111株耐甲氧西林金黃色葡萄球菌MLST基因分型研究

劉德華，胡大春，保靜菲，古文鵬，姚為群

（1．昆明醫(yī)科大學(xué)附屬甘美醫(yī)院檢驗(yàn)科，云南省昆明市臨床疾病分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650011；2．云南省疾病預(yù)防控制中心，云南 昆明 650211；3．昆明醫(yī)科大學(xué)附屬甘美醫(yī)院感染科，云南 昆明 650011）

111株耐甲氧西林金黃色葡萄球菌MLST基因分型研究

劉德華1，胡大春1，保靜菲1，古文鵬2，姚為群3

（1．昆明醫(yī)科大學(xué)附屬甘美醫(yī)院檢驗(yàn)科，云南省昆明市臨床疾病分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650011；2．云南省疾病預(yù)防控制中心，云南 昆明 650211；3．昆明醫(yī)科大學(xué)附屬甘美醫(yī)院感染科，云南 昆明 650011）

目的：回顧性調(diào)查昆明醫(yī)科大學(xué)附屬甘美醫(yī)院2010年10月 - 2013年12月分離的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）菌株的多位點(diǎn)序列分型（MLST）基因分型狀況及流行趨勢(shì)，為防控MRSA暴發(fā)提供數(shù)據(jù)資料。方法：收集昆明醫(yī)科大學(xué)附屬甘美醫(yī)院2010年10月 - 2013年12月連續(xù)分離的非重復(fù)MRSA 111株，通過MLST分析獲得7個(gè)管家基因的等位基因譜，提交至MLST網(wǎng)站確定序列型（ST），進(jìn)一步結(jié)合病歷資料獲取科別及時(shí)間段的集中流行趨勢(shì)。結(jié)果：111株MRSA經(jīng)MLST分析得到11個(gè) ST序列型，發(fā)現(xiàn)其中104株細(xì)菌集中在ST239、ST5、ST7和ST15型別，尤其是ST239和ST5型。ST239共有43株，且86.05%（37/43）集中于2010年10月 - 2011年2月，主要出現(xiàn)在呼吸科、神經(jīng)外科、ICU和乳腺科4個(gè)科室；ST5共有42株，且80.95%（34/43）集中于2013年7 - 10月，主要出現(xiàn)在呼吸科、神經(jīng)外科、ICU、干療科和乳腺科5個(gè)科室；ST7為11株；ST15為8株；ST641、ST6、ST9、ST59、ST965、ST88、ST217各1株。結(jié)論：昆明醫(yī)科大學(xué)附屬甘美醫(yī)院MRSA的ST型別多樣化，但主要流行克隆系為ST239和ST5，ST7、ST15、ST464、ST6、ST9、ST59、ST965、ST88、ST217等克隆系也有分布。

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌；多位點(diǎn)序列分型；基因分型；流行趨勢(shì)

MRSA是世界范圍內(nèi)引起醫(yī)院內(nèi)感染的重要病原菌[1]，且具有多重耐藥性，又易引起感染的暴發(fā)和流行。本文茲對(duì)昆明醫(yī)科大學(xué)附屬甘美醫(yī)院近年來收集的111株MRSA進(jìn)行MLST流行病學(xué)調(diào)查，以了解MRSA的分子特征及醫(yī)院內(nèi)感染的暴發(fā)，從而為今后控制MRSA的感染以及暴發(fā)提供有力依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株收集2010年10月 - 2013年12月昆明醫(yī)科大學(xué)附屬甘美醫(yī)院臨床標(biāo)本中分離的MRSA共111株，所有菌株均為同一時(shí)間內(nèi)連續(xù)分離的非重復(fù)株，同一患者只取第一次分離株。分離鑒定后的菌株于-40℃冰箱保存。111株MRSA中67株來源于深部痰液及肺泡灌洗液，占60.36%；分泌物（包括創(chuàng)面分泌物、膿液、穿刺液等）28株，占25.23%；導(dǎo)管尖端5株，占4.5%；胸腹水4株，占3.6%；尿液3株，占2.7%；血液3株，占2.7%；腦脊液1株，占0.9%。MRSA主要分離自呼吸內(nèi)科、ICU、神經(jīng)外科、乳腺科、干療科及其他科室。呼吸內(nèi)科和ICU MRSA共計(jì)50株，占總分離株的45.05%。質(zhì)控菌株：耐甲氧西林金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC43300，由衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心贈(zèng)送。

1.1.2 主要儀器低溫超速離心機(jī)（Heraeus公司），PCR擴(kuò)增儀（MyCyclery，Bio-Rad公司），電泳儀（Power PAC 3000，Bio-rad公司），凝膠成像分析系統(tǒng)（Gel Doc 2000 TM，Bio-rad公司）。

