帶狀皰疹皮損組織中CD8，F(xiàn)oxP3和OX40的表達研究

楊 勵 尚亞洲 王一理 張美芳（通訊作者）

（1.陜西省人民醫(yī)院皮膚科，陜西西安710068；2.西安交通大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，陜西西安710061）

帶狀皰疹皮損組織中CD8，F(xiàn)oxP3和OX40的表達研究

楊 勵1尚亞洲1王一理2張美芳1（通訊作者）

（1.陜西省人民醫(yī)院皮膚科，陜西西安710068；2.西安交通大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，陜西西安710061）

目的探討帶狀皰疹（HZ）皮損組織中CD8、FoxP3和OX40的表達情況和意義，初步探討OX40和CD8+Tregs細(xì)胞在HZ疾病過程中的作用機制。方法應(yīng)用免疫組化法檢測9例HZ患者皮損組織中CD8、FoxP3和OX40的表達情況，并分析其在不同臨床病情HZ患者皮損組織中的表達差異。結(jié)果帶狀皰疹皮損組織中CD8、FoxP3和OX40的陽性表達率與病情有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），但與年齡無關(guān)（P>0.05）。HZ皮損組織中CD8、FoxP3和OX40間呈正相關(guān)（P<0.05）。結(jié)論CD8、FoxP3和OX40可能在HZ的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，共刺激分子OX40可能促進了CD8+Tregs細(xì)胞生成發(fā)揮作用。

帶狀皰疹：協(xié)同刺激分子OX40；CD8+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞

帶狀皰疹（Herpes zoster，HZ）是水痘帶狀皰疹病毒（Varicella-zostervirus，VZV）潛伏在感覺神經(jīng)節(jié)的一次復(fù)發(fā)，本病發(fā)生被認(rèn)為是免疫抑制的后果[1]，特別是在免疫低下的宿主高發(fā)病率和高死亡率。HZ的皮損中不但有壞死的角質(zhì)形成細(xì)胞，還存在大量的免疫細(xì)胞，包括淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等，這些細(xì)胞具有抗病毒活性，因此說HZ局部皮膚受損不單是VZV在細(xì)胞內(nèi)繁殖的直接結(jié)果，還需通過一系列細(xì)胞免疫應(yīng)答造成組織損傷[2]。研究HZ局部皮損，將有可能闡明病毒和免疫細(xì)胞間相互作用的免疫學(xué)機制，HZ患者皮損局部的免疫細(xì)胞及相關(guān)分子的變化可能直接反映機體抗病毒免疫的本質(zhì)。

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Regulatory cells，Tregs）是一群具有免疫抑制功能的T細(xì)胞亞群，能夠抑制自身反應(yīng)性T細(xì)胞的活化和增殖，在病毒感染等狀態(tài)下起重要作用。繼CD4+Tregs后，有學(xué)者又發(fā)現(xiàn)一高表達Foxp3的CD8+的Tregs細(xì)胞，對自身反應(yīng)性T細(xì)胞也有免疫抑制作用[3]。研究表明在病毒感染中CD8+ Tregs細(xì)胞增加，影響機體的抗病毒免疫反應(yīng)。但迄今為止，未見CD8+Tregs細(xì)胞在帶狀皰疹皮損局部的研究報告。FoxP3是決定CD8+Tregs細(xì)胞功能的關(guān)鍵基因[4]，CD8+Tregs細(xì)胞的免疫抑制作用也受各種因子和受體的多種機制的調(diào)節(jié)，其中近年來研究發(fā)現(xiàn)的共刺激分子OX40/OX40L，是啟動特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答所必需的信號[5]。本研究探討CD8、FoxP3和OX40在HZ局部皮損中的表達及相互關(guān)系，探討其在HZ發(fā)病機制中的作用和臨床意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象：選取2012年至2013年在陜西省人民醫(yī)院皮膚科就診的9例帶狀皰疹患者，所有患者均為首次發(fā)病，患者最小年齡21歲，最大年齡76歲，中位年齡62歲。收集局部皮損9例。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者知情同意。組織標(biāo)本經(jīng)10%中性多聚甲醛固定，石蠟包埋備用。

