橡膠樹(shù)半胱氨酸蛋白酶抑制劑HbCYS2的克隆與表達(dá)分析

龍翔宇 梁?jiǎn)⒏?戚繼艷 方永軍 唐朝榮

（中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所，儋州 571737）

橡膠樹(shù)半胱氨酸蛋白酶抑制劑HbCYS2的克隆與表達(dá)分析

龍翔宇 梁?jiǎn)⒏?戚繼艷 方永軍 唐朝榮

（中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所，儋州 571737）

半胱氨酸蛋白酶抑制劑（Cystatin，CYS）廣泛參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控、生物與非生物脅迫應(yīng)答過(guò)程。從橡膠樹(shù)中獲得1個(gè)CYS基因，ORF長(zhǎng)度為687 bp，編碼1個(gè)由228個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白，生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)該蛋白含有2個(gè)CYS結(jié)構(gòu)域，以及1個(gè)含有30個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽，為分泌蛋白，推測(cè)屬于植物CYS II型，命名為HbCYS2（GenBank：KX161925）。表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)HbCYS2在膠乳中高表達(dá)，并且受割膠和產(chǎn)量調(diào)節(jié)劑ET調(diào)控；在葉片組織中，HbCYS2對(duì)多主棒孢侵染表現(xiàn)出明顯應(yīng)答。由此推測(cè)，膠乳中HbCYS2在橡膠樹(shù)膠乳再生、以及割膠傷害應(yīng)答中發(fā)揮一定的調(diào)控作用，葉片中HbCYS2參與橡膠樹(shù)棒孢落葉病的防御或抵抗。

橡膠樹(shù)；半胱氨酸蛋白酶抑制劑；膠乳再生；脅迫應(yīng)答

半胱氨酸蛋白酶抑制劑（Cystatin，CYS），是一類可逆抑制半胱氨酸蛋白酶的超家族蛋白，廣泛存在于動(dòng)植物體內(nèi)，其主要功能是與蛋白酶相互制約控制生物體內(nèi)的多種生理過(guò)程，防止體內(nèi)功能蛋白被外源蛋白酶降解［1，2］。半胱氨酸蛋白酶抑制劑超家族根據(jù)氨基酸序列可分三大家族（Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ），其分泌模式、糖基化、磷酸化、結(jié)構(gòu)域、分子量等存在明顯差異，但所有半胱氨酸蛋白酶抑制劑都具有QxVxG的基序，這一基序通常位于蛋白序列的中心區(qū)域［3-5］。

研究表明，植物半胱氨酸蛋白酶抑制劑在抗蟲(chóng)方面起重要作用，昆蟲(chóng)攝食抑制劑后，消化道蛋白水解酶受到抑制，導(dǎo)致昆蟲(chóng)的非正常發(fā)育或死亡［6-10］。除此之外，植物半胱氨酸蛋白酶抑制劑還參與植物生長(zhǎng)發(fā)育，如種子萌發(fā)、幼苗生長(zhǎng)、果實(shí)成熟以及細(xì)胞程序性死亡等［11-14］，并在提高植物生物與非生物脅迫抗性方面均發(fā)揮重要作用［15-17］。目前，已從多種植物中克隆獲得半胱氨酸蛋白酶抑制劑，如擬南芥［6］、水稻［18］、棉花［19］、大豆［20］、煙草［21］和荔枝［22］等，然而在橡膠樹(shù)中對(duì)其研究相對(duì)較少。本研究根據(jù)已建立的橡膠樹(shù)轉(zhuǎn)錄組及基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得橡膠樹(shù)半胱氨酸蛋白酶抑制劑cDNA全序列，對(duì)基因結(jié)構(gòu)及蛋白理化性質(zhì)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并運(yùn)用Q-PCR分析該基因的表達(dá)模式，以期為橡膠樹(shù)半胱氨酸蛋白酶抑制劑基因功能的研究提供理論依據(jù)及參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑 在本研究中，多主棒孢霉菌侵染實(shí)驗(yàn)所用材料為熱研7-33-97組培苗，其他處理實(shí)驗(yàn)所用材料為熱研7-33-97成齡大樹(shù)；中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所為本研究提供多主棒孢菌HccYN57菌種。E.coli JM109菌株由橡膠所膠乳代謝課題組保存。

