細胞轉(zhuǎn)運蛋白及其工程化應(yīng)用

楊坤，王穎，李春

（北京理工大學(xué)生命學(xué)院生物工程系，北京100081）

細胞轉(zhuǎn)運蛋白及其工程化應(yīng)用

楊坤，王穎，李春

（北京理工大學(xué)生命學(xué)院生物工程系，北京100081）

細胞轉(zhuǎn)運蛋白種類繁多，在細胞中進行營養(yǎng)物質(zhì)的攝取、代謝產(chǎn)物釋放以及信號傳遞等生理活動中發(fā)揮著重要作用。根據(jù)細胞轉(zhuǎn)運蛋白的轉(zhuǎn)運方式可分為：通道蛋白、載體蛋白和ATP驅(qū)動泵，其中，ABC 轉(zhuǎn)運蛋白（ATP-binding cassette transporters）屬于細胞中依賴三磷酸腺苷（ATP）水解供能的跨膜轉(zhuǎn)運蛋白，其參與動物細胞的多藥耐藥性以及植物體在外界脅迫條件下的自我防御而受到廣泛關(guān)注。對細胞轉(zhuǎn)運蛋白的清晰認識是進行有效利用的基礎(chǔ)，因此本文綜述了植物、動物和微生物細胞中有關(guān)代謝產(chǎn)物和藥物等物質(zhì)轉(zhuǎn)運相關(guān)的ABC轉(zhuǎn)運蛋白的結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)運機制。總結(jié)了當前細胞轉(zhuǎn)運蛋白在各領(lǐng)域的工程化應(yīng)用進展和需要解決的問題，旨在為更全面高效地利用細胞轉(zhuǎn)運蛋白進行抗癌新藥的研究開發(fā)、提高農(nóng)作物的抗逆性和微生物細胞工廠的高效生物制造提供借鑒。

生物膜；轉(zhuǎn)運蛋白；傳遞；生物制造；合成生物學(xué)

細胞轉(zhuǎn)運蛋白廣泛分布于細胞膜表面，介導(dǎo)了生物膜上幾乎所有的物質(zhì)交換和信號傳導(dǎo)過程[1]。按其轉(zhuǎn)運方式的不同，細胞轉(zhuǎn)運蛋白可分為以下三類：①通道蛋白，是一類由疏水氨基酸組成的橫跨細胞膜雙分子層的蛋白質(zhì)，介導(dǎo)著適宜大小的分子和帶電離子通過，如水通道蛋白、鈣離子通道蛋白等[2]。②載體蛋白，是一類通過自身構(gòu)型的變化來改變與底物分子間的親和力，從而促進底物的跨膜運輸?shù)牡鞍踪|(zhì)。運載底物包括糖、氨基酸、核苷酸等水溶性小分子物質(zhì)。如葡萄糖與紅細胞上的血紅蛋白相結(jié)合，通過構(gòu)象變化使葡萄糖順利通過細胞膜進入細胞[3]。③ATP驅(qū)動泵，是一類依賴三磷酸腺苷（ATP）水解提供能量促使底物分子逆濃度梯度跨膜轉(zhuǎn)運的蛋白質(zhì)。根據(jù)它的分布和轉(zhuǎn)運特點又分為：P型ATP驅(qū)動泵，其廣泛分布于細胞質(zhì)膜上，輔助Na+、K+的轉(zhuǎn)運，維持細胞的穩(wěn)態(tài)[4]。F型ATP驅(qū)動泵，在線粒體膜、葉綠體膜及細菌質(zhì)膜上，由多亞基的F1和F0兩大部分組成，利用ATP水解供能，將H+泵出胞外，建立跨膜的電化學(xué)質(zhì)子梯度，輔助細胞攝取所需的營養(yǎng)物[5]。ABC驅(qū)動泵，也稱ABC轉(zhuǎn)運蛋白（ATP-binding cassette transporters），是一類依靠ATP水解提供能量促使底物在細胞內(nèi)外跨膜轉(zhuǎn)運的蛋白質(zhì)家族[6]。目前，研究發(fā)現(xiàn)的ABC轉(zhuǎn)運蛋白數(shù)目已經(jīng)有100多種，其廣泛分布在從細菌到人類的各類生物體細胞中，參與生物體內(nèi)許多重要的生理功能，如在植物體內(nèi)參與次生代謝產(chǎn)物的累積和外排，保護植物體免受外界不良環(huán)境的脅迫，幫助植物更好地繁殖和進化[7]；在動物細胞中參與營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，部分毒性物質(zhì)的分泌排放以及調(diào)節(jié)細胞內(nèi)pH等來維持細胞的穩(wěn)態(tài)；另外許多致病細菌還能依賴自身轉(zhuǎn)運蛋白外排作用來降低藥物在細胞內(nèi)的有效濃度，導(dǎo)致致病菌出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象等[8]。

