酵時間16 h，最適溫度37℃，該條件下對羅非魚下腳料酶解液脫腥去苦效果最佳。

曾少葵等[48]通過嗜熱乳鏈球菌和保加利亞乳桿菌混合發(fā)酵，改善羅非魚下腳料酶解液風(fēng)味。結(jié)果表明，當發(fā)酵時間為9 h，溫度為45℃，接種量為16%時，能夠減弱羅非魚酶解液的腥味，但脫苦效果不明顯。

2.4.2 霉菌脫苦

李萍[49]研究了用黑曲霉對大豆肽進行脫苦處理，根據(jù)單因素試驗結(jié)果設(shè)計中心組合試驗，以苦味值為指標，采用響應(yīng)面分析法確定最優(yōu)脫苦工藝參數(shù)。結(jié)果得到黑曲霉酶解液脫苦大豆肽的最適條件為：pH 1.0、時間2.1 h、溫度34.0℃，在此條件下，苦味大大減輕。

Li等[50]通過比較產(chǎn)自雅致放射毛霉的羧肽酶和堿性蛋白酶發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)自雅致放射毛霉的羧肽酶能更好的降低大豆蛋白酶解物的苦味。

李楊等[51]采用黑曲霉、米曲霉和毛霉混合發(fā)酵制備復(fù)合蛋白酶液。用所制得的蛋白酶液酶解大豆肽進行脫苦試驗，結(jié)果表明，最佳脫苦條件為：蛋白酶濃度為70 U/mL，酶解pH值為5.0，酶解溫度為62℃，酶解時間為2 h。在此條件下，短肽得率較大，苦味值較低。

2.4.3 酵母脫苦

黃繼紅等[52]研究了乳酸菌和酵母菌混合發(fā)酵對于谷朊粉溶解度與酶水解產(chǎn)物苦味特征的影響。結(jié)果表明經(jīng)預(yù)處理后的谷朊粉和微生物混合發(fā)酵后，溶解度和乳化性得到了明顯改善，苦味值降低。

黃薇等[53]以鱈魚皮復(fù)合酶解液為原料，采用粉末狀活性炭、酵母粉和β-環(huán)糊精為脫腥脫苦材料。并通過正交試驗設(shè)計研究了復(fù)合酶解液的脫腥脫苦工藝技術(shù)條件。結(jié)果表明：粉末狀活性炭吸附法與酵母粉發(fā)酵法聯(lián)合使用的效果最佳，即達到了脫腥脫苦的目的，又提高了鱈魚皮復(fù)合肽的品質(zhì)。

趙李妮等[54]用木瓜蛋白酶酶解平頦海蛇得到酶解液，并比較活性炭、酵母發(fā)酵和β-環(huán)糊精包埋對其脫腥去苦效果的影響。通過單因素試驗及正交試驗發(fā)現(xiàn)：活性炭對脫腥去苦的效果優(yōu)于酵母發(fā)酵和β-環(huán)糊精包埋。

除了采用選擇分離法、包埋法、酶法和微生物法對蛋白酶酶解液進行脫苦外，乙酰化法也被應(yīng)用于蛋白水解物的脫苦中[55-56]。

3 問題及展望

3.1 問題

近年來，雖然在探究蛋白水解物的苦味成因及脫苦技術(shù)上取得了重大進展，但仍存在一系列問題：（a）對于短肽苦味構(gòu)效關(guān)系的研究欠缺；（b）選擇分離法脫苦雖然有一系列優(yōu)點，但會造成營養(yǎng)物質(zhì)的損失；（c）包埋法因為不會造成營養(yǎng)物質(zhì)損失而被廣泛應(yīng)用，但可能產(chǎn)生不愉快的風(fēng)味；（d）微生物和酶法脫苦效果較好，但由于脫苦選用的微生物種類有限，也限制了其在食品工業(yè)中的應(yīng)用。

3.2 展望

蛋白水解物有較好的營養(yǎng)價值，有些還具有生物活性。但水解過程中產(chǎn)生苦味，限制了其在食品方面的應(yīng)用。目前，應(yīng)該更深入的了解蛋白水解物產(chǎn)生苦味的原因，并根據(jù)苦味產(chǎn)生機理對現(xiàn)有的脫苦方法進行改進和創(chuàng)新，使蛋白水解物能廣泛應(yīng)用于食品中。

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Review on the Formation Mechanism and Debittering Technology of Bitter Peptides

GUO Xing-feng1，2，WEI Fang1，ZHOU Xiang-shan2，TIAN Shou-sheng2，LIU Hai-feng2，ZHANG Jian-ling2，GUO Xiao-fei2
（1.School of Agriculture，Liaocheng University，Liaocheng 252000，Shandong，China；2.Dong-E E-jiao Co.，Ltd.，Liaocheng 252201，Shandong，China）

Protein hydrolysate has good bioactivities.However，its bitter taste is major hindrance for its use in the food industry.The latest research in domestic and overseas on bitterness mechanism and debittering method are reviewed and discussed.And the problems and prospects in the process of removing bitterness also pointed out for the debittering of protein hydrolysate.

protein hydrolysate；bitterness；formation mechanism；debittering technology

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.21.041

東阿阿膠博士后工作站博士后課題（K15LD0907）；聊城大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（201510447054）

郭興峰（1983—），男（漢），講師，博士，研究方向：天然產(chǎn)物研究與開發(fā)、農(nóng)產(chǎn)品加工。

2017-02-23