誘變育種方法在霉菌中的應(yīng)用

熊進，黃魁英，曹丁，甘祥武，陳瓊

（廣州市微生物研究所，廣東廣州510663）

誘變育種方法在霉菌中的應(yīng)用

熊進，黃魁英，曹丁，甘祥武，陳瓊

（廣州市微生物研究所，廣東廣州510663）

介紹誘變育種方法在霉菌中的研究進展以及物理誘變、化學(xué)誘變、物理化學(xué)復(fù)合誘變的應(yīng)用效果。研究表明，物理誘變方法比化學(xué)誘變方法應(yīng)用廣泛；利用物理誘變，適當(dāng)結(jié)合化學(xué)誘變也取得不錯效果。

誘變方法；霉菌；物理誘變；化學(xué)誘變

誘變育種是微生物選育最常用且行之有效的方法，在實際生產(chǎn)中，各種方法被不斷運用，已經(jīng)有很多誘變得到的高產(chǎn)菌株投入工業(yè)化生產(chǎn)。然而，其方法多種多樣，物理誘變方法和化學(xué)誘變方法相互之間組合的形式也比較多，其有一個共同的特點就是不定向的突變。在霉菌中，因其種類繁多、分布廣泛，又有菌絲和孢子等獨有特性，故誘變育種有其比較獨特的育種特點。目前普遍采用人工誘變育種的方式，主要包括物理誘變、化學(xué)誘變、生物誘變?nèi)箢怺1-2]。本文主要介紹目前已經(jīng)運用在霉菌上物理和化學(xué)的誘變方法以及效果，為提供誘變選擇提供新思路。

1 物理誘變

物理誘變方法在菌株的選育方面應(yīng)用廣泛，尤其獨特的特點，隨著物理技術(shù)的發(fā)展，逐步發(fā)展成為誘變技術(shù)對人體傷害小，處理時間短，環(huán)境污染小等特點。

1.1 紫外線誘變技術(shù)

紫外線是最簡單容易的物理操作技術(shù)，其突變具有不定向性，并且操作簡單，條件容易獲取，被廣泛的運用于各種微生物的誘變處理，在霉菌中也得到了廣泛的運用。采用紫外誘變對米曲霉K61菌株進行誘變，最終篩選出一株蛋白酶活力高且遺傳性能穩(wěn)定的突變株米曲霉Y29，菌株的蛋白酶活力明顯高于米曲霉3.042菌株，其中性蛋白酶活力可達(dá)9 180.98（U/g）[3]。陳亞光等[4]采用滬釀3.042米曲霉的孢子為對象，對其孢子進行紫外誘變，篩得到一株蛋白酶活力高且遺傳穩(wěn)定的突變株LY06，37℃培養(yǎng)44 h產(chǎn)酶活力由313 U/g曲料提高到556 U/g曲料，為原菌株的1.78倍，傳代培養(yǎng)15次，蛋白酶活力基本保持穩(wěn)定，沒有明顯的下降。屈二軍等[5]以黑霉菌株W1作為出發(fā)菌株進行紫外線誘變，從中篩選出的高產(chǎn)纖維素酶菌株NW1的酶活均有不同程度的提高，較出發(fā)菌株W1提高了1.58倍。郭魯宏等[6]以黑曲霉No.13為出發(fā)菌株，經(jīng)紫外線誘變處理獲得一株制備原生質(zhì)體的起始菌，該菌株單寧酶活性比No.13提高55%。周長海等[7]以自然發(fā)酵的粟米醬中分離的野生型米曲霉為出發(fā)菌株（S），經(jīng)分離、純化后，采用紫外線誘變育種的方法，得到菌株Y26比出發(fā)菌株S酶活提高了近5倍，突變株Y34孢子數(shù)比出發(fā)菌株S提高了近19倍。對于霉菌而言，紫外線處理原生質(zhì)體液和孢子液的效果是不一樣的，很多試驗都用原生質(zhì)體比直接的孢子液正突變效果要大。