克隆載體、普通PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑，DNA凝膠回收試劑盒，以及限制性內(nèi)切酶與連接酶、反轉(zhuǎn)錄試劑分別購(gòu)自于大連寶生物公司，愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)（杭州）有限公司（AxyGen）及Fermentas公司；英駿生物技術(shù)有限公司（Introvigen）完成各類引物合成及克隆測(cè)序；其它生化試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.1.2 材料處理 橡膠樹(shù)不同處理（割膠、傷害及激素），以及不同組織（葉片、雄花、雌花、樹(shù)皮、種子、芽及膠乳）的采集均按照文獻(xiàn)［23-26］進(jìn)行；多主棒孢菌HccYN57侵染參照梁?jiǎn)⒏５龋?7］的方法進(jìn)行。

1.2 方法

1.2.1 HbCYS2基因的分離克隆 橡膠樹(shù)組織總RNA及DNA的提取參照文獻(xiàn)［26，28，29］。采用Fementas公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成橡膠樹(shù)cDNA第一鏈，操作步驟按照公司說(shuō)明書(shū)進(jìn)行?；蚩寺∷靡镆?jiàn)表1。

表1 基因克隆和表達(dá)分析所用引物

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量分析 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析不同組織，以及割膠、傷害、激素、多主棒孢菌等處理下的HbCYS2表達(dá)模式，為了提高表達(dá)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，采用3種不同的內(nèi)參基因RH2b（DEAD/DEAH box helicase，RH2b）、RH8（DEAD/ DEAH box helicase，RH8） 及YLS8（mitosis protein YLS8）對(duì)樣品進(jìn)行均一化處理，目的基因及內(nèi)參基因的熒光定量引物見(jiàn)表1。熒光定量PCR采用羅氏公司LightCycler 2.0系統(tǒng)，采用系統(tǒng)自帶軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及分析。

1.2.3 HbCYS2生物信息學(xué)分析 HbCYS2基因序列分析和比對(duì)采用ProtParam tool和DNAMAN5.22軟件；利用NCBI蛋白保守?cái)?shù)據(jù)庫(kù)（conserved domain database，CDD）分析保守結(jié)構(gòu)域；采用在線軟件（Http://web.expasy.org/protparam/）分析氨基酸成分、蛋白分子量、等電點(diǎn)；采用在線軟件（Http://ipsort. hgc.jp/和Http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/） 進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)和亞細(xì)胞定位；采用在線軟件（Http:// www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）進(jìn)行蛋白質(zhì)跨膜區(qū)預(yù)測(cè)；基因結(jié)構(gòu)分析采用網(wǎng)址Http://gsds.cbi.pku. edu.cn/。

2 結(jié)果

2.1 HbCYS2基因克隆與序列分析

在前期橡膠樹(shù)膠乳再生的研究中篩選到一個(gè)差異蛋白點(diǎn)，根據(jù)質(zhì)譜后的氨基酸序列，搜索橡膠樹(shù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，拼接獲得1條1 000 bp的核苷酸序列。以橡膠樹(shù)cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序，最終獲得1條核苷酸序列949 bp，使用ORF Finder軟件分析結(jié)果顯示，該序列含有長(zhǎng)度為687 bp的開(kāi)放閱讀框，以及29 bp的5'端非編碼區(qū)（5' UTR）和233 bp的3'端非編碼區(qū)（3' UTR）；以橡膠樹(shù)DNA為模板，獲得1條5 240 bp的核苷酸序列，經(jīng)GSDS軟件比對(duì)cDNA及DNA序列，結(jié)果（圖1）顯示該基因包含4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子。

圖1 HbCYS2基因結(jié)構(gòu)圖

2.2 HbCYS2生物信息學(xué)分析

HbCYS2基因編碼一個(gè)由228個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白，分子量約為26.15 kD，理論等電點(diǎn)（pI）為8.87；氨基酸組成分析結(jié)果顯示，HbCYS2編碼蛋白富含亮氨酸Leu（10.1%）和賴氨酸Lys（10.1%），色氨酸Trp（1.8%）和半胱氨酸Cys（0.9%）含量較低。

HbCYS2編碼蛋白擁有典型植物半胱氨酸蛋白酶抑制劑的保守N末端，以及由基因復(fù)制而引起的重復(fù)C末端，共2個(gè)CYS結(jié)構(gòu)域：在N端含有3個(gè)保守的氨基酸結(jié)構(gòu)域或活性中心元件，第56-65位F-A-R-F-A-V-Q-E-H-N，第73-77位Q-V-V-A-G，第105-114位Y-E-A-K-V-W-V-K-P-W；在C端保守氨基酸結(jié)構(gòu)域第55-66位D-P-E-V-Q-D-A-A-N-HA-V（圖2）。Blast比對(duì)結(jié)果表明，該蛋白的氨基酸序列與胡楊（Populus euphratica，XP_011041371），蓖麻（Ricinus communis，EEF36180），甜橙（Citrus sinensis，XP_006482025） 和 葡 萄（Vitis vinifera，XP_002283400）半胱氨酸蛋白酶抑制劑序列一致性分別為67.97%、62.45%、61.40%和60.43%，除此之外，該蛋白序列與前期研究的橡膠樹(shù)半胱氨酸蛋白酶抑制劑HbCYS1（Hevea brasiliensis）的一致性為50.41%。表明該蛋白為橡膠樹(shù)半胱氨酸蛋白酶抑制劑家族中的一員，命名為HbCYS2（GenBank： KX161925）。