當前已有許多研究致力于將細胞轉(zhuǎn)運蛋白應(yīng)用到生物制造中，來解決人們所面臨的問題，比如在微生物細胞中構(gòu)建或加強轉(zhuǎn)運蛋白的表達體系，通過外排難以自由通過細胞膜的目標產(chǎn)物，以此來減輕細胞負荷，達到進一步提升工程菌生產(chǎn)目標產(chǎn)物產(chǎn)量的目的。在植物細胞中，利用轉(zhuǎn)運蛋白來使作物對土壤中的礦物質(zhì)元素高效吸收，從而使農(nóng)作物從整體上提高對不良環(huán)境的耐受性。在動物細胞中，通過對轉(zhuǎn)運蛋白在藥物外排轉(zhuǎn)運機制的研究，來生產(chǎn)出高效抗癌藥物等。本文綜述了細胞轉(zhuǎn)運蛋白的分類以及當前的工程化應(yīng)用，旨在為人們更高效利用工程微生物合成所需要目標產(chǎn)物提供借鑒。

1 細胞轉(zhuǎn)運蛋白結(jié)構(gòu)及其轉(zhuǎn)運機制

1.1 通道蛋白

通道蛋白是一類由疏水氨基酸組成的蛋白質(zhì)，橫跨細胞膜形成親水通道，能使一些特定大小的分子和帶電離子順濃度梯度從質(zhì)膜的一側(cè)轉(zhuǎn)運到另一側(cè)[9]。所有通道蛋白均以自由擴散的方式運輸溶質(zhì)，不消耗能量。大多數(shù)通道蛋白在細胞膜間形成有選擇性開關(guān)的跨膜通道，這些通道又可分為離子通道和水通道。離子通道在神經(jīng)元與肌細胞神經(jīng)傳遞過程中起著重要作用，其包括電壓力通道、配體門通道和壓力激活通道[10]（如圖1）。水通道是指在低滲溶液中水分子不能自由擴散進入細胞，需借助水通道來完成。如腎小球的濾過作用和腎小管的重吸收作用[11]。

1.2 載體蛋白

載體蛋白是生物膜上普遍存在的一類跨膜蛋白質(zhì)，通過構(gòu)象的變化促成底物運輸。它既可以參與被動運輸，又可以參與逆濃度或者電化學(xué)梯度的主動運輸[12]。圖2所示為載體蛋白介導(dǎo)溶質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運的示意圖[13]。通常，載體蛋白與運載分子具有特異性，一個特定的載體只運輸一種類型的分子或離子，其轉(zhuǎn)運底物包括糖、氨基酸、核苷酸等水溶性分子等。

圖1 三種類型的門控離子通道示意圖[10]

圖2 載體蛋白通過構(gòu)象變化介溶質(zhì)的跨膜運輸[13]