1.2 試劑：鼠抗人CD8（IgG1）單克隆抗體（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司）；鼠抗人FoxP3（IgG1）單克隆抗體（英國Abcam Laboratories Ltd）；鼠抗人OX40（IgG2a）單克隆抗體（英國Novocastra Laboratories Ltd）；EnVision試劑盒（丹麥Dako公司）。

1.3 實驗方法：采用免疫組織化學(xué)EnVision二步法單染色法，5 μm連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟，0.01 mol/L檸檬酸或0.001 mol/L乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）緩沖液高溫高壓進行抗原修復(fù)，一抗?jié)舛确謩e為OX40（1：20）、FoxP3（1：30）、CD8（1：80），單染法采用辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗與一抗結(jié)合，DAB顯色液顯色，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水至二甲苯，中性樹膠封片。免疫組化檢測結(jié)果判定：OX40陽性標(biāo)記產(chǎn)物呈棕黃色顆粒定位于細(xì)胞膜，F(xiàn)oxP3標(biāo)記陽性產(chǎn)物呈藍(lán)黑色顆粒定位于細(xì)胞核，CD8標(biāo)記陽性產(chǎn)物呈棕黃色顆粒定位于細(xì)胞膜。每張切片計數(shù)以400×高倍鏡下隨機選擇5個不重復(fù)視野，計數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)，并求得平均值進行統(tǒng)計分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理：應(yīng)用SPSS18.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。不同年齡、不同病情的帶狀皰疹患者皮膚組織中3種分子陽性表達率的比較采用χ2檢驗，皮損組織中各分子間相關(guān)分析用Spearman檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 帶狀皰疹患者病情評分標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)文獻[6]對帶狀皰疹患者的病情進行評分，總分<6分為輕度，6～12分為中度，>12分為重度。

2.2 不同臨床病情HZ患者皮損組織中3種分子的表達：在不同病情的HZ患者組織中均可見CD8、FoxP3和OX40的表達，它們在組織中數(shù)量與病情輕重有相關(guān)性（χ2=7.059，6.468，6.664，P值分別為0.029、0.039和0.036），詳見圖1，而它們在組織中的表達與年齡（<60歲和>60歲）無相關(guān)性（χ2= 0.824，0.281，0.610，P值分別為0.364，0.596，0.435）。

圖1 不同臨床分型的HZ患者皮損組織中CD8、FoxP3、OX40的表達

2.3 帶狀皰疹皮損組織中CD8、FoxP3、OX40表達的關(guān)聯(lián)性分析：皮損組織中3個分子間均呈正相關(guān)（r=0.002，0.926，0.735，P值分別為0.002，<0.001和0.024）。

3 討論

目前，多數(shù)學(xué)者傾向認(rèn)為HZ的發(fā)生與機體對VZV的特異免疫功能調(diào)節(jié)紊亂有關(guān)，而前期研究發(fā)現(xiàn)，HZ患者外周血T細(xì)胞亞群失衡，CD4+T/CD8+T細(xì)胞比值下降，導(dǎo)致細(xì)胞免疫功能抑制[7]。CD8+Tregs細(xì)胞是已確定存在的具有免疫調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞，F(xiàn)oxP3是其在發(fā)育和功能上必需的分子，在細(xì)胞介導(dǎo)的免疫抑制效應(yīng)中起關(guān)鍵作用。在皰疹病毒感染研究中發(fā)現(xiàn)，CD8+Tregs細(xì)胞數(shù)增加，本研究也證實在VZV感染的帶狀皰疹局部皮損中CD8+Tregs細(xì)胞數(shù)也增加，特別是隨著皮損程度的加重，增加的更為明顯，提示CD8+Tregs細(xì)胞的改變是因需在局部發(fā)揮抗病毒免疫抑制作用所致。同時研究也發(fā)現(xiàn)，隨著年齡增加，CD8+Tregs細(xì)胞也逐漸增高[8]，HZ局部CD8+Tregs細(xì)胞增加，促進局部免疫抑制的作用，有利于病毒逃脫機體的抗病毒免疫反應(yīng)，這表明CD8+Tregs細(xì)胞在HZ發(fā)生、發(fā)展的免疫過程中有重要的意義。

