在線固相萃取-HPLC測(cè)定三七消痔栓中的三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1的含量測(cè)定

許輝，劉軍，代鵬程，李紅兵

（中國(guó)人民解放軍第291醫(yī)院，內(nèi)蒙古 包頭 014040）

在線固相萃取-HPLC測(cè)定三七消痔栓中的三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1的含量測(cè)定

許輝，劉軍，代鵬程，李紅兵

（中國(guó)人民解放軍第291醫(yī)院，內(nèi)蒙古 包頭 014040）

目的：建立三七消痔栓中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1含量測(cè)定的方法。方法：運(yùn)用在線固相萃取-HPLC測(cè)定三七消痔栓中的三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1的含量。結(jié)果：含量測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，方法簡(jiǎn)便，專屬性強(qiáng)；三七皂苷R1（C47H80O18）、人參皂苷Rg1（C42H72O14）和人參皂苷Rb1（C54H92O23）的平均回收率分別為97.21%（RSD＝1.75%，n＝6），99.26%（RSD＝1.80%，n＝6），100.48%（RSD＝1.37%，n＝6）。三七皂苷R1、參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1分別在2.794～27.94 μg/mL，8.125～81.25 μg/mL和8.088～80.88 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。結(jié)論：本方法可有效控制三七消痔栓中三七的質(zhì)量。

三七消痔栓；在線固相萃??；高效液相色譜法;含量測(cè)定

三七消痔栓是我院臨床應(yīng)用40多年的自制劑，由三七、紅花、川芎、冰片等藥材組成。功能活血化瘀、止血止痛、消炎殺菌、散斂生肌、行氣升提、潤(rùn)腸通便。用于肛裂、內(nèi)痔、外痔、混合痔、肛瘺等肛門(mén)疾患和術(shù)后出血疼痛。三七是方中主藥，因此選定人參皂苷Rg1（C42H72O14）、人參皂苷Rb1（C54H92O23）和三七皂苷R1（C47H80O18）的總量計(jì)不得少于5%為該制劑的含量測(cè)定項(xiàng)目，以制定該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器與試藥

儀器：UltiMate 3000高效液相色譜儀（Thermo Fisher），包括UltiMate 3000 RS雙三元泵，UltiMate 3000 RS二極管陣列檢測(cè)器，UltiMate 3000 RS自動(dòng)進(jìn)樣器，UltiMate 3000 RS柱溫箱，變色龍7色譜工作站。

分析柱：Thermo ODS HYPERSIL 250mm×4.6mm，5μm。

固相萃取柱：SHIMADZU Shim-pack GVP-ODS 10mm×4.6mm，5μm。

濾膜0.45 μm,Φ13 mm（上海興亞凈化材料廠）三七陰性樣品自制。

中藥飲片經(jīng)鑒定均符合《中華人民共和國(guó)藥典》（2015年版）一部規(guī)定[1]。

人參皂苷Rg1對(duì)照品（C42H72O14）（批號(hào)：110703-200726）、人參皂苷Rb1對(duì)照品（C54H92O23）（批號(hào)：110704-200318）和三七皂苷R1對(duì)照品（C47H80O18）（批號(hào)：110745-200516）均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供；三七消痔栓委托加工自制制劑；乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純。

2 含量測(cè)定

2.1 在線固相萃取流程連接色譜條件

流路連接：

進(jìn)樣泵（左泵）→進(jìn)樣器→六通閥接口1；

分析泵（右泵）→六通閥接口3；

六通閥接口2→固相萃取柱→六通閥接口5；;

六通閥接口4→分析柱→紫外檢測(cè)器；

六通閥接口6→廢液。

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（250 mm× 4.6 mm，5 μm，10 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈為流動(dòng)相A，水為流動(dòng)相B，按下述方法進(jìn)行在線固相萃取分析；檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm。理論板數(shù)按人參皂苷Rg1峰計(jì)算應(yīng)不低于23 000。流速：1 mL/min；柱溫：30℃。梯度淋洗條件見(jiàn)表1。

表1 梯度淋洗條件

2.2 對(duì)照品溶液的制備

取人參皂苷Rg1對(duì)照品、人參皂苷Rb1對(duì)照品和三七皂苷R1對(duì)照品適量，精密稱定，加50%乙醇水制成每1 mL含人參皂苷Rg124 μg、人參皂苷Rb124 μg和三七皂苷R16 μg的混合溶液，備用。

2.3 供試品溶液的制備

取本品兩粒，精密稱定，置100 mL標(biāo)準(zhǔn)磨口燒瓶中，精密加入50 mL 50%乙醇水，稱定質(zhì)量，加熱回流2 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%乙醇水補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.4 測(cè)定法

分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定[2]。

2.5 系統(tǒng)適用性

按樣品工藝制備缺三七的陰性對(duì)照品，按供試品溶液的制備項(xiàng)下操作，結(jié)果高效液相色譜（HPLC）圖譜在與人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和三七皂苷R1相應(yīng)的位置上沒(méi)有吸收峰，表明其他成分對(duì)測(cè)定無(wú)干擾，見(jiàn)圖1。

2.6 重現(xiàn)性與穩(wěn)定性試驗(yàn)