1.3 ATP驅(qū)動泵

ATP驅(qū)動泵（ATP –powered pumps）是一類依靠ATP水解釋放能量來進行物質(zhì)跨膜運輸?shù)牡鞍踪|(zhì)家族。其廣泛分布于各種生物膜上，包括P型ATP驅(qū)動泵，F(xiàn)型ATP驅(qū)動泵，以及ABC轉(zhuǎn)運蛋白[14]。P型位于質(zhì)膜之中，由α和β2個亞基組成的一種陽離子泵。α亞基起催化作用，β亞基調(diào)控驅(qū)動泵的活性，共同維持著細胞膜內(nèi)外離子的穩(wěn)態(tài)。F型多數(shù)存在于線粒體內(nèi)膜，葉綠體囊膜以及細菌質(zhì)膜上。它在能量轉(zhuǎn)換中起重要作用，F(xiàn)型質(zhì)子泵不僅可以利用質(zhì)子動力勢將ADP轉(zhuǎn)化成ATP，也可以利用水解ATP釋放的能量轉(zhuǎn)移質(zhì)子，是氧化磷酸化或光合磷酸化偶聯(lián)因子[15]。ABC轉(zhuǎn)運蛋白通常由2個高度疏水的跨膜結(jié)構(gòu)域（transmembrane domain TMD）和2個核苷酸結(jié)合域（nucleotide binding domain NBD）組成，ABC蛋白X-射線晶體結(jié)構(gòu)分析表明，TMD擁有底物結(jié)合位點，NBD通過水解ATP獲得能量，TMD通過疏水作用和NBD結(jié)合在一起，共同作用完成底物的跨膜轉(zhuǎn)運過程[16]。

在ABC轉(zhuǎn)運蛋白中，不同的成員間核苷酸結(jié)合域NBD序列相對保守，同源性通常是30%～ 40%，通常包含3個特征性基序：ATP結(jié)合位點、Walker A 盒和Walker B盒。以及在兩盒之間的大約有120個氨基酸的ABC標記（ABC signature），是ABC轉(zhuǎn)運蛋白的特征性序列[17]?？缒そY(jié)構(gòu)域TMD一般由4～6個α螺旋構(gòu)成，參與底物的識別過程，形成跨膜運輸通道來實現(xiàn)底物的跨膜運輸。大多數(shù)已鑒定的真核ABC轉(zhuǎn)運蛋白中，這4個結(jié)構(gòu)域以正向的TMD1-NBF1-TMD2-NBF2或者反向的NBF1-TMD1-NBF2-TMD2的組織方式連接在一條多肽分子上，形成全分子ABC轉(zhuǎn)運蛋白[18]。圖3是植物多向耐藥性PDR（pleiotropic drug resistance）蛋白的二級結(jié)構(gòu)示意圖[19]，具有典型的ABC轉(zhuǎn)運蛋白結(jié)構(gòu)。

圖3 植物PDR轉(zhuǎn)運蛋白結(jié)構(gòu)[19]

2 細胞轉(zhuǎn)運蛋白的生物學(xué)功能

2.1 通道蛋白的功能

水通道蛋白AQPs（aquaporins）是細胞膜上跨膜運輸水分子的一類特殊通道蛋白質(zhì)家族[20]，因其參與腫瘤細胞的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移過程而受到研究人員廣泛關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，AQP1形成的水通道可以改變癌變組織內(nèi)的滲透壓，進而改變細胞的形體，同時借助于該通道加快腫瘤細胞向周圍基質(zhì)浸潤的速度。研究者以此為切入點，有望通過抑制AQPs的表達來為癌細胞的治療提供新的靶點。如在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，視神經(jīng)脊髓炎NMO（neuromyelitis optica）是引起脫髓鞘疾病的直接因素。靶抗體水通道蛋白AQP4因為具有高靈敏性的特點，長期作為NMO和其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫缺陷疾病的有效鑒別方法[21]。

2.2 載體蛋白的功能

載體蛋白是細胞膜中不可或缺的一類膜蛋白，也是許多營養(yǎng)物質(zhì)如糖、氨基酸等小分子物質(zhì)進出細胞的通道。如大腸桿菌和谷氨酸棒狀桿菌均能通過細胞質(zhì)膜上的轉(zhuǎn)運載體對環(huán)境中所需要的營養(yǎng)物質(zhì)進行吸收利用，也能將氨基酸分泌到胞外行使相應(yīng)功能。細胞對葡萄糖的吸收利用也是由葡萄糖載體蛋白來協(xié)助完成。從紅細胞里分離出來的葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白GLUT1廣泛存在于生物體的大腦、神經(jīng)系統(tǒng)、肌肉等組織器官中，對于維持人的正常生理功能極為重要。已有研究把抑制葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白GLUT1的表達為突破口，使癌細胞得不到足量葡萄糖供應(yīng)，達到“餓死”癌細胞的目的[22]。