1.260Co γ射線

γ射線穿透物質(zhì)后強度減小，但能量幾乎不降低，運用于生物誘變具有很好的效果，這也是現(xiàn)在生物誘變技術(shù)里得到非常廣泛運用的技術(shù)之一。陳建愛等[8]利用60Co γ射線輻照木霉（Trichoderma spp）菌株的誘變效果，使木霉分生孢子萌發(fā)率顯著降低，孢子萌發(fā)時間加長，有的萌發(fā)菌絲長成畸形，并且隨著照射時間的延長，萌發(fā)率急劇下降。楊平平等[9]利用60Co γ射線對黑曲霉447-92菌種產(chǎn)植酸酶的誘變效應(yīng)，篩選出產(chǎn)植酸酶較高的菌株，經(jīng)傳代培養(yǎng)，該突變株具有穩(wěn)定的遺傳性狀。梁新樂等[10]對綠色產(chǎn)色霉菌A-05菌株進行射線處理，確定了最佳劑量350 Gy，篩選出高產(chǎn)并且能夠穩(wěn)定遺傳的菌株，阿維霉素發(fā)酵單位達(dá)到68.5 mg/L。宋安東等[11]以斜臥青霉（Penicillium decumbeus）A10為出發(fā)菌株，經(jīng)450Gy射線誘變，篩選出纖維素酶高產(chǎn)菌株A50，發(fā)酵至60 h時，纖維素酶活和濾紙酶活均達(dá)到最高，分別為27.28U/mL和1.981 U/mL，較出發(fā)菌株A10分別提高了33.2%和45.59%。胡燕紅等[12]以米根霉As 3.819為出發(fā)菌株，采用60Co γ射線進行誘變處理，以正突變率為指標(biāo)，誘變劑量為400 Gy，通過篩選得到耐38℃高溫的5號突變株mut-5經(jīng)連續(xù)傳代7次，遺傳性狀穩(wěn)定，突變株發(fā)酵液中的乳酸含量提高了24.15%，乙醇含量降低了9.27%。很多試驗都表明60Co γ射線對微生物具有良好的高產(chǎn)菌株作用。

1.3 超高壓

超高壓對微生物有多方面的影響，它不僅可使微生物細(xì)胞組分、體積形態(tài)發(fā)生變化，還可使微生物的基因表達(dá)和核酸結(jié)構(gòu)及其生物學(xué)功能發(fā)生改變。隨著人們各種新技術(shù)的運用，超高壓被逐漸地應(yīng)用于生物學(xué)各種領(lǐng)域中，并在許多方面得到了深入研究，特別是在食品方面取得了初步的應(yīng)用[13-14]。王歲樓等[15]通過超高壓力誘變技術(shù)篩選出了2株具有較大應(yīng)用潛力的高壓突變株，酶活比出發(fā)菌株分別提高了2.83倍和2.57倍，并且發(fā)酵時間縮短了1 d，增加了生產(chǎn)收益，縮短了生產(chǎn)時間。有些微生物在極端耐高壓的條件下生存，壓力保持一種平衡狀態(tài)，通過打破這種平衡，來達(dá)到誘變的目的，引起了人們對耐高壓菌的探索。

1.4 激光誘變

人們在微生物遺傳育種中發(fā)現(xiàn)激光誘變具有操作簡單、安全、正突變機率高、對菌株損傷小、誘變菌株較出發(fā)菌株比提高倍數(shù)大等特點，其在霉菌中也進行了很好的運用，特別是在黑曲霉中運用提高倍數(shù)較大，但是激光與微生物作用機制還不能完全被弄明白[16-17]。李俊剛等[18]研究表明激光對黑曲霉原生質(zhì)體的致死率比對孢子的致死率高。激光對原生質(zhì)體誘變比孢子正突變率要高，其最高突變株酶活提高了91%。彭益強等[19]通過激光輻射黑曲霉孢子液和原生質(zhì)體液，表明原生質(zhì)體比孢子耐受激光誘變的能力強，并且誘變正突變菌株較多，最終篩選到一株酶活提高達(dá)3.75倍的變異菌株。原生質(zhì)體液和孢子液是霉菌誘變中比較典型的特征，并且霉菌產(chǎn)生的菌絲對液體的混勻也有一定的阻礙作用。