按正文方法平行制備6份供試品溶液，每份進(jìn)樣兩次。取平均值計(jì)算各被測(cè)物相對(duì)含量，RSD均小于2%。取其中1份供試品溶液于0，1，2，5，7，44 h測(cè)定，結(jié)果44 h峰面積基本不變，人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和三七皂苷R1的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為0.96%，1.06%和1.90%。見(jiàn)表2～5。

圖1 成分含量測(cè)定HPLC色譜圖

表2 三七皂苷R1的重現(xiàn)性試驗(yàn)

表3 人參皂苷Rg1的重現(xiàn)性試驗(yàn)

表4 人參皂苷Rb1的重現(xiàn)性試驗(yàn)

表5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.7 精密度試驗(yàn)

按“2.3”方法制備供試品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，以各被測(cè)物峰面積計(jì)算，RSD均小于2%。見(jiàn)表6～7。

2.8 線性關(guān)系的考察

配制適當(dāng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別進(jìn)樣2，4，8，12，16，20 μL，以對(duì)應(yīng)濃度及峰面積計(jì)算線性回歸曲線。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），被測(cè)組分濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)（X），進(jìn)行線性回歸，分別得到三七皂苷R1、參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1的回歸方程：

Y＝0.0546X－0.0035（r2＝0.9998），

Y＝0.0714X－0.0003（r2＝1），

Y＝0.042X＋0.0048（r2＝0.9998）；

分別在2.794～27.94 μg/mL，8.125～81.25 μg/mL和8.088～80.88 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。見(jiàn)圖2～4。

表6 精密度試驗(yàn)

表7 對(duì)照品試驗(yàn)

圖2 三七皂苷R1線性回歸曲線

圖3 人參皂苷Rg1線性回歸曲線

圖4 人參皂苷Rb1線性回歸曲線

2.9 回收率試驗(yàn)

精密稱取消痔栓1粒，分別加入對(duì)應(yīng)含量80%，100%，120%的標(biāo)準(zhǔn)品，按“2.3”方法加入100 mL標(biāo)準(zhǔn)磨口燒瓶中制備供試品溶液，測(cè)定峰面積，計(jì)算回收率。三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1平均回收率分別為97.21%，RSD＝1.75%；99.26%，RSD＝1.80%；100.48%，RSD＝1.37%。見(jiàn)表8。

表8 回收率試驗(yàn)

2.10 樣品測(cè)定

表9 3批產(chǎn)品含量測(cè)定

按《中華人民共和國(guó)藥典》（2015年版）三七含量測(cè)定項(xiàng)下規(guī)定總皂苷含量不低于5%，折算本制劑每粒含量總皂苷應(yīng)不低于1.2 mg/粒。3批產(chǎn)品均高于上述值，故采用《中華人民共和國(guó)藥典》（2015年版）規(guī)定折算值1.2 mg/粒。

3 討論

3.1液相分析中，為消除基質(zhì)干擾，考察了30%，50%，70%乙醇水作為提取溶劑，50%乙醇水提取效果最好，甘油脂殘留較小。

3.2因三七在制劑中含量較低僅為千分之九，參照《中華人民共和國(guó)藥典》（2015年版）液相色譜方法檢測(cè)，人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1和三七皂苷R1三成分出峰時(shí)間長(zhǎng)，峰小，信噪比不足，無(wú)法滿足質(zhì)量控制分析要求，故采用在線固相萃取富集凈化后分析。不但大幅提高了信噪比，還使得分析時(shí)間比《中華人民共和國(guó)藥典》（2015年版）方法縮短一半，不到30分鐘。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（2015年版）一部[S].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2015:11-12.

[2] 張巖,馬曉斐,呂品,等.在線二維柱切換高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定牙膏中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Re和Rb1[J].分析化學(xué),2014,42(12):1833-1837.

本文編輯：蘇日力嘎

Determination of Notoginsenoside R1, Ginsenoside Rg1and Ginsenoside Rb1Contents in Sanqixiaozhishuan by Online Solid Phase Extraction-HPLC

Xu Hui, Liu Jun, Dai Peng-cheng, Li Hong-bing
( The No. 291 Hospital of PLA, Inner Mongolia Baotou 014040, China )

Objective：To establish a method for determination of the contents of notoginsenoside R1, ginsenoside Rg1and ginsenoside Rb1in sanqixiaozhishuan.Methods：The contents of notoginsenoside R1, ginsenoside Rg1and ginsenoside Rb1in sanqixiaozhishuan was determined by online solid phase extraction-HPLC.Results：The developed method was accurate, simple and specif c. The average recovery rates of notoginsenoside R1, ginsenoside Rg1and ginsenoside Rb1in sanqixiaozhishuan were 97.21% (RSD＝1.75%, n＝6), 99.26% (RSD＝1. 80%, n＝6) and 100. 48% (RSD＝1. 37%, n＝6), while the linear ranges were 2.794～27.94, 8.125～81.25 and 8.088～80.88 μg/mL, respectively. Conclusions：The method may be used for effective control of the quality of pseudo-ginseng in sanqixiaozhishuan.

Sanqixiaozhishuan; Online Solid Phase Extraction; High Performance Liquid Chromatography (HPLC);Content Determination

R927.2

A

10.3969/j.issn.2096-3327.2017.02.005

2016 - 10 - 09

許輝，男，主管藥師。研究方向：藥劑學(xué)。通訊作者E-mail：18604714500@163.com