1.1.3 試劑Lysostaphin（SD9001）（TaKaRa，日本）；TaqDNA聚合酶、MgCl2及dNTP（Promega，美國(guó)，TaKaRa，日本）。PCR引物合成及MLST產(chǎn)物測(cè)序由上海生物工程有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 總DNA提取取血平板上分純后新鮮過夜6～8個(gè)單個(gè)菌落，混懸于0.3 mL含有50 U/mL Lysostaphin的TE中（pH＝8.0），35℃水浴30 min，95℃煮沸10 min，15 000 rpm離心20 sec后取上清即為細(xì)菌總DNA溶液，測(cè)OD值檢測(cè)DNA含量。

1.2.2 MLST分型反應(yīng)體系為50 μL。7個(gè)管家基因（arcc，aroe，glp，gmk，pta，tpi，yqil）PCR所用的引物參照文獻(xiàn)[2]，引物arcc up-5’ TTG ATT CAC CAG CGC GTA TTG TC-3’,arcc dn-5’ AGG TAT CTG CTT CAA TCA GCG-3’; aroe up-5’ ATC GGA AAT CCT ATT TCA CAT TC-3’,aroe dn-5’ GGT GTT GTA TTA ATA ACG ATA TC-3’; glp up-5’ CTA GGA ACT GCA ATC TTA ATC C-3’,glp dn-5’ TGG TAA AAT CGC ATG TCC AAT TC-3’; gmk up-5’ ATC GTT TTA TCG GGA CCA TC-3’,gmk dn-5’ TCA TTA ACT ACA ACG TAA TCG TA-3’; pta up-5’ GTT AAA ATC GTA TTA CCT GAA GG-3’,pta dn-5’ GAC CCT TTT GTT GAA AAG CTT AA-3’; tpi up-5’ TCG TTC ATT CTG AAC GTC GTG AA-3’,tpi dn-5’ TTT GCA CCT TCT AAC AAT TGT AC-3’; yqil up-5’ CAG CAT ACA GGA CAC CTA TTG GC-3’,yqil dn-5’ CGT TGA GGA ATC GAT ACT GGA AC-3’。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，然后94℃變性30 sec，55℃退火30 sec，72℃延伸1 min循環(huán)35次，后72℃延伸5 min。片段大小從402～516 bp不等。PCR產(chǎn)物純化后進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.2.3 MLST數(shù)據(jù)處理及分析將上述測(cè)序產(chǎn)物上傳MLST網(wǎng)站（http://www.mlst.net/）的金黃色葡萄球菌數(shù)據(jù)庫(kù)（http://saureus.mlst.net/）中的Locus Query下的Single locus進(jìn)行7個(gè)等位基因數(shù)據(jù)的分析，得出7個(gè)等位基因號(hào)；通過數(shù)據(jù)庫(kù)中Prof le Query下的Allelic對(duì)7個(gè)等位基因號(hào)進(jìn)行分析，得到每株菌的ST型別。

1.2.4 對(duì)相同ST型別結(jié)合病歷資料獲取分布科別及時(shí)間段的集中流行趨勢(shì)。

2 結(jié)果

111株MRSA進(jìn)行MLST檢測(cè)，其PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果舉例見圖1。

111株MRSA進(jìn)行MLST檢測(cè)，其測(cè)序結(jié)果舉例見圖2。

111株MRSA的MLST共有11種分型，結(jié)果見表1。

根據(jù)MLST結(jié)果及菌株分離的時(shí)間和科別進(jìn)行分析，111株MRSA的流行時(shí)間分布情況見圖3；科別分布情況見圖4。

圖1 MRSA的MLST檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳

圖2 MRSA的MLST測(cè)序

表1 111株MRSA的MLST結(jié)果

圖3 111株MRSA各型別的流行時(shí)間分布

圖4 111株MRSA各型別的科別分布

3 討論

常用的MRSA菌株分子流行病學(xué)分型方法包括脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE）分型、MLST、SCCmec分型和spa分型等。PFGE方法依據(jù)脈沖電泳條帶的差異進(jìn)行分型，雖分辨率高被認(rèn)為是分型的金標(biāo)準(zhǔn)，但其難以將分型結(jié)果數(shù)字化，不利于不同實(shí)驗(yàn)室之間分型結(jié)果的比較[3]。本研究采用的MLST方法是目前MRSA分型的主要方法，分型的結(jié)果都很容易數(shù)字化，方便構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)的開放數(shù)據(jù)庫(kù)網(wǎng)站，有利于不同地區(qū)的分子流行病學(xué)數(shù)據(jù)比較。其技術(shù)在實(shí)驗(yàn)過程的可操作性及實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性之間取得了平衡，同時(shí)該方法簡(jiǎn)便快捷、重復(fù)性強(qiáng)、分辨率高[4-5]。