HbCYS2蛋白N端存在1個(gè)由30個(gè)氨基酸殘基組成的信號(hào)肽，肽段分子量約為3.6 kD，TMHMM軟件預(yù)測(cè)HbCYS2第1-6位氨基酸殘基為胞內(nèi)，7-26位為膜上，而27-288位為胞外，根據(jù)信號(hào)肽類型預(yù)測(cè)HbCYS2蛋白為分泌型蛋白。

2.3 HbCYS2表達(dá)分析

橡膠樹(shù)不同組織表達(dá)分析結(jié)果（圖3）表明，HbCYS2基因在橡膠樹(shù)8種組織（芽、葉、種子、老皮、雌花、幼皮、雄花和膠乳）中均被檢測(cè)到，沒(méi)有呈現(xiàn)組織表達(dá)特異性，在膠乳中的表達(dá)豐度最高，雄花和幼皮次之，芽中表達(dá)量最低。

未開(kāi)割樹(shù)割膠處理，膠乳中HbCYS2基因受割膠調(diào)控明顯，前3刀中HbCYS2基因表達(dá)豐度明顯下將，第3刀降至最低點(diǎn)，第4、5刀中表達(dá)水平略有回升；傷害處理下，膠乳中HbCYS2基因表達(dá)豐度無(wú)明顯變化，24 h處理后表達(dá)量有所下降（圖4）。

在6種植物激素或激素類似物處理下，膠乳中HbCYS2基因受ET、GA及2，4-D刺激后呈先下降再上升的趨勢(shì)，ET及2，4-D處理下3 h表達(dá)豐度最低，GA處理下12 h表達(dá)豐度最低；相反，JA刺激下該基因在前12 h呈上升趨勢(shì)并達(dá)到峰值，隨后在24 h恢復(fù)到初始值；ABA及SA刺激下該基因呈下降趨勢(shì)，均在24 h表達(dá)豐度降至最低（圖5）。

圖2 HbCYS2核苷酸及蛋白序列

圖3 HbCYS2基因在橡膠樹(shù)8種不同組織中的表達(dá)豐度

除此之外，葉片中HbCYS2基因?qū)Χ嘀靼翩呙笻ccYN57侵染應(yīng)答明顯，侵染12 h后表達(dá)量明顯下降，24 h降至最低值，此后隨侵染時(shí)間的增加表達(dá)水平持續(xù)回升（圖6）。

3 討論

巴西橡膠樹(shù)（Hevea brasiliensis）為多年生的熱帶高大喬木，是天然橡膠的主要來(lái)源，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。在生產(chǎn)中，橡膠樹(shù)面臨多種生物與非生物逆境脅迫，如病害、蟲(chóng)害、風(fēng)害、寒害及旱害，直接影響橡膠樹(shù)膠乳產(chǎn)量［30］。植物半胱氨酸蛋白酶抑制劑是重要的組織防御應(yīng)激蛋白，同時(shí)參與植物生長(zhǎng)發(fā)育的相關(guān)調(diào)節(jié)［31］。本研究通過(guò)橡膠樹(shù)轉(zhuǎn)錄組及基因組數(shù)據(jù)庫(kù)分離得到HbCYS2，利用生物信息學(xué)分析其核苷酸序列，推論該蛋白含有228個(gè)氨基酸殘基，分子量約為26.15 kD，含有2個(gè)CYS結(jié)構(gòu)域，在N端存在典型的保守序列基序（F-A-R-F-A-V-Q-EH-N，Q-V-V-A-G，Y-E-A-K-V-W-V-K-P-W），C端典型的保守序列基（D-P-E-V-Q-D-A-A-N-H-A-V），除此之外，該蛋白還具有30個(gè)氨基酸殘基組成的信號(hào)肽，且為分泌蛋白，根據(jù)上述特征推論HbCYS2屬于植物半胱氨酸蛋白酶抑制劑II型。II型半胱氨基酸蛋白酶抑制劑分子量大約23 kD左右，擁有和I型相似的保守N末端以及由基因復(fù)制而引起的重復(fù)C末端，為二結(jié)構(gòu)域（CYS）分泌蛋白，與前期研究的HbCYS1屬于同類型蛋白［32，33］。對(duì)HbCYS1與 HbCYS2序列進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，盡管他們的氨基酸序列一致性不高，但仍可以清晰的辨認(rèn)出N端的3個(gè)保守序列基序，特別是活性中心元件Q-x-V-x-G，進(jìn)一步說(shuō)明這些保守結(jié)構(gòu)域可以直接與半胱氨酸蛋白酶的活性中心進(jìn)行連接，使其催化活性受到破壞［34］。