在生產(chǎn)氨基酸的工程菌中，氨基酸在細胞內(nèi)的過度積累會引起代謝途徑中關(guān)鍵酶的反饋抑制，導(dǎo)致菌體生長過慢，對進一步提高工程菌生產(chǎn)目的產(chǎn)物產(chǎn)量帶來不利影響。近年來，氨基酸跨膜轉(zhuǎn)運作為降低胞內(nèi)產(chǎn)物濃度，解除細胞反饋抑制的有效方法受到人們廣泛關(guān)注。如GUNJI等[23]將賴氨酸/L-精氨酸轉(zhuǎn)運蛋白（LysE）引入到谷氨酸棒桿菌，并通過發(fā)酵優(yōu)化使賴氨酸達11.3g/L，產(chǎn)量比原始菌高出10倍以上。在L-蘇氨酸發(fā)酵過程中，細胞內(nèi)L-蘇氨酸的濃度積累到一定程度時，便會對合成途徑中的關(guān)鍵酶（如高絲氨酸脫氫酶、蘇氨酸合成酶等）產(chǎn)生反饋抑制。梁媛等[24]在L-蘇氨酸生產(chǎn)菌Escherichia coliTRFC中成功構(gòu)建L-蘇氨酸轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，通過減少胞內(nèi)L-蘇氨酸濃度，從而使L-蘇氨酸的產(chǎn)量及糖轉(zhuǎn)化率較原始菌分別提高15.3%和16.1%。通過對微生物細胞中轉(zhuǎn)運蛋白的挖掘和功能探索，可以為氨基酸生產(chǎn)菌株的設(shè)計與改造提出有價值的參考依據(jù)。

2.3 ABC轉(zhuǎn)運蛋白的功能

2.3.1 植物天然產(chǎn)物的轉(zhuǎn)運與自我防御

植物天然產(chǎn)物是指從植物體內(nèi)分離出來的次生代謝產(chǎn)物，大多數(shù)在抗氧化、抗炎癥和抗病毒感染等方面均有明顯作用。按其生物合成的起始分子不同，植物產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物主要可分為萜類、黃酮類、苯丙素類和生物堿等化合物。這些化合物雖然不直接參與植物必需的生命活動，但在植物體內(nèi)的累積和外排被高度調(diào)節(jié)，保護植物體免受環(huán)境中生物和非生物脅迫的損傷。幫助植物更好地繁殖和進化。已有研究表明，植物生長素的極性轉(zhuǎn)運、脂質(zhì)的降解、外源毒素的降解、植物抗病和氣孔的調(diào)節(jié)等都與植物ABC轉(zhuǎn)運蛋白有著不可分割的關(guān)系[25]。

自1992年國際上報道了第一個從擬南芥（Arabidopsis thaliana）中克隆的ABC轉(zhuǎn)運蛋白AtPGP1以來[26]，已有很多文獻陸續(xù)報道了植物轉(zhuǎn)運蛋白參與次級代謝產(chǎn)物的積累與排放，對植物生理代謝起著重要調(diào)控作用。如KANEDA等[27]發(fā)現(xiàn)擬南芥中ABCB亞族基因和AtABC1協(xié)調(diào)表達，共同參與擬南芥莖的木質(zhì)化過程，在植物莖中發(fā)揮著運輸生長素的重要作用。水生植物浮萍SpTUR2（Spirodella polyrhiza）是第一個被鑒定的植物PDR基因[28]，當浮萍在高鹽、寒冷的環(huán)境便通過大量誘導(dǎo)SpTUR2基因表達來應(yīng)對非生物環(huán)境脅迫壓力。MAVEL等[29]研究發(fā)現(xiàn)，在木本植物擬南芥葉片中存在著一些揮發(fā)性單萜和倍半萜表達基因，當植物體遇到蟲害時則會引起植物體內(nèi)產(chǎn)生大量的揮發(fā)性萜類物質(zhì)，可引起植物開啟防御害蟲系統(tǒng)。KLEIN 等[30]發(fā)現(xiàn)長春花（Catharanthux roseus）中轉(zhuǎn)運蛋白CrMDR1起轉(zhuǎn)運各種單萜和生物堿的作用。黃連素（Coptis japonica）是一種重要的異喹啉生物堿，其大量積累在黃連根莖組織的液泡之中，SHITAN等[31]發(fā)現(xiàn)了CjMDR蛋白能識別黃連素并將其作為底物最終轉(zhuǎn)移至液泡中儲存。煙草屬植物產(chǎn)生的生物堿尼古丁，首先是在根部組織中合成，當受到致病菌和食草動物侵害時，煙草中一種轉(zhuǎn)運蛋白PDR12的表達會顯著增加，并將生物堿由植物根部向葉片中的液泡中轉(zhuǎn)移并積累，以此來防御各種侵害。