本研究也對9例帶狀皰疹患者局部皮損進行了檢測，結(jié)果顯示，HZ患者皮損中存在OX40的改變，隨著皮損嚴(yán)重性增加，OX40的表達也增加，提示皮損中OX40細(xì)胞在疾病的發(fā)生發(fā)展和病情的持續(xù)中均發(fā)揮作用，也提示OX40表達可能與HZ嚴(yán)重程度有一定關(guān)系，說明OX40表達與臨床絕對評分之間存在一定對應(yīng)關(guān)系。

皮膚作為抵御感染的主要屏障，皮膚的免疫作用也逐漸引起研究者的重視，在HZ發(fā)生發(fā)展的過程中，VZV損傷皮膚局部，這與皮膚局部免疫應(yīng)答低下等多種因素有關(guān)，研究皮損局部比外周血免疫狀態(tài)可能更準(zhǔn)確地反映皮膚的免疫應(yīng)答能力。但在診療過程中取材受限制，本研究收集的樣本數(shù)少。然而，輕中重不同病情的患者皮損局部的免疫分子變化具有臨床意義，因此，今后需要加大樣本量，進行更深一步的研究，同時還需考慮病情發(fā)展過程中各免疫分子的變化，以及和全身抗病毒免疫反應(yīng)狀況的對比。

［1］Kim JW，Min CK，Mun YC，et al.Varicella-zoster virusspecific cell-mediated immunity and herpes zoster development in multiple myeloma patients receiving bortezomib-or thalidomide-based chemotherapy［J］.J Clin Virol，2015，73（2）：64-69.

［2］Imoto K，Okazaki A，Onishi F，et al.VZV skin-test reaction，but not antibody，is an important predictive factor for postherpetic neuralgia［J］.J Dermatol Sci，2015，79（3）：235-240.

［3］李雅舒，王莉，陳曉玲.CD8+CD28-調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的生物學(xué)特性及其與疾病的相關(guān)性研究進展［J］.免疫學(xué)雜志，2012，8（28）：722-725

［4］Singh RP，La Cava A，Wong M，et al.CD8+T cell-mediated suppression of autoimmunity in a murine lupus model of peptide-induced immune tolerance depends on Foxp3 expression［J］.J Immunol，2007，178（12）：7649-7657.

［5］盧凱，陳明.OX40/OX40L與T細(xì)胞［J］.東南大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2012，31（3）：355-358.

［6］泛昔洛韋治療帶狀皰疹臨床觀察組.泛昔洛韋與阿昔洛韋治療帶狀皰疹的多中心隨機雙盲對照研究［J］.中華皮膚科雜志，2000，33（5）：370-371.

［7］張美芳，楊勵，馬學(xué)良，等.帶狀皰疹患者T細(xì)胞亞群及相關(guān)細(xì)胞因子的檢測［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)雜志，2009，8（3）：133-135.

［8］Weng NP，Akbar AN，Goronzy J.CD28（-）T cells：their role in the age-associated decline of immune function［J］.Trends Immunol，2009，30（7）：306-312.

Expressions of CD8，F(xiàn)oxP3 and OX40 in Herpes Zoster Skin Lesion

Yang Li1Shang Yazhou1Wang Yili2Zhang Meifang1
（1.Department of Dermatology，Shaanxi Provincial People’s Hospital，Xi’an 710068，China；2.The Key Laboratory of Biomedical Information Engineering of Ministry of Education，Institute for Cancer Research，School of Life Sciences&Technology，Xi’an Jiaotong University，Xi′an 710061，China）

ObjectiveTo study the expressions of CD8、FoxP3 and OX40 in in herpes zoster（HZ）skin tissue，and then to explore the pathogenesis of OX40 and CD8+Tregs in H．MethodsThe expressions of CD8、FoxP3 and OX40 were detected by immunohistochemistry in 9 cases HZ.ResultsThe expressions of CD8、FoxP3 and OX40 in HZ tissue were significantly associated with state of disease.No correlation were found among the expressions of CD8、FoxP3 and OX40 in different age groups.OX40 expression was positively associated with CD8 and FoxP3 expression in HZ.ConclusionCD8，F(xiàn)oxP3 and OX40 molecule may play a role in the HZ.Further more，OX40 might stimulate the expression of CD8+Tregs and contribute to the development of HZ.

Erpes zoster；Co-stimulatory molecule OX40；CD8+regulatory T cells

R752

A學(xué)科分類代碼：32047

1001-8131（2017）01-0019-02

2016-09-05