本研究發(fā)現(xiàn)，其中104株細(xì)菌集中在ST239、ST5、ST7和ST15型別中，尤其是ST239和ST5型。ST239克隆株在巴西首次被發(fā)現(xiàn)，此后在世界各地廣泛流行[6]，是引起亞洲院內(nèi)感染的主要克隆株，約90%MRSA的感染是由ST239克隆引起的[7]。從流行病學(xué)角度來看主要和近年報(bào)道的醫(yī)院獲得性流行菌株（HA-MRSA）分型一致。本研究中ST239共有43株，主要出現(xiàn)在呼吸科、神經(jīng)外科、ICU和乳腺科4個(gè)科室；ST5共有42株，主要出現(xiàn)在呼吸科、神經(jīng)外科、ICU、干療科和乳腺科5個(gè)科室。而近年來國(guó)內(nèi)報(bào)道的MRSA流行也多以HA-MRSA為主，國(guó)內(nèi)多家醫(yī)院收集菌株的流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)以ST239和ST5代表的HA-MRSA在院內(nèi)廣泛流行[8]。王艷海等[9]報(bào)道的鄂爾多斯地區(qū)蒙古族人群耐甲氧西林金黃色葡萄球菌MLST基因分型結(jié)果也一致；據(jù)朱佩瓊等[10]報(bào)道浙江省內(nèi)流行最廣的主要有ST239、ST5和ST59型，同時(shí)這些克隆型的耐藥性也普遍較高；楊永剛等[11]報(bào)道杭州地區(qū)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌MLST檢測(cè)共發(fā)現(xiàn)9個(gè)ST型（以ST5為主，占59.3%；其次為ST239，占16.3%）；熊祝嘉等[12]調(diào)查中國(guó)7所教學(xué)醫(yī)院MRSA的流行和耐藥情況中，ST5型克隆的檢出率高達(dá)24.6%，僅次于ST239克隆的74.6%，已成為中國(guó)大陸以及其他亞洲地區(qū)第2位主要的MRSA流行克隆型，需引起高度重視。

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本文編輯：張鈺

Multilocus Sequence Typing of 111 Methicillin-resistant Staphylococcus aureus Strains

Liu De-hua1, Hu Da-chun1, Bao Jing-fei1, Gu Wen-peng2, Yao Wei-qun3
(1. Department of Laboratory Medicine, Calmette Hospital Aff liated to Kunming Medical University, Key Laboratory of Clinical molecular Biology of Kunming City, Yunnan Province, Yunnan Kunming 650011, China; 2. Yunnan Centre for Disease Control, Yunnan Kunming 650211, China; 3. Department of Infection, CalmetteHospital Aff liated to Kunming Medical University, Yunnan Kunming 650011,China)

Objective：To investigate the sultilocus sequence typing (MLST) and epidemic trend of methicillin-resistant staphylococcus aureus (MRSA) strains isolated in Calmette Hospital Affiliated to Kunming Medical University from October 2010 to December 2013 retrospectively, and provide a basis for the prevention and control of MRSA outbreak.Methods：A total of 111 non-repetitive methicillin-resistant Staphylococcus aureus strains were collected from October 2010 to December 2013 in the Calmette Hospital Aff liated to Kunming Medical University, from which seven housekeeping genes alleles were obtained by MLST and submitted to MLST webstite to determine the sequence type (ST), and the result was used for prediction of epidemic trend in combination with clinical data acquisition.Results：A total of 11 ST series were obtained from the 111 strains of MRSA by MLST. A portion of 104 strains belonged to ST239, ST5, ST7 and ST15, especially ST239 and ST5. Forty-three strains belonged to ST239, of which 37 (86. 05%) were found from October 2010 to February 2011, mainly in the department of respiratory diseases, department of neurosurgery, ICU and department of breast diseases. Forty-two strains belonged to ST5, of which 34 (80.95%) were found from July 2013 to October 2013, mainly in the departmentof respiratory diseases, department of neurosurgery, ICU, geriatrics and department of breast diseases. In addition, 11 strains belong to ST7, 8 to ST15 8, and one to each of ST641, ST6, ST9, ST59, ST965, ST88 and ST217.Conclusion：The ST of MRSA strains in Calmette Hospital showed diversity, of which the mainly popular clones were ST239 and ST5, and the distributions of ST7, ST15, ST464, ST6, ST9, ST59, ST965, ST88 and ST217 clones were also found.

Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA); Multilocus Sequence Typing (MLST); Genotyping; Epidemic Trends

R446.5

A

10.3969/j.issn.2096-3327.2017.02.002

2016 - 07 - 30

云南省教育廳科學(xué)研究基金項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：2015Y161）；云南省教育廳科學(xué)研究基金項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：2010C097）；昆明市衛(wèi)生科技人才培養(yǎng)項(xiàng)目暨“十百千”工程培養(yǎng)計(jì)劃[項(xiàng)目編號(hào)：SW（帶）-09]

劉德華，男，碩士，講師。研究方向：細(xì)菌耐藥機(jī)制及流行病學(xué)。通訊作者E-mail：liudehua12340244@sina.com.cn