2.3.2 藥物轉(zhuǎn)運與細胞耐藥性

在不良環(huán)境下，酵母菌通過自身轉(zhuǎn)運體系能很快地克服不良影響。如定位于細胞質(zhì)膜上的ABC轉(zhuǎn)運蛋白Yorl能將寡霉素外排出細胞[32]。PDR5和PDR12等直接與細胞內(nèi)多種藥物的耐藥性有關(guān)，能將一些甾醇類、誘變劑和陽離子藥物外排出細胞。Aus1p和Pdr11p可以把外源甾體轉(zhuǎn)運到細胞膜內(nèi)獲取營養(yǎng)，酵母細胞膜上的活性因子Pdr3p和Pdr1p促進細胞膜上某些脂類成分的合成和轉(zhuǎn)運，共同來維持細胞的穩(wěn)態(tài)[33]等。

在已報道的人類基因組中，有49個ABC轉(zhuǎn)運蛋白基因，依據(jù)序列同源性可分為A～G 7個家族。他們負責不同底物如離子、糖、多肽、蛋白質(zhì)和大量的疏水化合物和代謝產(chǎn)物的跨膜轉(zhuǎn)運，其中A、B、C、G 4個家族的轉(zhuǎn)運體已被證實與細胞的耐藥性密切相關(guān)[34]。1976年在秋水仙堿耐藥的中國倉鼠卵巢細胞中發(fā)現(xiàn)P-糖蛋白（P-glycoprotein），是一種分子量約17萬的ATP依賴性外向膜轉(zhuǎn)運蛋白，由1280個氨基酸殘基組成，廣泛存在于機體各組織和器官中，參與著多種藥物的吸收、分布和排泄過程[35]。從結(jié)構(gòu)上來看，每個P-gp分子由12個跨膜區(qū)組成，分成兩個對稱的部分。每一部分有1個疏水區(qū)和1個親水區(qū)，親水區(qū)含1個親水性核酸結(jié)合區(qū)（nucleotide-bind domain，NBD），該結(jié)構(gòu)上有1個ATP結(jié)合位點。疏水區(qū)由6個跨膜區(qū)（membrane spanning domains，MSDs）構(gòu)成，它提供與底物結(jié)合位點[36]，而能把許多不同結(jié)構(gòu)的化合物如脂類、氨基酸和一些藥物逆向轉(zhuǎn)運出細胞，即“藥物外排泵”。

ABC轉(zhuǎn)運蛋白如P-糖蛋白對細胞中多種藥物的外排作用一直是腫瘤化療的重要障礙。一些常規(guī)的抗腫瘤藥物如：①免疫抑制藥物，如環(huán)孢素A，蓮心堿等；②抗生素類抗腫瘤藥，如柔紅霉素；③植物堿類，如長春新堿、紫杉醇等；④蒽環(huán)類化療藥，如柔紅霉素、阿霉素等都是典型的P-糖蛋白底物[37]，能抑制其對細胞內(nèi)藥物泵出到胞外。在P-糖蛋白外排作用的生物學(xué)實驗中，給實驗動物喂食P-gp抑制劑，發(fā)現(xiàn)可以提高細胞對于隱丹參酮的生物利用度[38]，而使用P-gp的誘導(dǎo)劑連翹則可降低細胞中其他藥物如地高辛、苯二氮草類、茶堿等的血藥濃度，從而使細胞內(nèi)藥物濃度無法達到治療疾病的功效[39]。當前，細胞中仍有相當一部分未知功能的轉(zhuǎn)運蛋白需要研究人員去挖掘和探索。相信通過對轉(zhuǎn)運蛋白的結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)運機制的深入研究，會為許多疾病的治療以及抗腫瘤新藥的開發(fā)提供新思路。