1.5 離子注入

曹小紅等[20]選用N+離子束注入米曲霉誘變，注入時選擇能量為20 keV，篩選得突變菌株TK-7，蛋白酶酶活較出發(fā)菌株提高36%。龐銳等[21]采用低能N+注入技術(shù)對米根霉As 3.819進行誘變選育，獲得L-乳酸產(chǎn)量最高達(dá)到103.81 g/L的菌株，較初篩前提高了30.71%。古紹彬等[22]采用低能離子注入誘變對米根霉PW352進行改良獲得高產(chǎn)L（+）-乳酸菌株RE3303產(chǎn)酸能力達(dá)131 g/L～136 g/L，最高可達(dá)140 g/L，產(chǎn)酸比PW352提高75%。龔加順[23]以單寧酸酶高產(chǎn)菌株用低能N+離子注入黑曲霉9701，使得正突變率達(dá)到27.61%，篩選得到高產(chǎn)菌株比出發(fā)菌株酶活力提高了2.68倍，且遺傳穩(wěn)定性好。通過相關(guān)文獻(xiàn)[24]，通過離子注入的方法，運用不同的菌株處理發(fā)現(xiàn)菌株目的產(chǎn)物最大能提高到原來的16倍，在霉菌里面也能夠提高到原來的15倍[25]。研究表明[26]，離子注入處理是一種有潛力的微生物誘變育種新方法，且產(chǎn)生的菌株比原來菌株有較大的提高，正突變率較大，產(chǎn)生的新菌株遺傳性能穩(wěn)定。

1.6 微波

邵淑娟等[27]采用微波輻照方法對產(chǎn)凝乳酶的黑曲霉JG進行誘變處理，選育出具有遺傳穩(wěn)定性的突變株WB6-3、WB2-5凝乳活力分別比出發(fā)菌株提高了35%和14%。李永泉等[28]采用微波輻照，對黑曲霉木聚糖酶生產(chǎn)菌進行誘變處理，結(jié)果選育到一株產(chǎn)量較高的生產(chǎn)菌，發(fā)酵單位從15 000 U/mL提到21 500 U/mL所選育的菌株經(jīng)多次傳代，遺傳性狀十分穩(wěn)定。

還有其它物理誘變技術(shù)的運用，例如超聲波誘變[29-30]、航天誘變[31-32]、常壓室溫等離子體、重離子輻照、熱效應(yīng)等誘變新技術(shù)。

2 化學(xué)誘變

在現(xiàn)在的應(yīng)用中，化學(xué)誘變有多種形式，既有運用某一種化學(xué)誘變劑進行的單因素誘變，也有組合其它化學(xué)誘變劑或其他多種誘變方法的復(fù)合誘變，還有化學(xué)誘變劑聯(lián)合抗生素作用抗性篩選等。而化學(xué)誘變劑很多是致癌劑或劇毒藥品，使用時須十分小心。

亞硝基胍在霉菌中單一的化學(xué)誘變中運用的很少，更多的是化學(xué)誘變劑結(jié)合物理誘變，并且取得很明顯的效果。張同亮等[33]利用亞硝基胍對野生黑曲霉DH-010進行誘變，使用自制的培養(yǎng)基篩選出10株對羊毛細(xì)化具有效果的菌株，又通過搖瓶復(fù)篩出一株對羊毛細(xì)化具有明顯效果的菌株并命名為DH-CAO，同時設(shè)計了一種以羊毛作為底物的酶活力測定方法，用此法篩選出的菌株的最高產(chǎn)酶活力可以達(dá)到620 μg/mL。其他的單一化學(xué)誘變劑在霉菌中很少有看到報道，主要是和其他誘變方法組成復(fù)合誘變方法。