圖4 HbCYS2基因在割膠及傷害處理下的表達(dá)模式

圖5 HbCYS2基因表達(dá)對(duì)不同激素的響應(yīng)

圖6 多主棒孢菌侵染后HbCYS2基因的表達(dá)模式

在橡膠樹(shù)中，乳管細(xì)胞是天然橡膠的合成場(chǎng)所，其胞質(zhì)（膠乳）是橡膠樹(shù)生產(chǎn)中的中重要防御組織。橡膠樹(shù)割膠是一種典型的傷害處理，同時(shí)也可以促進(jìn)膠乳再生與排膠，割膠應(yīng)答也是橡膠樹(shù)產(chǎn)膠潛力的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)［33］。本研究表達(dá)分析結(jié)果顯示，HbCYS2在膠乳中高表達(dá)，受割膠調(diào)控明顯，對(duì)傷害處理也產(chǎn)生一定的應(yīng)答。另外，膠乳中HbCYS2受多種激素調(diào)控，特別是橡膠樹(shù)產(chǎn)量調(diào)節(jié)劑ET，與割膠應(yīng)答模式相似。由此推測(cè)，膠乳高表達(dá)HbCYS2在膠乳再生，以及割膠傷害刺激中發(fā)揮一定的應(yīng)答調(diào)控作用。除此之外，葉片中HbCYS2對(duì)多主棒孢侵染產(chǎn)生明顯應(yīng)答，參與橡膠樹(shù)棒孢霉落葉病的防御或抵抗。

4 結(jié)論

本研究成功分離了橡膠樹(shù)半胱氨酸蛋白酶抑制劑HbCYS2，具有CYSII型的典型特征，該基因參與橡膠樹(shù)的膠乳再生調(diào)控和病害脅迫應(yīng)答過(guò)程，豐富了橡膠樹(shù)半胱氨酸蛋白酶抑制劑基因家族，為揭示蛋白酶抑制劑基因家族在橡膠樹(shù)生長(zhǎng)發(fā)育、生物與非生物脅迫中的作用提供相關(guān)信息。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

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為深入推進(jìn)農(nóng)業(yè)供給側(cè)結(jié)構(gòu)性改革，加強(qiáng)信息引領(lǐng)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展的能力，促進(jìn)農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)型升級(jí)，茲定于2017年4月20—21日在北京召開(kāi)“2017中國(guó)農(nóng)業(yè)展望大會(huì)”。大會(huì)由農(nóng)業(yè)部市場(chǎng)預(yù)警專家委員會(huì)支持，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)信息研究所主辦，農(nóng)業(yè)部信息中心、農(nóng)業(yè)部農(nóng)村經(jīng)濟(jì)研究中心、農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)貿(mào)易促進(jìn)中心等協(xié)辦。

一、大會(huì)主題

深入推進(jìn)農(nóng)業(yè)供給側(cè)結(jié)構(gòu)性改革，促進(jìn)農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)型升級(jí)。

二、大會(huì)內(nèi)容

主要內(nèi)容包括三個(gè)方面：一是發(fā)布未來(lái)10年中國(guó)農(nóng)業(yè)展望報(bào)告（2017—2026年），分析當(dāng)前市場(chǎng)形勢(shì)，展望未來(lái)市場(chǎng)走勢(shì)。二是開(kāi)展水稻、小麥、玉米、大豆、油料、糖料、棉花、肉類、禽蛋、奶制品、蔬菜、水果、飼料等18個(gè)農(nóng)產(chǎn)品品種的專題交流。三是進(jìn)行“三農(nóng)”熱點(diǎn)專題研討，就農(nóng)業(yè)供給側(cè)結(jié)構(gòu)性改革、“互聯(lián)網(wǎng)+”現(xiàn)代農(nóng)業(yè)、大數(shù)據(jù)與農(nóng)業(yè)監(jiān)測(cè)預(yù)警、農(nóng)業(yè)資源環(huán)境、農(nóng)村金融與保險(xiǎn)、國(guó)際農(nóng)產(chǎn)品貿(mào)易等主題進(jìn)行專題報(bào)告。