3 細胞轉(zhuǎn)運蛋白的工程化應(yīng)用

3.1 轉(zhuǎn)運蛋白在癌癥治療中應(yīng)用

目前，已有許多研究者提出了利用細胞轉(zhuǎn)運機制來進行癌癥治療的新策略。比如來自麻省理工大學(xué)的SABATINI等[40]報道了利用癌細胞能夠吸收正常細胞無法攝取的毒性物質(zhì)這一特性，提出過表達癌細胞表面的特定轉(zhuǎn)運蛋白來吸收毒性物質(zhì)，能有效殺滅癌細胞。單羧酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白MCT1，是一種臨床上的癌癥治療藥物，主要通過抑制糖酵解來發(fā)揮作用，而許多癌細胞對于糖酵解的上調(diào)作用具有較強的依賴性。通過癌細胞表面特定轉(zhuǎn)運蛋白的過表達將MCT1藥物轉(zhuǎn)運到癌細胞中對治療癌癥具有靶向性和選擇性。

癌細胞擴散也一直是癌癥治療中的難題之一，多數(shù)的癌癥死亡病例都是由癌細胞擴散造成的。癌細胞可從原發(fā)部位轉(zhuǎn)移到肺葉、骨骼或者肝臟等部位，形成新的腫瘤[41]。近期，REYMOND等[42]研究發(fā)現(xiàn)一種癌細胞轉(zhuǎn)移所需的關(guān)鍵轉(zhuǎn)運蛋白Cdc42蛋白，以這種蛋白為靶點，或?qū)⒊蔀轭A(yù)防癌細胞轉(zhuǎn)移的有效方法。SHORT對小鼠癌細胞以及人類乳腺癌細胞的觀察，發(fā)現(xiàn)這種蛋白能夠幫助癌細胞依附于血管壁上，從而使它們通過血液擴散到身體的其他部位[43]。因此，抑制這種蛋白的表達或者直接往血液中注射抑制劑，阻止癌細胞依附于血管壁內(nèi)皮細胞，從而防止癌細胞擴散是當前研究治療癌癥的新方向。從理論上來說，這種方法在未來是極有可能實現(xiàn)的。

另一方面，腫瘤細胞因其自身固有的耐藥性，而使得對化療藥物不敏感，導(dǎo)致細胞多藥耐藥（multidrug resistance MDR）現(xiàn)象發(fā)生[44]。人們通過對天然產(chǎn)物抑制腫瘤耐藥性方面的活性進行了研究，發(fā)現(xiàn)了許多天然產(chǎn)物可通過抑制轉(zhuǎn)運蛋白的表達或者競爭性地結(jié)合于轉(zhuǎn)運蛋白，從而減少細胞對抗癌藥物的外排。如皂甙類混合物可以作用于HepG2/Dox癌細胞，能阻止細胞中P-糖蛋白的過表達，從而降低癌細胞的耐藥性，增強癌細胞對藥物的敏感性[45]。通關(guān)藤提取物對白血病、HL60細胞有明顯的抑制和誘導(dǎo)凋亡作用，能有效降低癌細胞表面轉(zhuǎn)運蛋白的功能，進而抑制抗腫瘤藥物的外排等[46]。目前，通過藥物外排轉(zhuǎn)運機制來篩選天然產(chǎn)物中轉(zhuǎn)運蛋白的抑制劑，是當前開發(fā)抗癌藥物的熱點之一。

3.2 轉(zhuǎn)運蛋白提高農(nóng)作物產(chǎn)量

一直以來，傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)技術(shù)僅僅通過增加化肥的使用和水供應(yīng)系統(tǒng)無法同時有效地完成提高農(nóng)業(yè)產(chǎn)量和實現(xiàn)環(huán)境可持續(xù)發(fā)展這兩大重要任務(wù)。當前已有研究者發(fā)現(xiàn)許多植物轉(zhuǎn)運蛋白不僅會穿過農(nóng)作物的生物膜來對抗有毒的金屬離子和昆蟲，而且能提高農(nóng)作物的抗鹽性和耐旱性、控制水分流失并存儲糖分[47]。這類發(fā)現(xiàn)將對全球農(nóng)業(yè)產(chǎn)生深遠影響，有助于滿足不斷增加的全球人口對食物和能源的需求。