3 物理化學(xué)復(fù)合誘變

多種物理誘變方法和多種化學(xué)誘變方法結(jié)合使用，在霉菌中為了得到高產(chǎn)菌株產(chǎn)生了很好的效果。特別是物理誘變方法紫外線和化學(xué)誘變方法氯化鋰相結(jié)合運用較多，并且提高倍數(shù)較大[34-37]。趙炎生等[38]采用激光和氯化鋰復(fù)合誘變赤霉菌，復(fù)合誘變提高達(dá)189.6%。徐麗等[39]應(yīng)用60Co γ射線照射并結(jié)合甲硫氛酸篩選模型和5-氟尿喀吮篩選模型誘變對出發(fā)菌株阿維鏈霉菌H20-16進行誘變處理，獲得發(fā)酵單位提高的菌株Co39-15和CF（20）-39-61比出發(fā)菌株分別提高了173.3%、76.5%。陳紅歌等[40]以黑曲霉MAO2 1為出發(fā)菌株，經(jīng)紫外線、亞硝基胍單獨處理和復(fù)合處理，獲得一株植酸酶高產(chǎn)菌株UN-12-10是原始菌株的3.6倍。林劍等[41]對琥珀酸產(chǎn)生菌S-1進行紫外線亞硝基胍的復(fù)合誘變后，篩選出琥珀酸產(chǎn)量高，在運用激光誘變，得出高產(chǎn)菌株相對于未誘變的菌株產(chǎn)量提高了343倍。方春玉等[42]以紫紅紅曲霉為出發(fā)菌株，通過物理（紫外線、超聲波、微波）誘變和化學(xué)（氮化鏗）誘變的方法來選育紅曲色素高產(chǎn)菌株，紫外和超聲波復(fù)合誘變的方法產(chǎn)紅曲色素的色價為922 U/mL，比出發(fā)菌株產(chǎn)紅曲色素的能力提高了約3倍。魏培蓮等[43]紅曲霉出發(fā)菌株經(jīng)紫外線,硫酸二乙酯,氯化鋰等誘變劑反復(fù)誘變處理，誘變株M7的含量比出發(fā)菌株相比提高了41倍。楊勁松[44]采用紫外線（UV）,激光（Laser）,亞硝基孤（NTG）復(fù)合誘變HN89青霉后，效價提高了100%以上的菌株為9株，占13%，其中突變株HN89-68活性物質(zhì)的相對效價可提高到286%。

各種物理誘變方法和化學(xué)方法結(jié)合的常被運用到，常常是一種物理誘變方法和一種化學(xué)誘變方法結(jié)合，也有運用多種物理誘變方法和一種或多種化學(xué)誘變方法結(jié)合，或者一種處理方法多次重復(fù)使用來達(dá)到高產(chǎn)的目的，其中最常運用到的物理方法有紫外線、激光、微波、60Co γ射線等，最長運用到的化學(xué)方法有氯化鋰、亞硝基胍、亞硝酸、硫酸二乙酯、甲基磺酸乙酯等。

4 總結(jié)

在霉菌誘變方法中，物理方法比較多，并且相對于化學(xué)方法來說較安全、簡單，并且不會產(chǎn)生很多的有害物質(zhì)對突變株的影響。在物理誘變方法中，新技術(shù)離子注入方法取得了很好的突破，提高了的倍數(shù)都比較大，并且適當(dāng)?shù)慕Y(jié)合化學(xué)誘變劑，也能夠取得很不錯的突變效果。今后發(fā)展新的物理技術(shù)運用到霉菌微生物誘變中，會有很不錯的發(fā)展前景。

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The Application of Mutation Breeding Method in the Mould

XIONG Jin，HUANG Kui-ying，CAO Ding，GAN Xiang-wu，CHEN Qiong
（Guangzhou Institute of Microbiology，Guangzhou 510663，Guangdong，China）

The research progress of mutagenic breeding methods in mold was introduced.The effects of physical mutation，chemical mutation and physical-chemical compound mutation were introduced.Research showed that，physical mutation methods were more widely used than chemical methods，the use of physical mutation and the appropriate combination of chemical mutation also achieved good results.

mutagenesis；mold；physical mutation；chemical mutation

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.09.045

2017-01-17

廣東省省級科技計劃項目（2016B090918055）；廣州市科技計劃項目（201705040004）

熊進（1989—），男（漢），助理工程師，碩士，研究方向：食品生物技術(shù)。