三、參會(huì)人員

農(nóng)業(yè)部等國(guó)家部委相關(guān)部門領(lǐng)導(dǎo)，各?。ㄖ陛犑?、自治區(qū)）農(nóng)業(yè)主管部門領(lǐng)導(dǎo)；農(nóng)業(yè)市場(chǎng)全產(chǎn)業(yè)鏈信息分析人員；相關(guān)科研機(jī)構(gòu)及高等院校從事農(nóng)業(yè)監(jiān)測(cè)預(yù)警、農(nóng)業(yè)展望、經(jīng)濟(jì)分析和信息分析的相關(guān)專家與學(xué)者；家庭農(nóng)場(chǎng)、農(nóng)業(yè)合作社、農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)化龍頭企業(yè)等新型農(nóng)業(yè)經(jīng)營(yíng)主體代表，行業(yè)協(xié)會(huì)、涉農(nóng)企業(yè)、咨詢機(jī)構(gòu)人員；涉農(nóng)金融證券、期貨從業(yè)人員；國(guó)際組織及相關(guān)國(guó)家的農(nóng)業(yè)專家、駐華機(jī)構(gòu)代表等。

四、大會(huì)時(shí)間與地點(diǎn)

大會(huì)時(shí)間：2017年4月20（星期四）—21日（星期五），會(huì)期2天。

大會(huì)地點(diǎn)：北京國(guó)際會(huì)議中心（北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰東路8號(hào)）

報(bào)到地點(diǎn)： 4月19日（星期三）全天，在北京五洲大酒店住宿的代表在該酒店一層大廳報(bào)到（北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰東路 8號(hào)），在亞運(yùn)村賓館住宿的代表在該賓館一層大廳報(bào)到（北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰東路 8號(hào)）；4月20日（星期四）上午7:00-9:00，在北京國(guó)際會(huì)議中心一層大廳報(bào)到。

五、食宿安排及大會(huì)注冊(cè)

會(huì)議代表可由大會(huì)統(tǒng)一安排食宿（北京五洲大酒店和亞運(yùn)村賓館），費(fèi)用自理。會(huì)議收取注冊(cè)費(fèi)，每人1600元。本次大會(huì)實(shí)行會(huì)議注冊(cè)制度，參會(huì)人員可通過(guò)電子郵箱、傳真、網(wǎng)站在線注冊(cè)、手機(jī)注冊(cè)等方式進(jìn)行報(bào)名，注冊(cè)截止日期2017年3月24日。會(huì)議信息敬請(qǐng)關(guān)注大會(huì)網(wǎng)站。

六、聯(lián)系方式

聯(lián) 系 人： 李干瓊，010-82109762，13718689362王盛威，010-82105200，15811088766

傳 真：010-82109660

電子郵箱：aoc@caas.cn

會(huì)議網(wǎng)站：http://aii.caas.net.cn/aoc/index.html

會(huì)議微信公眾號(hào)：中國(guó)農(nóng)業(yè)監(jiān)測(cè)預(yù)警

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)信息研究所

二○一七年二月二十四日

Cloning and Expression Analysis of Cystatin（HbCYS2）from Para Rubber Tree（Hevea brasiliensis）

LONG Xiang-yu LIANG Qi-fu QI Ji-yan Fang Yong-jun TANG Chao-rong
（Rubber Research Institute，CATAS，Danzhou 571737）

In plant，the cystatin（CYS）is widely involved in growth and development，and responses to biotic and abiotic stresses. In this study，the HbCYS2 is isolated from rubber tree，and has open reading frame（687 bp）encoding a protein of 288 aa. The HbCYS2 is a secreted protein with signal peptide，and has two CYS domains. The bioinformatics analysis indicates that the HbCYS2 is belonged to CYS II（GeneBank：KX161925）. The expression analysis indicated that the HbCYS2 has high level expression in latex，and similar expression pattern responding to tapping and ET treatment. In addition，the expression of HbCYS2 is apparently regulated by Corynespora inoculation in leaf. It is speculated that the HbCYS2 plays an important role in latex regeneration，tapping treatment and disease resistance in rubber tree.

Hevea brasiliensis；cystatin；latex regeneration；stress response

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.03.013

2016-07-18

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31300570），海南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（314141），中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠所基本科研項(xiàng)目（1630022016006-01）

龍翔宇，男，博士，研究方向：橡膠樹(shù)產(chǎn)膠生物學(xué)；E-mail：yuxianglong006@163.com

唐朝榮，男，博士，研究方向：橡膠樹(shù)產(chǎn)膠生物學(xué)；E-mail：chaorongtang@126.com