比如鹽分脅迫會導(dǎo)致種植在灌溉土地上的農(nóng)作物大幅減產(chǎn)，DUAN等[48]在一項研究中發(fā)現(xiàn)，鈉轉(zhuǎn)運蛋白在保護植物免受鹽脅迫中起著重要的調(diào)控作用，將這種鈉轉(zhuǎn)運蛋白用于育種研究中，在鹽分脅迫環(huán)境下，耐鹽小麥能將產(chǎn)量提高25%。鋁是土壤中第三大元素，當土壤呈酸性時，土壤中的鋁離子會釋放出來，導(dǎo)致植物中毒。通過人為提高植物根部的鋁離子轉(zhuǎn)運蛋白的表達水平則會使植物耐受鋁離子的毒性，這使得原先無法利用的貧瘠酸性土壤“變身”為肥沃的農(nóng)田成為可能。研究者通過有效利用轉(zhuǎn)運蛋白，使得農(nóng)作物從整體上提高了對外界不良環(huán)境的耐受性[49]。

3.3 轉(zhuǎn)運蛋白提高細胞工廠合成天然產(chǎn)物和藥物的效率

長期以來，天然產(chǎn)物因其具有廣泛的藥理學(xué)和生物學(xué)活性，如抗氧化、提高機體免疫力、抑制癌癥等被大量應(yīng)用于藥物的研究開發(fā)與設(shè)計[50]。但目前大部分天然產(chǎn)物的獲取均受到了資源、成本和生產(chǎn)技術(shù)的限制，如傳統(tǒng)工藝生產(chǎn)抗瘧疾藥物青蒿素的方法主要是從黃花蒿中提取，但其含量僅占黃花蒿干重的0.881%[51]，過度種植面臨著占用耕地、植株采集破壞環(huán)境、提取過程繁瑣等一系列問題。而伴隨著全基因組測序技術(shù)、代謝工程和合成生物學(xué)的迅猛發(fā)展，通過微生物進行跨種屬多基因的協(xié)同表達與調(diào)控，來進行外源產(chǎn)物的“從頭合成”可以有效解決來源匱乏和環(huán)境破壞等問題。目前已取得可觀的技術(shù)成果，如KEASLING教授課題組[52]對酵母合成體系進行了一系列優(yōu)化，包括更換表達菌株、強化HMGR基因表達、敲除半乳糖代謝基因等遺傳修飾，同時對發(fā)酵過程進行整體優(yōu)化，最終使得青蒿酸產(chǎn)量提高到25g/L，取得了突破性的成果。STEPHANOPOULOS等[53]將紫杉二烯的合成途徑引入大腸桿菌中，并對整個代謝途徑進行調(diào)控和優(yōu)化，獲得了高產(chǎn)紫杉二烯的大腸桿菌，并將產(chǎn)量提升到1g/L。ZHANG等[54]在釀酒酵母中對β-香樹脂醇合成路徑進行了構(gòu)建和調(diào)控，構(gòu)建出了穩(wěn)定生產(chǎn)β-香樹脂醇的酵母工程菌，通過發(fā)酵優(yōu)化后使產(chǎn)量達到138.8mg/L。

但進一步提高目的產(chǎn)量卻出現(xiàn)了瓶頸，原因是工程菌生產(chǎn)的目的產(chǎn)物大多是極性化合物，難以自行轉(zhuǎn)運到胞外，在胞內(nèi)過量積累也給細胞造成了代謝負荷，大大限制了在底盤宿主中的生產(chǎn)效率和工業(yè)化應(yīng)用。因此尋找一種能高效促使目標產(chǎn)物跨膜轉(zhuǎn)運的轉(zhuǎn)運蛋白是減輕工程菌負荷的直接方法。而在植物細胞內(nèi)，存在著許多轉(zhuǎn)運蛋白參與天然產(chǎn)物的跨膜運輸，因此，通過在微生物細胞中構(gòu)建天然產(chǎn)物胞外轉(zhuǎn)運體系來緩解產(chǎn)物積累所造成的負面影響，是實現(xiàn)產(chǎn)量提高的有效途徑，圖4是將植物中轉(zhuǎn)運蛋白構(gòu)建在工程菌中，來促進目標產(chǎn)物胞外轉(zhuǎn)運的示意圖。胞外轉(zhuǎn)運還有利于產(chǎn)物的后期提取和處理，這一方法也為其他萜烯類物質(zhì)的胞外轉(zhuǎn)運和提取提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持，對于促進工程菌合成天然產(chǎn)物的工業(yè)化生產(chǎn)具有重大意義。

圖4 工程菌釀酒酵母中構(gòu)建植物轉(zhuǎn)運蛋白

4 結(jié)語與展望

近年來，隨著人們對轉(zhuǎn)運蛋白的結(jié)構(gòu)和功能特性的認知不斷加深，并將其應(yīng)用到生物制造中，大大提升了應(yīng)用價值。但目前細胞轉(zhuǎn)運蛋白的研究和工程化應(yīng)用仍處于初級化階段，要實現(xiàn)高效利用仍然有一些重要的基礎(chǔ)理論和技術(shù)問題需要解決，如生物體細胞中仍有相當數(shù)量的轉(zhuǎn)運蛋白尚未被挖掘；對已報道的轉(zhuǎn)運蛋白，缺乏對空間結(jié)構(gòu)及其參與復(fù)雜化合物轉(zhuǎn)運過程的完整理解等，而弄清轉(zhuǎn)運蛋白作用機制是提升其轉(zhuǎn)運效率，實現(xiàn)高效工程化應(yīng)用的基礎(chǔ)。因此，今后研究者的工作應(yīng)主要集中于以下兩個方面：第一，通過對多物種的基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫進行研究，挖掘出更多潛在功能的轉(zhuǎn)運蛋白；第二，對挖掘出的轉(zhuǎn)運蛋白進行底物結(jié)合位點的改造，提升轉(zhuǎn)運蛋白運輸效率，充分發(fā)揮其應(yīng)用價值。隨著人們對其研究應(yīng)用的加深，相信轉(zhuǎn)運蛋白將會為生物制造在醫(yī)療、生產(chǎn)以及工業(yè)化應(yīng)用等方面帶來更廣闊的發(fā)展空間。

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Cell transporter protein and engineered applications

YANG Kun，WANG Ying，LI Chun
（School of Life Science，Beijing Institute of Technology，Beijing 100081，China）

There are a lot of cell transport proteins. They play an important role in many physiological activities，such as uptaking nutrients，releasing metabolites，and transducting signal processes on biofilms. According to the transporting way of the cell transport proteins，they can be devided into channel protein，carrier protein，and ATP-powered pump. ABC transporters（ATP-binding cassette transporters），which is a kind of cell transporter proteins widely distributed in organisms，can transport a variety of compounds with energy supplied by ATP hydrolysis. In recent years，it has drawn widely attention regarding the multi-drugs resistance of animal cells and the self-defense of plants under external stress. The understanding of the cellular transport proteins provides the basis for effectively using it. This paper illustrated the structures and mechanisms of ABC transporter proteins found in plants，animals，and microbial cells；and summarized the progress of engineering applications of cell transporter proteins in various fields and the remaining problems. Finally，guidance will be provides to use cell transporter proteins in developing cancer drug，improving crop yield as well as efficient synthesis of metabolites in engineered microorganisms.

biofilm；transport protein；ransferring；bio-manufacture；synthetic biology

Q815

A

1000–6613（2017）04–1410–08

10.16085/j.issn.1000-6613.2017.04.034

2016-09-07；修改稿日期：2016-12-15。

國家杰出青年科學(xué)基金（21425624）和中國博士后科學(xué)基金面上項目（2015M580052）。

楊坤（1992—），男，碩士研究生。聯(lián)系人：李春，教授，博士生導(dǎo)師。主要從事生物轉(zhuǎn)化與酶工程、代謝工程與合成生物學(xué)、空間微生物技術(shù)的研究。E-mail：lichun@bit.edu.cn。